專利名稱：一種微小rna在預(yù)防和/或治療心臟疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域及心臟疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域，涉及一種外源性的非編碼小RNAs的新用途，具體涉及一種微小RNA(microRN A, miRNA)在預(yù)防和/或治療心臟疾病中的用途。
背景技術(shù)：
目前，心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬(wàn)人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國(guó)，隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已超過(guò)癌癥成為第一大致死原因。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部2004年底公布的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，我國(guó)18歲及以上居民高血壓患病率為18.8%，估計(jì)全國(guó)患病人數(shù)超過(guò)I. 6億，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病以及心力衰竭等凋亡相關(guān)心臟疾病的病人達(dá)幾千萬(wàn)。 目前關(guān)于心臟疾病發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，心臟疾病的預(yù)防、診斷和治療尚不能達(dá)到讓人滿意的效果，急需開(kāi)發(fā)新的技術(shù)、方法用于心臟病的診斷、預(yù)防和治療。miRNA是新近研究發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子。許多研究表明，miRNA對(duì)于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達(dá)與許多心臟疾病的發(fā)生相關(guān)。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)相關(guān)藥物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、由基因控制及一系列酶參與的過(guò)程，對(duì)正常胚胎發(fā)育，維持細(xì)胞群體及惡性病變過(guò)程中均起重要作用，在保證多細(xì)胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態(tài)下，如心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭等，心肌細(xì)胞都會(huì)發(fā)生凋亡。由于成熟的心肌細(xì)胞不能分裂增殖，心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡必然會(huì)使心肌細(xì)胞數(shù)目減少，這一點(diǎn)可能是一些心臟疾病發(fā)病的機(jī)理。鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)在心肌梗死及心肌肥厚等心臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抑制calcineurin的表達(dá)或活性在預(yù)防、治療這些心臟疾病中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)靶蛋白的表達(dá)而參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。開(kāi)發(fā)以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、預(yù)防和治療具有極其重要的意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)針對(duì)鈣調(diào)磷酸酶催化亞基mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)的微小RNA (miRNA)，將其命名為miRNA-4pp，它具有抑制鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)的作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-4pp能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，并且確定了其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關(guān)鍵作用，目的是將其應(yīng)用到這些心臟疾病的預(yù)防及治療中。
本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種微小RNA在制備用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物中的用途，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5，-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3，。優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO : I序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5， -UUAAGACUGCCUAAUUCA⑶UU-3，。 優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等。其中納米顆粒是一種人工制造的、大小不超過(guò)100納米的微型顆粒，可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。優(yōu)選地，所述藥物組合物的給藥方式為口服給藥或注射給藥；更優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射和心肌注射。再一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。綜上所述，本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明miRNA_4pp在心肌缺血損傷及心肌細(xì)胞凋亡中的變化及其心肌保護(hù)作用。具體地，本發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-4pp具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的功能。通過(guò)合成miRNA-4pp模擬物,加強(qiáng)miRNA_4pp的表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞凋亡。小鼠尾靜脈注射miR-4pp可以減輕缺血再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡，減小心肌梗死面積，可改善缺血再灌注損傷所致的心功能失調(diào)，檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末壓(LVEDP)，左室壓力上升和下降最大變化速率(±dp/dt max)和LVEF(左室射血分?jǐn)?shù))。給予miRNA_4pp還能改善缺血再灌注損傷所致的心臟重塑，包括降低心重體重比，邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)并改善心功能。miRNA_4pp通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用，miRNA-4pp對(duì)許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值。由此可見(jiàn)，本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-4pp (5’ -UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3，)通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用。過(guò)表達(dá)miRNA-4pp，可以抵抗心肌缺血再灌注損傷，心肌梗死面積減少，心功能顯著改善、心肌纖維化及心臟結(jié)構(gòu)重塑均在一定程度上被抑制。將miRNA-4pp模擬物或與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成藥物，導(dǎo)入心臟或體內(nèi)，對(duì)許多心臟疾病將具有預(yù)防及治療作用。發(fā)明人通過(guò)合成miRNA-4pp模擬物從小鼠尾靜脈注射給藥，發(fā)現(xiàn)心肌缺血損傷程度明顯被抑制，在動(dòng)物模型證明了 miRNA-4pp對(duì)缺血性心臟病的治療作用。因此，本發(fā)明提供了將miRNA-4pp與適當(dāng)載體或輔料如殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等包裝形成藥物，通過(guò)口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射或直接心肌注射的方式，用于預(yù)防和/或治療心臟疾病、改善心臟功能、阻止心肌纖維化及心肌重構(gòu)的發(fā)生。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I為過(guò)表達(dá)miRNA_4pp對(duì)缺氧誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡的影響；其中，圖IA為miRNA-4pp模擬物(圖中以miRNA_4pp表示)轉(zhuǎn)染原代心肌表達(dá)水平檢測(cè)，miR-NC為作為陰性對(duì)照；圖IB為原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-4pp模擬物對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，miR-NC為作為陰性對(duì)照；圖2為過(guò)表達(dá)miRNA_4pp對(duì)心肌缺血損傷的抵抗作用；其中，圖2A為小鼠尾靜脈注射miRNA-4pp模擬物(圖中以miRNA_4pp表示)后檢測(cè)心肌組織miRNA_4pp表達(dá)水平，其中miR-NC作為陰性對(duì)照；圖2B為過(guò)表達(dá)miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的比較，以假手術(shù)處理的小鼠作為對(duì)照；其中圖2C為過(guò)表達(dá)miRNA-4pp 小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積比較，其中的1、2、3、4分別表示每組試驗(yàn)的心肌梗死的表觀圖。圖3為過(guò)表達(dá)miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后24小時(shí)心功能狀況比較；圖3A檢測(cè)為L(zhǎng)VEDP(左室舒張末壓)的比較結(jié)果，圖3B為檢測(cè)±dp/dt max(左室壓力上升和下降最大變化速率)的比較結(jié)果，圖3C為檢測(cè)LVEF (左室射血分?jǐn)?shù))的比較結(jié)果，均以假手術(shù)處理的小鼠作為對(duì)照。圖4為過(guò)表達(dá)miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后2周心臟重塑、心肌纖維化及心功能比較；其中圖4A為心重體重比比較；圖48為麥胚凝集素(WGA)染色比較心肌細(xì)胞橫截面面積；圖4C為Masson染色比較心肌纖維化程度；圖4D為心功能狀況比較，檢測(cè)指標(biāo)包括左室收縮內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張內(nèi)徑(LVIDd)、短軸縮短率(FS)，均以假手術(shù)處理的小鼠作為對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非特別說(shuō)明，以下各實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；提取總RNA使用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-4pp的表達(dá)水平的方法參見(jiàn) Chen, C. , et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loopRT-PCR. Nucleic Acids Res 33，el79，2005。miRNA_4pp 模擬物的序列為 SEQ ID NO :1:5’ -UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’，由上海吉瑪公司合成。實(shí)施例lmiRNA_4DD抑制心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例中以原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為模型，檢測(cè)miRNA_4pp是否能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡。對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑓⒄瘴墨I(xiàn)Tan，ff. Q.，Wang, K.，Lv, D. Y. &Li，
P. F. Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through TransactivatingCatalase. J Biol Chem 283，29730-29739 (2008)中記載的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞。原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-4pp模擬物以過(guò)表達(dá)miRNA_4pp，同時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-NC作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體(購(gòu)自Invitrogen公司)，miRNA-4pp及miRNA-NC終濃度為150nM。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，在低氧培養(yǎng)箱(氧含量小于I %)中培養(yǎng)處理細(xì)胞24小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-4pp的表達(dá)水平。臺(tái)盼蘭染色方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，具體方法如下臺(tái)盼藍(lán)的使用濃度為O. 4%，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化成單個(gè)分離的細(xì)胞，連同上清一起收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌，加適量臺(tái)盼藍(lán)混勻染色，光鏡下任意選取4-5個(gè)視野計(jì)數(shù)，每組計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)約200個(gè)，計(jì)算被染成藍(lán)色的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例，就可估算細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA_4pp后，miRNA_4pp表達(dá)水平顯著上升，見(jiàn)圖IA0過(guò)表達(dá)miRNA-4pp可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果見(jiàn)圖1B。 實(shí)施例2miRNA-4DD過(guò)表達(dá)抑制心肌缺血損傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本實(shí)施例驗(yàn)證了 miRNA_4pp過(guò)表達(dá)是否能夠抑制心肌缺血損傷。I.小鼠經(jīng)尾靜脈注射miRNA_4pp模擬物可顯著抑制心肌缺血再灌注損傷以C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照如下方法注射miRNA-4pp模擬物或miRNA-NC 小鼠尾靜脈20mg/kg注射miR_4pp模擬物或陰性對(duì)照miRNA-NC。模擬物注射3天后，進(jìn)行心臟缺血再灌注手術(shù)，并以假手術(shù)處理的小鼠作為對(duì)照，具體操作如下小鼠麻醉后，背位固定于實(shí)驗(yàn)用木板上，并進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)。頸部正中切開(kāi)氣管并插管，連動(dòng)物人工呼吸機(jī)，于第四肋間開(kāi)胸，小心提起心包并剪開(kāi)，充分暴露心臟、血管。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下方2_處進(jìn)針，進(jìn)針深度O. 5mm ;以6/0帶針縫合線穿過(guò)心肌表層，在肺動(dòng)脈圓椎旁出針；待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定IOmin后，予以結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。以I、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高大于O. Imv并持續(xù)O. 5小時(shí)以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。缺血45min之后，松開(kāi)結(jié)扎線開(kāi)始再灌注。以ST段下降為標(biāo)志。清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔。再灌注3小時(shí)，進(jìn)行TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。再灌注24小時(shí)，用Evans blue/TTC雙染測(cè)定心肌梗死面積。具體方法如下心肌缺血再灌注模型建立24小時(shí)后，重新結(jié)扎左前降支，注射2 %伊文斯藍(lán)(Evans blue),取出心臟,用生理鹽水洗去血液后,稱取全心重和心室重量,沿著垂直于左室長(zhǎng)軸的方向?qū)⒆笮氖覚M切成5片切片，置于37°C。I %氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸緩沖液中染色15min，數(shù)碼相機(jī)記錄每片心肌的情況，剪去各心肌片被染色的非梗塞區(qū)，把未染色梗塞區(qū)的心肌稱重，除以全心重或心室重分別得到梗塞范圍占全心重或占心室重的百分率，此即心肌梗塞面積。心梗面積按如下方法計(jì)算左心室面積(left ventricle, LV)為藍(lán)色、紅色和白色面積之和；危險(xiǎn)區(qū)總面積(area at risk, AAR)為紅色和白色面積之和；梗死區(qū)面積(infarct area, INF)為白色面積。危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR/LV, % )=(危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室面積)X 100% ;心梗面積(INF/AAR，% )=(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積)X 100%。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了心肌組織中miRNA_4pp表達(dá)水平，結(jié)果顯示，注射miR_4pp模擬物的小鼠缺血/再灌注(I/R)組心肌組織比miRNA-NC小鼠I/R組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖3B)，心肌梗死面積明顯減少(圖3C)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < O. 01)。實(shí)施例3miRNA_4pp過(guò)表達(dá)小鼠在心肌缺血再灌注中具有改善心功能的作用。參照實(shí)施例2的方法,對(duì)miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠實(shí)行缺血再灌注手術(shù)，并以假手術(shù)處理的小鼠作為對(duì)照，缺血45分鐘再灌注24小時(shí)，采用Millar導(dǎo)管閉胸式經(jīng)頸動(dòng)脈插管法(SPR-839, Millar Instrument, Houston, Texas)對(duì) miRNA_4pp 小鼠(η=8)和miRNA-NC小鼠(η = 8)進(jìn)行心功能監(jiān)測(cè),檢測(cè)方法參見(jiàn)Yan Feng, et al. Innateimmune adaptor MyD88mediates neutrophil recruitment and myocardial injury afterischemia-reperfusion in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol.2008September ；295(3) :H1311-H1318。檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末壓(LVEDP)，左室壓力上升和下降最大變化速率(土 dp/dt max)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。結(jié)果顯示，與對(duì)照小鼠I/R相比，miR-4pp過(guò)表達(dá)小鼠I/R的LVEDP顯著降低，±dp/dt max與LVEF均明顯升高,說(shuō)明miRNA_4pp過(guò)表達(dá)具有改善心功能的作用(圖3)。·實(shí)施例4miRNA-4DD過(guò)表達(dá)改善心功能，阻止心臟結(jié)構(gòu)重塑、心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證參照實(shí)施例2的方法，對(duì)miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠進(jìn)行心肌缺血再灌注手術(shù)，并以假手術(shù)處理的小鼠作為對(duì)照。缺血再灌注兩周取心臟進(jìn)行WGA及Masson染色，分別用來(lái)觀察小鼠心肌細(xì)胞橫截面積大小及纖維化程度。具體方法參見(jiàn)Lin, Z. , et al. miR-23a functionsdownstream of NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U SA106，12103-12108 (2009)和 Dolber，P. C.，Bauman，R. P.，Rembert, J. C. &Greenf ield,J. C.，Jr. Regional changes in myocyte structure in model of canine right atrialhypertrophy. Am J Physiol267，H1279-1287 (1994) 結(jié)果如圖4所示，表明與miRNA-NC小鼠I/R組相比，miR-4pp過(guò)表達(dá)小鼠I/R組的心重/體重比(圖4A)、橫截面積(圖4B)與膠原面積(圖4C)都顯著下降，說(shuō)明miRNA-4pp可以阻止心臟結(jié)構(gòu)重塑、心肌纖維化。同時(shí)miRNA-4pp小鼠心功能也得到顯著改善(圖4D)。
權(quán)利要求
1.一種微小RNA在制備用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物中的用途，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO : I序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5， -UUAAGACUGCCUAAUUCA⑶UU-3，。
2.根據(jù)要求I所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。
3.一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5， -UUAAGACUGCCUAAUUCA⑶UU-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物以口服或注射的方式給藥；優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射和心肌注射。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防、治療心臟疾病的藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心肌肥厚和心肌纖維化。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小RNA在預(yù)防和/或治療心臟疾病中的用途。本發(fā)明提供的微小RNA為包含以下SEQ ID NO1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’。該微小RNA可以作為一種新型的藥物組合物用于心臟疾病的預(yù)防和/或治療。
文檔編號(hào)A61P9/04GK102895671SQ20111021699
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者李培峰, 王建勛, 焦建琴, 李倩, 龍波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所