專利名稱：人類潛在新細(xì)胞因子tmem98及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病的診斷及治療領(lǐng)域，特別涉及人類潛在細(xì)胞因子TMEM98在免疫相關(guān)疾病(例如炎癥)以及腫瘤中的診斷和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人體免疫系統(tǒng)歷經(jīng)30億年的進(jìn)化，形成復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)，在機(jī)體具有至關(guān)重要的作用。它對(duì)外能夠防御病原微生物的入侵，對(duì)內(nèi)則能清除衰老、病變和死亡的細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)通過固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答完成上述功能。固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，主要包括單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)等,在機(jī)體早期抗感染過程中發(fā)揮重要作用，并能夠啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，影響其應(yīng)答類型。適應(yīng)性免疫應(yīng)答是指抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞分別通過TCR和 BCR識(shí)別抗原、活化、增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的過程，包括T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子是由機(jī)體各種細(xì)胞分泌的具有調(diào)控細(xì)胞生長分化、調(diào)節(jié)免疫功能和生理反應(yīng)并參與病理反應(yīng)的小分子蛋白質(zhì)，通過與受體結(jié)合發(fā)揮作用。細(xì)胞因子主要包括白細(xì)胞介素(Interleukin, IL)、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor, CSF)、干擾素(Interferon, IFN)、腫瘤壞死因子(Tumor-Necrosis Factor, TNF)等，是免疫細(xì)胞之間的交流語言，對(duì)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。CD4+T細(xì)胞主要包括Thl、Th2、Thl7以及Treg等，其中Thl和Th2是最早發(fā)現(xiàn)的兩類細(xì)胞，Thl細(xì)胞主要分泌IFN- Y、IL-2.LT α等，通過細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗病毒、抗胞內(nèi)病原體感染、抗腫瘤、遲發(fā)型超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，通過輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體參與體液免疫應(yīng)答。Thl7主要分泌IL-17A、IL-21、IL-17F、IL-22等，在抗胞外細(xì)菌和真菌感染中具有重要作用，并參與炎性腸病等自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展。iTreg主要分泌TGF-β、IL-35、IL-10，在免疫耐受、淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要功能。多種細(xì)胞因子參與了 Thl、Th2細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)。如IL-12、IL_4分別是決定Thl、Th2分化所必需的細(xì)胞因子。其次，細(xì)胞因子對(duì)已分化的CD4+T細(xì)胞也具有調(diào)控作用，如IL-12與IL-18能夠以TCR非依賴的方式協(xié)同促進(jìn)Thl細(xì)胞產(chǎn)生IFN- Y。此外，細(xì)胞因子還是Th細(xì)胞發(fā)揮作用的主要方式，Thl、Th2細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子分別是IFN- Y、IL-4。深入研究Thl、Th2細(xì)胞的分化、生理和病理功能以及調(diào)控機(jī)制及兩者之間的平衡具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生過程中亦發(fā)揮重要功能。目前已有多種細(xì)胞因子藥物應(yīng)用于臨床腫瘤治療。IFN-α和IL-2是FDA批準(zhǔn)的用于腫瘤治療的細(xì)胞因子。IL-2是第一個(gè)被證明具有腫瘤治療作用的細(xì)胞因子，其主要用于治療腎細(xì)胞癌和黑色素瘤，已經(jīng)成功上市。IL-2通過促進(jìn)細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖、活化而發(fā)揮抗腫瘤作用，IL-2不僅在腎細(xì)胞癌和黑色素瘤等免疫敏感的腫瘤中具有治療作用，在其它類型腫瘤中也發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，還有多種細(xì)胞因子的抗腫瘤研究處于臨床研究的不同階段，有望用于臨床腫瘤治療中。其中IL-12和IL-21是抗腫瘤研究中比較熱門的兩個(gè)細(xì)胞因子。因此，發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞因子并研究其功能和機(jī)制不僅有利于進(jìn)一步全面了解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，也將為其治療提供新的選擇。目前利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組細(xì)胞因子、可溶性受體以及抗細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體抗體等在治療腫瘤、造血障礙、感染等已收到良好療效。重組細(xì)胞因子作為藥物具有很多優(yōu)越之處，如細(xì)胞因子為人體自身成分，可調(diào)節(jié)機(jī)體的生理過程和免疫功能，很低劑量即可發(fā)揮作用，因而療效顯著，副作用小，是一種全新的生物制劑，已成為某些疑難病癥不可缺少的治療手段。目前已批準(zhǔn)生產(chǎn)的細(xì)胞因子藥物包括干擾素α、β、Y，EPO，GM-CSF, G-CSF, IL_2等。另外，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國際上至少已有26個(gè)基因組藥物進(jìn)入臨床研究，包括新的重組細(xì)胞因子、重組可溶性受體等。同時(shí)，細(xì)胞因子或者細(xì)胞表面受體檢測(cè)也是判斷機(jī)體免疫功能和免疫細(xì)胞分化的指標(biāo)，在許多疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細(xì)胞因子治療監(jiān)測(cè)等方面具有重要價(jià)值。2006年5月18日，Nature雜志公布了人類I號(hào)染色體的精細(xì)圖譜，標(biāo)志著人類基因組計(jì)劃的完成，生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)入功能基因組時(shí)代。從2008年開始，我們與國家人類 北方基因研究中心合作，利用免疫基因組學(xué)策略，通過生物信息學(xué)遴選、功能篩選和系統(tǒng)性功能研究發(fā)現(xiàn)了人類新基因TMEM98，其編碼一種非經(jīng)典分泌蛋白，并具有細(xì)胞膜定位形式；我們利用多肽免疫，制備了抗TMEM98的多克隆抗體，該抗體可以用于免疫沉淀、免疫熒光、Western blot和ELISA分析；TMEM98在活化的⑶4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在IL-I β刺激的Α549、LPS刺激的PBMC中表達(dá)上調(diào)，在單核細(xì)胞分化為DC后表達(dá)明顯上調(diào)；功能研究發(fā)現(xiàn)其編碼的分泌蛋白能促進(jìn)小鼠Thl細(xì)胞在體內(nèi)及體外的分化，能夠抑制前列腺癌細(xì)胞系DU145中⑶46、⑶59的表達(dá)，并且體內(nèi)功能研究發(fā)現(xiàn)人ΤΜΕΜ98原核蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤有抑制作用。因此，ΤΜΕΜ98真核及原核表達(dá)蛋白、抗體在炎癥、感染性疾病(尤其是抗胞內(nèi)細(xì)菌感染及抗病毒感染)、腫瘤的輔助診斷及治療方面具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于闡明人類ΤΜΕΜ98基因在炎癥細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)、分泌蛋白的N端切割位點(diǎn)及人ΤΜΕΜ98蛋白對(duì)炎癥、Thl細(xì)胞分化、IFN- Y水平、補(bǔ)體系統(tǒng)以及對(duì)小鼠黑色素瘤的影響。本發(fā)明還提供人ΤΜΕΜ98蛋白的檢測(cè)方法，及該蛋白在炎癥、感染性疾病(尤其是抗胞內(nèi)細(xì)菌感染及抗病毒感染)、腫瘤的輔助診斷及治療方面的應(yīng)用。本發(fā)明顯示，人類ΤΜΕΜ98在多種炎性因子刺激后表達(dá)上調(diào)，且其編碼的分泌蛋白能促進(jìn)小鼠Thl細(xì)胞在體內(nèi)及體外的分化，促進(jìn)IFN- Y的分泌，IFN- Y是促炎細(xì)胞因子，表明其能促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展，能夠作為炎癥治療的新靶點(diǎn)用于炎癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?。人ΤΜΕ?8編碼一種非經(jīng)典分泌蛋白，同時(shí)具有細(xì)胞膜定位形式和細(xì)胞外分泌形式；體內(nèi)及體外功能研究發(fā)現(xiàn)其在活化的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其編碼的分泌蛋白可以抑制補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46和CD59的表達(dá)；體內(nèi)功能研究發(fā)現(xiàn)人ΤΜΕΜ98原核蛋白還對(duì)小鼠黑色素瘤有抑制作用。由于Thl通過細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗病毒、抗胞內(nèi)病原體感染以及抗腫瘤、引發(fā)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要功能，并參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展，而IFN-Y對(duì)于某些過敏性疾病、自身免疫性疾病、細(xì)菌真菌感染疾病、病毒性感染疾病、寄生蟲感染、纖維化作用和腫瘤具有抑制和治療效果，抑制CD46和CD59蛋白的表達(dá)可以使補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，這說明人TMEM98在炎癥、感染性疾病(尤其是抗胞內(nèi)細(xì)菌感染及抗病毒感染)、腫瘤、纖維化作用、過敏性疾病和自身免疫疾病的輔助診斷及治療方面的應(yīng)用。除非特別注明，為了便于區(qū)別，在本說明書中(而非權(quán)利要求書中)用全部字母都大寫的TMEM98表示人類TMEM98，僅首字母大寫的Tmem98表示小鼠Tmem98。


圖I所示為TMEM98多克隆抗體的鑒定。其中，圖I的A為用Western blot的方法檢測(cè)TMEM98多克隆抗體對(duì)超表達(dá)人TMEM98的293T細(xì)胞裂解液中蛋白的識(shí)別能力。由于人與小鼠第一段、第二段多肽的氨基酸序列一致，圖I的B所示為用Western blot的方法檢測(cè)針對(duì)TMEM98第一段、第二段多肽的多克隆抗體對(duì)超表達(dá)小鼠Tmem98的293T細(xì)胞裂解液中蛋白的識(shí)別能力。圖I的C所示為在超表達(dá)TMEM98的293T細(xì)胞上清中加入TMEM98 針對(duì)第一段多肽的多克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀，之后用Western blot方法分別檢測(cè)未加抗體組上清及抗體免疫共沉淀之后上清中的人TMEM98蛋白量的情況。圖中標(biāo)注34kDa為蛋白marker，以明確目的蛋白在圖中位置。圖I的D所示為用純TMEM98蛋白作為抗原，針對(duì)第一段多肽的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記抗兔IgG作為二抗所做的間接免疫熒光，來鑒定針對(duì)第一段、第二段多肽的多克隆抗體的特異性及親和力。并用此方法以超表達(dá)PcDB及人TMEM98的293T細(xì)胞上清為包被抗原檢測(cè)其中人TMEM98蛋白含量。圖2所示為TMEM98表達(dá)譜分析的結(jié)果。其中，圖2的A所示為TMEM98在Clontech公司制備的人正常組織及免疫器官cDNA文庫中的表達(dá)情況。圖2的B所示為TMEM98在各個(gè)免疫細(xì)胞系中的表達(dá)情況分析。圖2的C所示為TMEM98在構(gòu)建的3種細(xì)胞炎癥模型中(包括LPS刺激的PBMC、IL-I β刺激的Α549、LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。圖2的D左圖所示為用流式分析在抗人⑶3/⑶28刺激的PBMC中⑶4陽性的細(xì)胞亞群中ΤΜΕΜ98的蛋白水平表達(dá)情況；右圖所示為ΤΜΕΜ98在PBMC、單核細(xì)胞(monocyte)、未成熟的DC細(xì)胞(imDC) >Zymosan刺激成熟的DC細(xì)胞(mDC-zymosan)及LPS刺激成熟的DC細(xì)胞(mDC-LPS)中的mRNA水平表達(dá)情況。圖3所示為TMEM98的亞細(xì)胞定位分析。其中，圖3的A所示為用Confocal的方法分析TMEM98在293T細(xì)胞中的定位情況。分別包括用帶GFP標(biāo)簽的TMEM98真核表達(dá)質(zhì)粒，及用抗TMEM98第一段多肽的多克隆抗體所做的間接免疫熒光。用Hochest染細(xì)胞核。圖3的B所示為用抗TMEM98第一段多肽的多克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光，用流式的方法檢測(cè)TMEM98在細(xì)胞膜定位情況。IgG為陰性對(duì)照,抗c_myc抗體為陽性對(duì)照。圖4所示為TMEM98分泌驗(yàn)證、真核蛋白鑒定。其中，圖4的A所示為用Westernblot的方法檢測(cè)超表達(dá)pcDB和TMEM98的293T細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液中TMEM98蛋白表達(dá)情況，及加入經(jīng)典分泌蛋白抑制劑BFA后293T細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液中TMEM98蛋白表達(dá)情況，右圖所示為選用一經(jīng)典分泌蛋白作為陽性對(duì)照。β-actin作為內(nèi)參。圖4的B所示為表達(dá)純化的用于后續(xù)功能試驗(yàn)的TMEM98真核蛋白(見28kDa附近條帶)的PAGE圖。圖5所示為表達(dá)純化的用于后續(xù)功能試驗(yàn)的人TMEM98原核蛋白的PAGE圖。圖中標(biāo)注23. IkDa為去除GST標(biāo)簽的人TMEM98原核蛋白實(shí)際分子量大小。
圖6所示為在DU145細(xì)胞(ATCC)中分別加入人TMEM98真核及原核蛋白后用流式檢測(cè)細(xì)胞膜表面⑶46及⑶59的蛋白水平表達(dá)變化情況。其中⑶59表達(dá)變化情況選用IFN- Y作為陽性對(duì)照。圖中Counts表示細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖7所示為人TMEM98真核表達(dá)蛋白在小鼠Thl細(xì)胞體外分化中的作用。其中圖7的A左圖所示為用流式的方法檢測(cè)加入不同濃度人TMEM98蛋白后Thl細(xì)胞IFN- Y表達(dá)情況；右圖所示為用ELISA方法檢測(cè)加入不同濃度人TMEM98蛋白后Thl細(xì)胞IFN- Y表達(dá)情況。圖7的B所示為在分化過程中不加入小鼠IL-12情況下加入不同濃度的人TMEM98蛋白后用流式的方法檢測(cè)IFN-Y的表達(dá)變化情況；右圖所示為用ELISA的方法檢測(cè)IFN-Y表達(dá)變化情況的結(jié)果。圖8所示為人TMEM98原核蛋白在小鼠DTH模型中的作用。其中，圖8的A所示為mBSA激發(fā)后24、48、72小時(shí)小鼠足墊腫脹情況,橫坐標(biāo)軸表示時(shí)間點(diǎn)(timepoint),并選用GST標(biāo)簽蛋白作為陰性對(duì)照。圖8的B所示為用ELISA的方法檢測(cè)小鼠血清(左圖)以及體外加入mBSA的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN- Y的分泌情況。圖8的C所示為分離小鼠脾細(xì)胞之后用流式的方法對(duì)其中CD8陽性細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。 圖9所示為人TMEM98原核蛋白在小鼠黑色素瘤模型中的作用。處理小鼠后取出腫瘤觀察其重量(左圖)、體積(右圖)的變化情況。其中，右圖中的標(biāo)尺刻度表示腫瘤大小，右圖所示分別為PBS處理后及TMEM98處理后小鼠體內(nèi)的黑色素瘤。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例材料與方法I生物信息學(xué)分析使用TMHMM(http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜區(qū)分木斤SiRnalP(http://www. cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/)用于信號(hào)妝分析；GNFSymAtlas (http: //symatlas. Rnf. orR/SymAtlas/)用于表達(dá)譜分析；使用 DNAstar 軟件分析蛋白質(zhì)抗原性、親疏水性、表面暴露性等。2基因的cDNA的克隆2. I 人 TMEM98 基因的 cDNA 克隆通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)UniGene Hs. 3447，其對(duì)應(yīng)基因?yàn)門MEM98，GeneID 26022,有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄剪接體(transcript variantl和transcript variant2),編碼蛋白序列相同。為一未知功能人類新基因，利用Human est數(shù)據(jù)庫通過BLASTn方法進(jìn)行序列校正無誤，然后根據(jù)RefSeq匪015544設(shè)計(jì)人TMEM98基因全長閱讀框架的巢式特異引物外側(cè)正向引物5 ’ -TTGCCACTTCCAGCAGCTTTAGC-3 ’外側(cè)反向引物5 ’ -CAGCCGTGGAGAACAACTAACTCTA-3 ’內(nèi)側(cè)正向引物5 ’ -GCGGCCGCCACCATGGAGACTGTGGTGATTGTTGC-3 ’內(nèi)側(cè)反向引物 5 ’ -GGTACCGCAATTGCAGACTGCTCCTGCAG-3 ’用上述引物，以正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) cDNA文庫為模板進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下反應(yīng)體積50 μ I，其中含有
正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) cDNA模板5μ1 (5ng)
引物外側(cè)正向引物、反向引物終濃度各0.2 μΜ
dNTP終濃度各200 μΜ
Taq DNA 聚合酶2.5U
IOxTaq DNA聚合酶緩沖液5 μ 用雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 體積反應(yīng)條件(touchdown,巢式PCR)94°C，變性5分鐘；然后94°C變性30秒，65°C 60°C逐步退火，10循環(huán)，72°C延伸I分鐘；最后60°C退火25循環(huán)，最后在72°C下延伸10分鐘?！獢U(kuò)產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，條件如下反應(yīng)體積50 μ I，其中含有
一擴(kuò)產(chǎn)物稀釋50倍5μ1 (5ng)
引物內(nèi)側(cè)正向引物、反向引物終濃度各0.2 μΜ
dNTP終濃度各200 μΜ
Taq DNA 聚合酶2.5U
IOxTaq DNA聚合酶緩沖液5 μ
用雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 體積反應(yīng)條件(touchdown,巢式PCR)94°C，變性5分鐘；然后94°C變性30秒，65°C 60°C逐步退火，10循環(huán)，72°C延伸I分鐘；最后60°C退火25循環(huán)，最后在72°C下延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為3’有堿基A的3’突出粘端片段，用QIAquick膠回收試劑盒(Qiagen，28706)按產(chǎn)品說明書進(jìn)行純化，然后與3’有堿基T的線性pGEM-T EASY載體(Promega，A1360)在16°C下連接8小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選克隆，提取質(zhì)粒，使用AbI PRISM3700DNA分析儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)測(cè)序。2. 2小鼠Tmem98基因的cDNA克隆根據(jù)小鼠同源基因Tmem98 (UniGene Mm. 27682，GeneID :26022)的 RefSeq 序列NM_015544設(shè)計(jì)編碼區(qū)(ORF)巢式PCR引物，如下外側(cè)正向引物5 ’ -TGCAATTGAGCTTCCACCTG-3 ’外側(cè)反向引物5 ’ -GGCCGACAGAGCTCTAGAGAAC-3，內(nèi)側(cè)正向引物5 ’ -CCGGAATTCCACCATGGAGACTGTGGTGATCGTC-3 ’內(nèi)側(cè)反向引物5 ’ -CGGGGTACCTTAAATGGCCGACTGTTCCTGC-3 ’內(nèi)側(cè)反向引物(myc-his)5’ -CGGGGTACCGA AATGGCCGACTGTTCCTGCAG-3’用上述引物，以正常小鼠組織器官cDNA文庫為模板進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下反應(yīng)體積50 μ 1，其中含有
小鼠組織器官cDNA模板5μ (5ng)
引物外側(cè)正向引物、反向引物終濃度各0.2 μΜ
dNTP終濃度各200μΜ
Taq DNA 聚合酶2.5U
IOxTaq DNA聚合酶緩沖液5 μ
用雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 體積
反應(yīng)條件(touchdown,巢式PCR)94°C，變性5分鐘；然后94°C變性30秒，63°C 58°C逐步退火，10循環(huán)，72°C延伸I分鐘；最后58°C退火25循環(huán)，最后在72°C下延伸10分鐘。一擴(kuò)產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，條件如下反應(yīng)體積50 μ I，其中含有
一擴(kuò)產(chǎn)物稀釋50倍5μ1 (5ng)
引物內(nèi)側(cè)正向引物、反向引物終濃度各0.2 μΜ
dNTP終濃度各200 μΜ
Taq DNA 聚合酶2.5U
IOxTaq DNA聚合酶緩沖液5 μ
用雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 體積反應(yīng)條件(touchdown,巢式PCR)94°C，變性5分鐘；然后94°C變性30秒，63°C 58°C逐步退火，10循環(huán)，72°C延伸I分鐘；最后58°C退火25循環(huán)，最后在72°C下延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為3’有堿基A的3’突出粘端片段，用QIAquick膠回收試劑盒(Qiagen，28706)按產(chǎn)品說明書進(jìn)行純化，然后與3’有堿基T的線性pGEM-T EASY載體(Promega，A1360)在16°C下連接8小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選克隆，提取質(zhì)粒，使用AbI PRISM3700DNA分析儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)測(cè)序。3 RNA 提取、RT-PCR 和 Real-time PCR收集未刺激及炎性因子IL-I β (購自R&D公司)刺激3h、6h、24h的A549 (ATCC)細(xì)胞，未刺激及炎性因子 LPS (Sigma)刺激6h 的 PBMC (peripheral blood mononuclear cell,外周血單個(gè)核細(xì)胞)(北京市紅十字血液中心提供)，未刺激及炎性因子LPS刺激2h、4h、6h的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(腹腔注射3%硫代乙醇酸鈉每只C57小鼠2ml，48小時(shí)后斷頸處死固定，向腹腔內(nèi)注射5mlPBS，輕柔腹腔后打開腹腔回收PBS，2000rpm，4°C離心獲取腹腔巨噬細(xì)胞)。使用 TRIzol 提取總 RNA,用 Reverse transcript kit (Fermentas)逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA文庫。4表達(dá)譜分析為了分析TMEM98在正常組織器官、免疫細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平及其在體外炎癥模型細(xì)胞中mRNA水平的變化情況，我們使用Clontech公司制備的人正常組織cDNA文庫以及制備的不同的免疫細(xì)胞系cDNA文庫和炎性因子刺激的A549、PBMC和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞cDNA文庫，用2中巢式PCR擴(kuò)增條件對(duì)人TMEM98進(jìn)行擴(kuò)增；使用小鼠5’引物(5，-TGCAATTGAGCTTCCACCTG-3’ )與 3’ 引物(5，-GGCCGACAGAGCTCTAGAGAAC-3’ )對(duì)小鼠Tmem98進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C (5分鐘)一94°C (30秒)，58°C (30秒)，72°C (30秒)，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)一720C (7 分鐘);使用 5’ 引物(5’ -TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’)與3’ 引物(5，-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’ )擴(kuò)增 GAPDH 作為內(nèi)參，擴(kuò)增條件為 94°C (5分鐘)—94°C (40 秒)，58°C (40 秒)，72°C (40 秒)，擴(kuò)增 20 個(gè)循環(huán)一72 °C (7 分鐘)。5真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 5. I真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. lB-TMEM98-myc_his的構(gòu)建為對(duì)人TMEM98進(jìn)行功能研究，首先構(gòu)建了含有人TMEM98 cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. lB-TMEM98-myc-his(pcDB-TMEM98-myc-his)。使用 Not I 和 Kpn I 酶切PGEM-T-TMEM98 (來源見實(shí)施例2. I)重組質(zhì)粒，回收目的基因片斷，并連接到經(jīng)過Not I和Kpn I處理的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-myc/his (-) B (Invitrogen, V85520),用測(cè)序方法對(duì)重組子進(jìn)行鑒定證實(shí)正確后，即得到pcDB-TMEM98-myc-his (帶有c_myc和his標(biāo)簽)重組質(zhì)粒。5. 2真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Nl-TMEM98的構(gòu)建用Not I和Kpn I分別酶切真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDB-TMEM98-myc_his與真核表達(dá)載體pEGFP-Nl (購自Clontech公司)，將酶切后的人TMEM98片段與載體在16°C下連接8小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化物在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選生長的菌落，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，挑選陽性克隆，通過測(cè)序(使用ABIPRISM 3700DNA分析儀，同上)，選出正確插入序列的克隆，命名為PEGFP-N1-TMEM98 (其C端帶有GFP標(biāo)簽)。5. 3真核細(xì)胞融合表達(dá)質(zhì)粒pYDll-TMEM98_hFc的構(gòu)建使用EcoRI，BamHI酶切TMEM98片段和pYDll載體(購自加拿大國家研究院生物技術(shù)研究所)，將片段與載體用膠回收試劑盒純化后，在16°C下連接8小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-I Blue，轉(zhuǎn)化物在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選生長的菌落，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，挑選陽性克隆，通過測(cè)序(同上)，pYDI l-TMEM98-hFc為C端帶有hFc標(biāo)簽的人TMEM98真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。5. 4 真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDB-Tmem98-myc-his 的構(gòu)建為了檢測(cè)小鼠Tmem98的體內(nèi)功能，首先分別構(gòu)建含有小鼠Tmem98 cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. lB-Tmem98-myc-his (pcDB-Tmem98-myc-his)及 pcDNA3. 1B-Tmem98 (不與Myc/His標(biāo)簽融合)。用EcoRI (TaKaRa)和Kpn I (TaKaRa)直接從重組質(zhì)粒pGEM-T-Tmem98 (fusion)(來源見實(shí)施例 2· 2)和 pGEM-T_Tmem98 (stop)(來源見實(shí)施例
2.2)載體酶切目的片斷，進(jìn)一步連接到經(jīng)EcoRI和KpnI酶切處理的pcDNA3. l/mycHis(-)B (Invitrogen, V85520)載體，對(duì)重組子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到pcDB-Tmem98-myc-his (帶有c-myc和his標(biāo)簽)和pcDB_Tmem98重組質(zhì)粒。6原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了進(jìn)行人TMEM98的功能研究，根據(jù)N端測(cè)序的結(jié)果我們構(gòu)建了含有人TMEM98cDNA的原核表達(dá)載體pGEX4T-3-TMEM98。用EcoRI/Sall酶切pGEX4T_3載體(購自GEHealthcare 公司)及 pcDNA3. lB-TMEM98-myc_his，之后連接得到 pGEX4T_3_TMEM98 原核表達(dá)質(zhì)粒。pGEX4T-3-TMEM98表達(dá)的重組蛋白為GST-TMEM98，即蛋白的N端帶有GST標(biāo)簽，而GST標(biāo)簽與人TMEM98目的蛋白之間有一個(gè)凝血酶的酶切位點(diǎn)，便于酶切與純化。7質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)中所用質(zhì)粒均使用QIAGEN Maxi (Endo Free)純化柱制備。小提純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl blue后涂至相應(yīng)抗性的細(xì)菌培養(yǎng)皿上，14-16小時(shí)后挑單細(xì)菌菌落于Iml抗性培養(yǎng)基中，37°C搖床(300轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)8小時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)體系至IOOmL,繼續(xù)培養(yǎng)14 16小時(shí)；6，OOOg離心10分鐘收獲細(xì)菌。加入IOml Pl (含O. 5mg/mL RNase)，充分重懸后加入IOml P2，翻轉(zhuǎn)4-6次，室溫孵育5分鐘，加入IOml 4°C預(yù)冷的P3，翻轉(zhuǎn)4_6次，將裂解液倒入濾筒，室溫10分鐘，收集濾過液，加入2. 5mlER,翻轉(zhuǎn)約10次混合，冰浴30分鐘；用IOml QBT預(yù)先平衡Qiagen純化柱，將上述裂解液過柱，用30ml QC洗滌純化柱，重復(fù)I次；加入15ml QN抽提質(zhì)粒，之后加入10. 5ml室溫異丙醇到抽提的DNA中并混合，4°C，15000g，離心30分鐘，小心棄上清；用5ml 70%室溫的去內(nèi)毒素乙醇洗滌DNA沉淀，15000g，離心30分鐘，小心棄上清，空氣干燥10分鐘后加入400 μ I的超純水，待沉淀完全溶解后移入EP管；紫外分光光度計(jì)定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，高速離心除菌并分裝備用。過程中所·用離心管等器皿均經(jīng)過去內(nèi)毒素處理。8重組真核細(xì)胞表達(dá)蛋白人ΤΜΕΜ98的表達(dá)純化在293Τ細(xì)胞中表達(dá)與純化人ΤΜΕΜ98分泌蛋白。將293Τ細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基鋪在IOcm培養(yǎng)皿中，在5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。使用Vigofect陽離子轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染目的基因pcDB-TMEM98-myc-hiS真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用常溫的I XPBS洗滌細(xì)胞一次，更換新鮮的無血清培養(yǎng)基(但含有低蛋白的培養(yǎng)細(xì)胞因子)，在5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，于4°C，800rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清的細(xì)胞，棄沉淀，再于4°C，12000g離心15分鐘，去除上清中的小顆粒物質(zhì)，留取處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清。用Ni2+柱料純化上述處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清先將上清經(jīng)過O. 45 μ m濾器過濾后，在上清中加入咪唑(5mM) /NaCl (200mM)，將上清裝入高壓過的液體瓶，采用輸液器使上清與柱料結(jié)合，以排除純化過程中內(nèi)毒素的污染，流速控制在10滴每分鐘，然后用平衡緩沖液咪唑(20mM)/NaCl (200mM) in I XPBS (ΡΗ7· 4)沖洗柱料，以洗去未結(jié)合的雜蛋白，至分光回至基線后，用洗脫液咪唑(500mM)/NaCl(200mM)in I XPBS (PH7. 4)洗脫結(jié)合蛋白，使用超濾管除鹽并將蛋白濃縮至500μ 1，吸出蛋白，于4°C，12000rpm離心20分鐘除菌，取上清分裝保存于_80°C待用，整個(gè)過程均在無菌密閉條件下完成。取5μ I蛋白用BCA方法對(duì)其進(jìn)行蛋白定量，用SDS-PAGE和鱟實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)純度和LPS的殘留情況，通常保證蛋白質(zhì)純度彡95%, LPS的殘留量< lEU/ug。9重組真核細(xì)胞表達(dá)蛋白TMEM98_hFc的表達(dá)純化用Vigofect陽離子轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染pYDll-TMEM98_hFc真核表達(dá)質(zhì)粒至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8小時(shí)后常溫PBS洗滌細(xì)胞，更換新鮮的無血清培養(yǎng)基，在5% CO2, 370C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清于無菌的新離心管中，于4°C，SOOrpm離心10分鐘，去除細(xì)胞，4°C,12000g離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片，取處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用Protein G柱進(jìn)行目的蛋白純化先將上清經(jīng)過O. 2 μ m濾器過濾后，與柱料在4°C孵育過夜。上清與柱料結(jié)合后，用20倍體積PBS沖洗柱料，以洗去未結(jié)合的雜蛋白。再用I倍體積洗脫液與柱料孵育15分鐘后洗脫結(jié)合蛋白。收集洗脫液于透析袋中，用預(yù)冷的1XPBS(PH7. 4)4°C透析兩次，每次3小時(shí)，然后吸出蛋白，于4°C、12000rpm離心20分鐘除菌，取上清分裝保存于_80°C待用。蛋白用BCA方法對(duì)其進(jìn)行蛋白定量，取部分樣品加入蛋白上樣緩沖液，于100°C水浴煮5分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE以及Western blot，鑒定純化的蛋白純度。10重組原核細(xì)胞表達(dá)蛋白TMEM98的表達(dá)純化原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-3-TMEM98轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化物L(fēng)B平板培養(yǎng)基(Amp抗性)上生長，牙簽挑單菌落接于I. 25ml LB(Amp抗性)中，37°C，300rpm，過夜培養(yǎng)，然后按 1%量轉(zhuǎn)接入 125ml 2XYP 中(含Amp 125ul)，37°C，300rpm，待 OD 值到 O. 7 O. 8 時(shí)，加入IPTG (終濃度O. 2mM)，22°C，300rpm，誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。首先取Iml誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行小量鑒定，8000rpm離心10分鐘，200ul水溶離心后的 菌體，超聲裂菌5次(400w, IOs超聲，IOs間隔)，12000rpm, 4°C，5分鐘離心，取IOOul上清，SDS-PAGE 電泳。然后進(jìn)行大量純化，收集誘導(dǎo)后的GST-rTMEM98工程菌，用PBS洗滌一次，6500rpm離心20分鐘，棄上清取沉淀，用PBS重懸菌體(PBS 15ml/100ml培養(yǎng)基)。超聲裂菌90次(400w, IOs超聲，IOs間隔，冰浴)，12000rpm,4°C,20分鐘離心，棄沉淀，留上清，上清過O. 45um濾膜。取Iml Glutathione_Sepharose4B裝柱,用去離子水洗去柱料中的保存液，再用PBS平衡，將濾過的超聲上清加到平衡的柱子上，控制流速3ml/分鐘左右。上樣后，用PBS洗柱至基線，加洗脫液(20Mm還原型谷胱甘肽，50-100M Tris溶于水，pH調(diào)至8. O)封閉柱子下面的出液閥，孵育10分鐘，將洗脫液置于透析袋中，用預(yù)冷的IXPBS(pH7. 4)4°C透析三次，每次至少3小時(shí)，然后于4°C使用超濾管濃縮蛋白至500 μ 1，吸出蛋白，于4°C，12000rpm離心20分鐘除菌，取上清分裝保存于_80°C待用。用DEAE柱對(duì)上述三種重組蛋白進(jìn)行去除內(nèi)毒素處理先用PBS平衡DEAE柱，然后將透析過的蛋白過柱，控制流速3ml/分鐘左右，采用氯化鈉梯度洗脫，留取各個(gè)梯度的洗脫液，SDS-PAGE驗(yàn)證最佳洗脫條件，用超濾管將洗脫蛋白進(jìn)行除鹽濃縮處理，然后于4°C，12000rpm離心20分鐘除菌，取上清分裝保存于_80°C待用。取5μ I蛋白用BCA方法對(duì)其進(jìn)行蛋白定量，用SDS-PAGE和鱟實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)純度和LPS的殘留情況，保證蛋白質(zhì)純度彡95%，LPS殘留量< lEU/ug。11 TMEM98多肽設(shè)計(jì)、合成，TMEM98多克隆抗體的制備、純化及鑒定根據(jù)親水性、抗原指數(shù)、位于表面的概率三條原則設(shè)計(jì)合成三段多肽(杭州中肽生化有限公司)30-60(31AA)RYCRPRDLLQRYDSKPIVDLIGAMETQSEPS134-159 (26AA)RISPRVDDVVKSMYPPLDPKLLDARTC206-225 (20AA)ASEPDKGLPGPEGFLQEQSAC用合成的TMEM98三段多肽免疫動(dòng)物。選用成年雄性新西蘭兔，初次免疫將300ug的抗原用PBS稀釋至Iml后與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，于兩足部各O. 25ml皮下注射，其余后背部皮下多點(diǎn)出點(diǎn))注射。之后每3周加強(qiáng)免疫一次，用量同前，全部后背部皮下多點(diǎn)(8點(diǎn))注射。第三次加強(qiáng)免疫后10天取兔耳緣靜脈血樣檢測(cè)效價(jià)，至效價(jià)達(dá)
I IO5以上后，將家兔處死心臟取血，獲取血清。
用CNBR活化的S印harose 4B分別耦聯(lián)TMEM98三段多肽制備親和層析柱。然后加入抗TMEM98的兔免疫血清4°C旋轉(zhuǎn)混合過夜，留取穿過液備用，再用PBS沖洗柱料。再加Λ O. IM甘氨酸緩沖液洗脫(ρΗ2.4)，洗脫液接入預(yù)加入3Μ Tris (ρΗ9. O)的收集管中。然后用微量滴度板檢測(cè)管內(nèi)抗體濃度。純化獲得的特異性抗體，置于4°C用pH7. 4PBS大體積透析，更換三次，每次間隔8小時(shí)。然后用聚乙二醇在4°C將蛋白濃縮至lml。在293T細(xì)胞中超表達(dá)TMEM98,通過Western blot、FACS、Confocal鑒定抗體的親和力及特異性。12細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM(4. 5g/L葡萄糖，4mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素)培養(yǎng)。HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法為陽離子轉(zhuǎn)染法，具體操作步驟如下
(I)細(xì)胞培養(yǎng)將HEK 293T細(xì)胞(3. OX IO5個(gè))用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基鋪在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。(2)制備DNA-Vigofect復(fù)合物用100 μ I PBS稀釋5 μ g目的質(zhì)粒，緩慢混合均勻；同樣用100 μ I PBS稀釋2 μ I VigoFect,緩慢混合均勻，在室溫下放置5分鐘后，與稀釋的DNA緩慢混合，室溫放置15分鐘，以形成DNA-VigoFect復(fù)合物。(3)轉(zhuǎn)染將DNA-VigoFect復(fù)合物緩慢滴入細(xì)胞培養(yǎng)板(200 μ I/孔)，輕微搖勻。5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，加入新鮮的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基或293T無血清培養(yǎng)基(但含有低蛋白的培養(yǎng)細(xì)胞因子)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。13 TMEM98的亞細(xì)胞定位分析13. I 超表達(dá) pEGFP-Nl-TMEM98將HEK293T細(xì)胞鋪于帶細(xì)胞爬片的24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后分別轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-TMEM98和Nl-GFP空載體，24小時(shí)后3%多聚甲醛冰上固定30分鐘，O. I % TritonX-100冰上打孔30分鐘，用活細(xì)胞核熒光染料Hoechst染核(2ug) 5分鐘，PBS洗3遍，共聚焦顯微鏡下觀察TMEM98的細(xì)胞定位情況。13.2間接免疫熒光將HEK293T細(xì)胞鋪于帶細(xì)胞爬片的24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后分別轉(zhuǎn)染pcDB-TMEM98-myc-his及pcDB-myc_his空載體，24小時(shí)后3%多聚甲醛冰上固定30分鐘，0. 1% Triton X-100冰上打孔30分鐘，加入第一段多克隆抗體冰上孵育30分鐘，PBS洗2遍，加入FITC標(biāo)記的抗兔IgG (購自中杉金橋)孵育30分鐘，PBS洗2遍，用活細(xì)胞核熒光染料Hoechst染核后(同上)共聚焦顯微鏡下觀察TMEM98的細(xì)胞定位情況。14細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞總蛋白提取和Western blot分析293T細(xì)胞培養(yǎng)上清的收集細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，分別收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清，于4°C，3500rpm離心10分鐘，棄沉淀，再于4°C,12000rpm離心15分鐘，留取處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清。293T細(xì)胞總蛋白的提取將留取上清后的細(xì)胞置于冰上，用冰預(yù)冷的IXPBS洗兩遍，用冰預(yù)冷的IXPBS吹下細(xì)胞，將細(xì)胞收集到I. 5mL離心管中，于4°C，3500rpm離心5分鐘。去除上清，在沉淀中加入RIPA細(xì)胞裂解液(20mM Tris-HCl, pH 7. 4,150mM NaCl,ImM EDTA, ImM EGTA, 1% Triton X-100，蛋白酶抑制劑 Cocktail)，冰上放置 30 分鐘，4°C，12000rpm離心15分鐘，上清轉(zhuǎn)入新管，存于_80°C備用。蛋白定量細(xì)胞提取的蛋白按照BCATM Protein Assay Kit (Pierce, 23227)說明書提供的方法進(jìn)行蛋白定量。Western blot :每組細(xì)胞蛋白取30 μ g,每組細(xì)胞培養(yǎng)上清取40 μ I,加入蛋白上樣緩沖液(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，于100°C水浴煮10分鐘。12. 5% PAGE電泳，IOOmV電轉(zhuǎn)I. 5小時(shí)，TBST液平衡，用5%牛奶室溫封閉2小時(shí)，加入相應(yīng)的一抗，4°C過夜，用TBST充分洗膜3次，每次10分鐘；然后加入相應(yīng)的IRDye 700/800標(biāo)記的二抗(I 10000)，室溫避光反應(yīng)I小時(shí)；再用TBST充分洗膜3次，每次10分鐘；最后使用Odyssey InfraredImager檢測(cè)信號(hào)。15 TMEM98蛋白的分泌驗(yàn)證用質(zhì)粒pcDB-TMEM98-myc-his轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8小時(shí)后用常溫的I X P BS洗滌細(xì)胞一次，更換新鮮的無血清培養(yǎng)基(但含有低蛋白的培養(yǎng)細(xì)胞因子)，在5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理細(xì)胞48小時(shí)后，收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清用于Western blot分析。16 BFA阻斷實(shí)驗(yàn)在293T 細(xì)胞超表達(dá) pcDB-TMEM98-myc_his 及 pcDB-myc-his 空載體質(zhì)粒(Vigo 轉(zhuǎn)染)，24小時(shí)后，用常溫的I XPBS洗滌細(xì)胞一次，換新的無血清培養(yǎng)基，并分別在細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入10mg/ml Brefeldin-A和異丙醇(用作陰性對(duì)照)，24小時(shí)后，收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清用于Western blot分析。17分離小鼠CD4+T細(xì)胞取6 8周雌性C57BL/6J小鼠(以下簡稱C57小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)頸椎脫白處死，75%乙醇浸泡I分鐘，取出小鼠置于無菌皿上，在小鼠腹中部剪開小口，撕開皮膚，眼科剪分離結(jié)締組織，取兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；之后進(jìn)入腹腔取腸系膜淋巴結(jié)及兩側(cè)腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)，放入200目篩網(wǎng)上置于盛有1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中用研件輕輕研壓淋巴結(jié)，獲細(xì)胞懸液，然后用磁珠陰性分選(Dynal Mouse⑶4 CellNegative Isolation Kit)得到小鼠 CD4+T 細(xì)胞。18小鼠Thl細(xì)胞分化用磁珠分選小鼠⑶4+T細(xì)胞，培養(yǎng)于抗⑶3 (購自BD公司)(10ug/ml)預(yù)包被的培養(yǎng)板中，加入抗CD28 (購自BD) (2ug/ml)和IL-2 (購自R&D公司)(4ng/ml)，之后在培養(yǎng)體系中加入重組小鼠IL-12 (購自R&D) (10ng/ml)、抗小鼠IL-4的抗體(購自BD) (10 μ g/ml)，在細(xì)胞分化的過程中加細(xì)胞因子和抗體同時(shí)加入TMEM98真核蛋白(0. 01ng、0. lng、lng、10ng/ml)，四天后換新鮮培養(yǎng)基，在只有IL-2(4ng/ml)、重組小鼠IL-12 (10ng/ml)、TMEM98真核蛋白條件下培養(yǎng)兩天，之后抗⑶3(10ug/ml)、⑶28(2ug/ml)抗體刺激過夜，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IFN- Y的分泌情況，后5小時(shí)加入Golgistop抑制細(xì)胞因子的分泌，通過FACS檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)的IFN- Y表達(dá)情況，檢測(cè)TMEM98分泌蛋白對(duì)小鼠Thl細(xì)胞分化的影響。19 遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity, DTH)模型建立選取6 8周齡雌性C57小鼠，第O天每只小鼠腹部皮內(nèi)兩點(diǎn)注射與完全弗氏佐劑充分乳化的2. 5mg/mL mBSA進(jìn)行致敏，此后每天腹腔注射GST-TMEM98重組蛋白(100ng/100ul/只)，連續(xù)7天,在第7天選取小鼠一側(cè)足墊皮下注射5mg/mL(30ul)mBSA進(jìn)行激發(fā)，另一側(cè)足墊注射PBS作為對(duì)照。激發(fā)后觀察24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)足墊腫脹情況。激發(fā)48小時(shí)后處死小鼠取血清、足墊及脾，進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè)足墊腫脹評(píng)分；血清中IFN-Y等細(xì)胞因子的含量；取脾細(xì)胞，加入mBSA及重組蛋白，分析抗原特異性T淋巴細(xì)胞的增殖，檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN- Y、IL-17等細(xì)胞因子的分泌。20免疫熒光染色20. I細(xì)胞膜分子檢測(cè)收獲轉(zhuǎn)染后細(xì)胞或不同類型的免疫細(xì)胞，用PBS/0. 1% BSA洗滌兩次，直接加入 IOOyl封閉液(PBS/10%正常羊血清)重懸細(xì)胞，4°C封閉30分鐘；隨后加入標(biāo)記的抗體，4°C避光孵育40分鐘；使用與標(biāo)記抗體相同種屬來源的IgG作為陰性對(duì)照。最后用PBS/0. 1% BSA洗滌兩次后，通過流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，使用Cellquest軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。20. 2細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)收獲不同類型的免疫細(xì)胞，用冷的PBS/0. 1% BSA洗滌兩次，首先用3%多聚甲醛冰上固定30分鐘；然后用0. 1% Triton X-100室溫孵育30分鐘，1500rpm離心5分鐘。再加入100 μ I封閉液(PBS/10%正常羊血清)重懸細(xì)胞，室溫封閉30分鐘。隨后加入標(biāo)記抗體，4°C避光孵育40分鐘；使用與標(biāo)記抗體相同種屬來源的IgG作為陰性對(duì)照。最后用PBS/0. 1% BSA洗滌兩次后，通過流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，使用Cellquest軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。其中細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)使用BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization試劑盒(購自BD公司)來處理細(xì)胞,之后通過流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞,使用Cellquest軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。21 ELISA21. I細(xì)胞培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后收獲上清，于4°C，3500rpm離心10分鐘，棄沉淀，再于4°C，12000rpm離心10分鐘，去除上清中細(xì)胞和碎片。使用IFN-Y、IL-4、IL-17A細(xì)胞因子ELISA試劑盒(eBioscience)夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌量。21. 2 間接 ELISA稀釋不同濃度蛋白作為抗原包被于ELISA板上，4°C過夜，棄上清，PBST洗2遍，力口入封閉液室溫封閉30分鐘，棄去封閉液，加入TMEM98抗體(I 10000稀釋，濃度為0. Iug/ml)4°C過夜，棄上清，PBST洗3遍，加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG(購自中杉金橋)(I 5000稀釋)室溫孵育I小時(shí)，棄上清，PBST洗5遍，加入底物TMB避光顯色15分鐘，2N硫酸終止，0D450讀數(shù)(同時(shí)測(cè)0D570去除本底)。22小鼠B16腫瘤模型建立選取8 10周齡雌性C57小鼠，腋下皮下注射B16細(xì)胞(本室傳代培養(yǎng))(2X IO6個(gè)細(xì)胞/IOOul PBS/鼠)，第7天給小鼠脫毛，觀察腫瘤生長情況。根據(jù)腫瘤生長情況，將小鼠分組，每組至少5只。第8-12天每天注射TMEM98原核蛋白，每組小鼠腹腔注射PBS (200ul/天/鼠)，TMEM98原核蛋白(40ug/天/鼠)。第14天處理小鼠取腫瘤稱重。用游標(biāo)卡尺量取腫瘤長徑(a)和短徑(b)，腫瘤的體積算法為V = l/2Xab2。23統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以上數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差代表一次實(shí)驗(yàn)中不同復(fù)孔間的差異，用學(xué)生T檢驗(yàn)分析各組之間是否存在顯著性差異，P < O. 05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果I.人TMEM98基因的cDNA克隆及生物信息學(xué)分析I. I以正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) cDNA文庫為模板擴(kuò)增獲得TMEM98的cDNA，以正常小鼠組織器官cDNA文庫為模板擴(kuò)增獲得小鼠Tmem98的cDNA，均與數(shù)據(jù)庫中序
列一致。
I. 2生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，TMEM98基因定位于17qll. 2，其啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)典型的CpG島，說明TMEM98的表達(dá)水平可能受甲基化等表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控。TMEM98編碼一個(gè)226個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量24. 6kDa，等電點(diǎn)4. 718。各種屬之間同源性較高，其中和小鼠的蛋白同源性達(dá)到98. 7%。TMHMM分析預(yù)測(cè)其為I型膜分子，但SignalP預(yù)測(cè)其N端的21個(gè)氨基酸是典型的信號(hào)肽，與跨膜區(qū)(4_26氨基酸)重合，表明TMEM98可能為一新的分泌蛋白。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其有O糖基化修飾位點(diǎn)。電子表達(dá)譜證明TMEM98在各個(gè)組織器官中廣譜表達(dá)。其中，在嗅球、胎肺、甲狀腺、前列腺、CD71早期紅系、前額葉皮層、下丘腦、慢性髓性白血病細(xì)胞系K562中表達(dá)較高。NCBI中GEO profile表明TMEM98與GATA3存在相互關(guān)系，并且在乳頭狀甲狀腺癌及感染SIV及HIV的Jurkat細(xì)胞中高表達(dá)(提高2倍作右，表明其可能與病毒感染有關(guān))，在小鼠免疫抵抗的腫瘤細(xì)胞系中低表達(dá)(約降低2/3，表明其可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān))。以上表明TMEM98可能在病毒感染及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。2 TMEM98多克隆抗體的制備、純化與鑒定2.1用合成的TMEM98三段多肽分別免疫家兔，抗體效價(jià)達(dá)I : IO5以上后，將家兔處死心臟取血，獲取血清。血清用CNBR分別耦聯(lián)TMEM98三段多肽純化獲得抗體。在293T細(xì)胞中超表達(dá)TMEM98，通過Western blot鑒定抗體特異性，結(jié)果(見圖I的A，Marker :170、130、100、72、55、40、33、24、17、IlkDa)表明這三段多肽獲得的抗體均能特異性識(shí)別外源性表達(dá)的TMEM98蛋白，其中抗第一、二段多肽的抗體效果更好。此外，由于人和小鼠TMEM98蛋白同源性較高(98. 7% )，而且多肽I和多肽2的人鼠序列一致，因此，在293T細(xì)胞中超表達(dá)小鼠pcDB-Tmem98-myc-his,選用多肽I和多肽2的混合抗體通過Western blot鑒定其特異性，結(jié)果(見圖I的B)表明多肽免疫的多克隆抗體也能特異識(shí)別小鼠Tmem98蛋白，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行提供基礎(chǔ)。2. 2用針對(duì)TMEM98第一段多肽的抗體進(jìn)行間接免疫熒光分析，結(jié)果如圖3的B所示，與陰性對(duì)照和空載體組相比，抗TMEM98抗體能特異識(shí)別細(xì)胞膜表面的TMEM98，說明該抗體能夠用于細(xì)胞膜表面蛋白的FACS分析實(shí)驗(yàn)。2.3此外，我們還用免疫共沉淀的方法檢測(cè)該抗體的特異性。收集超表達(dá)TMEM98真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染上清，加入抗TMEM98第一段多肽的抗體孵育過夜，之后加入ProteinG孵育過夜，PBS洗3遍，加入上樣緩沖液煮樣品，收集上清進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果如圖I的C所示，TMEM98的抗體可以很好的結(jié)合上清中的TMEM98蛋白。上述結(jié)果說明TMEM98的抗體具有良好的特異性及親和力，為后續(xù)開發(fā)ELISA試劑盒以及進(jìn)行功能研究提供了基礎(chǔ)。如圖I的D所示，間接ELISA的結(jié)果表明各TMEM98蛋白濃度之間具有良好的梯度性，且與PcDB組相比，該檢測(cè)方法能特異識(shí)別超表達(dá)TMEM98的293T上清。目前該抗體已標(biāo)記生物素用于制備雙抗夾心ELISA試劑盒，后續(xù)將對(duì)該試劑盒的特異性及親和力做進(jìn)一步驗(yàn)證。3 TMEM98在組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜分析3.1 TMEM98在人正常組織和免疫系統(tǒng)廣譜表達(dá)使用購買于clontech公司的人正常組織cDNA文庫擴(kuò)增TMEM98，結(jié)果如圖2的A所示，TMEM98在多種組織中廣泛表達(dá)，在免疫系統(tǒng)如脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、胎肝以及白細(xì)胞中也廣譜表達(dá)，表明TMEM98可能作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。3. 2 TMEM98在人白血病細(xì)胞系中的表達(dá)情況 如圖2的B所示，TMEM98在九種白血病細(xì)胞系中都有表達(dá)，僅在THP-I (人單核/巨噬細(xì)胞)中未檢測(cè)到。3. 3 TMEM98在炎性因子刺激后的表達(dá)上調(diào)收集未刺激及炎性因子IL-I β刺激3h、6h、24h的A549細(xì)胞，未刺激及炎性因子LPS刺激6h的PBMC，未刺激及炎性因子LPS刺激2h、4h、6h的小鼠巨噬細(xì)胞，檢測(cè)潛在新細(xì)胞因子編碼基因TMEM98在炎性因子刺激后mRNA水平的變化情況，分別選用IL_8、IL_6、IL-I作為陽性對(duì)照。結(jié)果如圖2的C所示，在炎性因子刺激后人TMEM98及小鼠Tmem98表達(dá)上調(diào)，表明其與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可用于炎癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，其重組蛋白或抗體具有治療炎癥的功能。此外，我們還采用FACS的方法檢測(cè)了抗⑶3/⑶28抗體刺激后的人PBMC細(xì)胞中TMEM98蛋白水平表達(dá)變化，結(jié)果如圖2的D所示，發(fā)現(xiàn)其在CD4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在單核細(xì)胞分化為DC后表達(dá)明顯上調(diào)，表明其可能與Th細(xì)胞的分化或活化等過程相關(guān)。4 TMEM98的亞細(xì)胞定位4. I生物信息學(xué)表明TMEM98存在著跨膜區(qū)。為了驗(yàn)證TMEM98是否具有膜定位形式，我們?cè)?93T細(xì)胞中超表達(dá)TMEM98-GFP，通過Confocal觀察TMEM98的細(xì)胞定位情況。結(jié)果如圖3的A所示，與對(duì)照組GFP全細(xì)胞彌散性定位相比，TMEM98-GFP主要定位于細(xì)胞膜。4.2此外，用針對(duì)TMEM98第一段多肽的多克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光分析其定位。在293T中超表達(dá)了 TMEM98和空載體pcDB，用兔IgG作為陰性對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞膜表面TMEM98，結(jié)果如圖3的B所示，與陰性對(duì)照和空載體組相比，抗TMEM98的抗體能特異識(shí)別細(xì)胞膜表面的TMEM98,說明其定位于細(xì)胞膜上,并且由于myc標(biāo)簽在C端,抗myc抗體能夠識(shí)別位于細(xì)胞膜上的TMEM98蛋白，表明TMEM98為一 C端在外的II型膜蛋白。由于目前已知的細(xì)胞因子有許多同時(shí)具有膜定位及分泌二種形式，這一結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步研究其功能機(jī)制提供重要線索。5 TMEM98真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、分泌驗(yàn)證、N端測(cè)序及真核蛋白表達(dá)純化5.1生物信息學(xué)表明TMEM98有典型信號(hào)肽，可能為分泌蛋白。在293T細(xì)胞中超表達(dá)TMEM98-Myc-His融合蛋白，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中存在分泌形式，證明TMEM98存在分泌形式。之后采用BFA抑制試驗(yàn)對(duì)TMEM98是否為經(jīng)典分泌蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果如圖4的A所示(選取一經(jīng)典分泌蛋白作為陽性對(duì)照)，表明TMEM98是通過非經(jīng)典途徑分泌的。5. 2為了進(jìn)行TMEM98的功能研究，在293T細(xì)胞中超表達(dá)TMEM98真核表達(dá)質(zhì)粒，用Ni2+柱料純化細(xì)胞培養(yǎng)上清，取5μ I蛋白用BCA方法對(duì)其進(jìn)行蛋白定量，取部分樣品加入蛋白上樣緩沖液，于99°C加熱快煮10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE以及western blot，鑒定TMEM98分泌蛋白純化的純度。圖4的B為TMEM98蛋白純化后SDS-PAGE圖(LPS < O. IEU/ug)，其純度在95%以上，達(dá)到進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)的要求。5.3在293T細(xì)胞中超表達(dá)pYDll-TMEM98-hFc，Protein G柱進(jìn)行純化得到帶hFc標(biāo)簽的TMEM98真核蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜，進(jìn)行N端測(cè)序(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司)，所測(cè)氨基酸數(shù)目及序列(從N到C)共10個(gè)，為METVVIVAIG，表明部分TMEM98是以完整蛋白形式分泌至胞外，且進(jìn)一步說明其通過非經(jīng)典途徑分泌。6 TMEM98原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以及原核蛋白的純化為了研究分泌型TMEM98蛋白的功能，我們構(gòu)建了含有TMEM98 cDNA的原核表達(dá)·載體pGEX-4T-3-TMEM98。其表達(dá)的重組蛋白為GST-TMEM98，即蛋白的N端帶有GST標(biāo)簽，GST標(biāo)簽與TMEM98目的蛋白之間有一個(gè)凝血酶的酶切位點(diǎn)，用凝血酶去除GST標(biāo)簽得到重組TMEM98原核蛋白(圖5)。7 TMEM98對(duì)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白分子的影響補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(CRP)的高表達(dá)能抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊，使腫瘤逃避機(jī)體免疫防御。細(xì)胞因子能夠通過調(diào)節(jié)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白從而在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮重要功能。如在對(duì)腎癌的研究中發(fā)現(xiàn)IL-I能下調(diào)⑶46、⑶59的表達(dá)，IL-4能持續(xù)下調(diào)⑶46、⑶55及轉(zhuǎn)化生長因子，能增加C3在腫瘤細(xì)胞上的沉積，在針對(duì)抗腫瘤相關(guān)抗原使用抗體的同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用細(xì)胞因子將成為一種新的有效的免疫治療方法。前期GEO表達(dá)譜分析表明TMEM98可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系，因此我們進(jìn)一步分析了 TMEM98分泌蛋白對(duì)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的影響。圖6所示，其真核及原核蛋白均能抑制CD46、CD59在蛋白水平的表達(dá)，表明TMEM98能夠通過下調(diào)CRP的表達(dá)來阻止免疫逃逸，使得補(bǔ)體系統(tǒng)能夠發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。也進(jìn)一步表明TMEM98原核蛋白具有活性。8 TMEM98對(duì)小鼠Thl、Th2細(xì)胞分化的影響由于TMEM98在單核細(xì)胞向DC細(xì)胞的分化過程及⑶4+T細(xì)胞的活化過程中表達(dá)上調(diào)，表明其可能參與在Th細(xì)胞的分化、活化或在其增殖過程中發(fā)揮功能。因此，我們利用小鼠Thl、Th2分化平臺(tái)對(duì)其功能做了進(jìn)一步研究。首先獲得小鼠淋巴細(xì)胞懸液，通過磁珠陰性選擇得到CD4+T淋巴細(xì)胞，然后按小鼠Thl細(xì)胞的誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)Thl細(xì)胞分化，在分化同時(shí)分別加入TMEM98真核蛋白(O. Olng,O. 1叩、1叩、10叩/1111)，最后通過？40531^4檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及上清中IFN-Y變化情況。結(jié)果如圖7的A所示，表明TMEM98真核蛋白能促進(jìn)小鼠Thl細(xì)胞的分化。在Thl細(xì)胞分化過程中，IL-12起始動(dòng)作用，許多細(xì)胞因子發(fā)揮Thl細(xì)胞分化促進(jìn)功能有賴于IL-12，因此，為了進(jìn)一步研究TMEM98發(fā)揮功能是否依賴于IL-12，我們?cè)赥hl細(xì)胞分化體系中撤除IL-12，之后分別用FACS、ELISA檢測(cè)TMEM98的功能，如圖7的B所示，TMEM98能輕微促進(jìn)Thl細(xì)胞分化，程度弱于IL-12存在的情況下，表明其功能部分依賴于IL-12。由于Thl細(xì)胞主要分泌IFN-Y、IL-2、LTa等，通過細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗病毒、抗胞內(nèi)病原體感染、抗腫瘤、遲發(fā)型超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，且Thl細(xì)胞分泌的IFN-Y、IL-2等細(xì)胞因子具有促炎作用，因此TMEM98重組蛋白及抗體能夠通過促進(jìn)小鼠Thl細(xì)胞體外分化從而在抗病毒、抗胞內(nèi)病原體感染、抗腫瘤以及炎癥治療方面有重要應(yīng)用價(jià)值。9 TMEM98在小鼠DTH模型中的功能前期實(shí)驗(yàn)表明TMEM98能促進(jìn)小鼠Thl細(xì)胞體外分化，之后我們制備了小鼠DTH模型對(duì)其功能做了進(jìn)一步研究，結(jié)果(圖8)表明，TMEM98可促進(jìn)小鼠DTH模型中Thl細(xì)胞的分化。 用mBSA誘導(dǎo)小鼠DTH模型，在致敏后激發(fā)前每日腹腔注射GST-TMEM98重組蛋白，激發(fā)后48h處死小鼠，檢測(cè)各指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)TMEM98能夠明顯抑制小鼠足墊腫脹程度，腫脹達(dá)到高峰的時(shí)間也有所延遲(圖8的A)。此外，檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)注射蛋白組小鼠血清中IFN-Y水平與對(duì)照組相比明顯增加；同時(shí)，分離小鼠脾細(xì)胞與mBSA共孵育，同時(shí)加入GST-TMEM98重組蛋白，檢測(cè)抗原特異性T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注 射蛋白組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y分泌明顯增加(圖8的B)。文獻(xiàn)報(bào)道在mBSA誘導(dǎo)的小鼠DTH模型中Thl細(xì)胞起抑制作用，因此推測(cè)可能是由于TMEM98促進(jìn)了小鼠體內(nèi)Thl細(xì)胞分化過程，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠足墊腫脹程度減輕。結(jié)合體外作用結(jié)果，上述結(jié)果表明TMEM98可促進(jìn)DTH模型小鼠體內(nèi)Thl細(xì)胞的分化。此外，我們進(jìn)一步分析了脾細(xì)胞中各類細(xì)胞比例的變化。如圖8的C所示，GST-TMEM98重組蛋白組⑶8+T細(xì)胞的比例增加，由于Thl細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-2、IFN-Y可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖、成熟，促進(jìn)其殺傷功能，而CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤方面發(fā)揮重要功能，因此，在抗腫瘤方面具有重要應(yīng)用價(jià)值，結(jié)合前期生物信息學(xué)分析結(jié)果以及在DU145中該蛋白對(duì)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子的功能，說明TMEM98在腫瘤治療方面具有重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。10 TMEM98在小鼠B16腫瘤模型中的功能建立小鼠B16腫瘤模型，在第8-12天每天注射TMEM98原核蛋白，第14天處理小鼠取腫瘤稱重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，注射蛋白組腫瘤重量明顯降低(圖9的左圖)，體積也比PBS組要小(圖9的右圖)。綜上所述，TMEM98在多種炎性因子刺激后表達(dá)上調(diào)，表明其與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有治療及診斷價(jià)值；TMEM98編碼一種非經(jīng)典分泌蛋白，并且具有細(xì)胞膜定位形式，功能研究發(fā)現(xiàn)其在活化的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其編碼的分泌蛋白能促進(jìn)小鼠Thl細(xì)胞體外分化，體內(nèi)功能研究發(fā)現(xiàn)TMEM98原核蛋白能夠抑制小鼠DTH的發(fā)生及發(fā)展，血清及抗原特異性脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-Y分泌增加，脾細(xì)胞中⑶8+T細(xì)胞比例增加，由于Thl通過細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗病毒、抗胞內(nèi)病原體感染以及抗腫瘤、引發(fā)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)方面發(fā)揮重要功能，⑶8+T細(xì)胞具有腫瘤殺傷功能，并且GEO profile表明小鼠Tmem98在小鼠免疫抵抗的腫瘤細(xì)胞系中低表達(dá)(表明其可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān))，并且體內(nèi)功能研究發(fā)現(xiàn)人TMEM98原核蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤有抑制作用，這說明TMEM98在抗病毒感染、抗胞內(nèi)細(xì)菌感染(如結(jié)核分枝桿菌等)、腫瘤免疫治療以及輔助診斷中具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種用于炎癥相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑噭┖?，所述試劑盒含有作為促炎癥蛋白的TMEM98蛋白。
2.抗TMEM98蛋白的抗體在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)用，所述炎癥是所述TMEM98蛋白所促進(jìn)的炎癥。
3.TMEM98蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤是指能夠通過促進(jìn)IFN-Y分泌、促進(jìn)Thl細(xì)胞分化和/或抑制CD46和CD59蛋白的表達(dá)來抑制和/或治療的腫瘤。
5.TMEM98蛋白在制備抗感染尤其是抗胞內(nèi)細(xì)菌感染及抗病毒感染、抗纖維化作用、治療過敏性疾病和/或治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用，其中，所述感染、纖維化作用、過敏性疾病和自身免疫疾病能夠通過提高IFN- Y水平和/或通過促進(jìn)Thl細(xì)胞分化來抑制和/或治療。
6.TMEM98蛋白在制備促進(jìn)IFN- Y分泌、促進(jìn)Thl細(xì)胞分化和/或抑制⑶46和⑶59表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
7.TMEM98蛋白在制備消除腫脹的藥物中的應(yīng)用，所述腫脹為mBSA誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)所引起的腫脹。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述TMEM98蛋白為人類TMEM98蛋白。
9.一種用于診斷炎癥的試劑盒，所述試劑盒含有 抗TMEM98蛋白的抗體，所述抗體用于TMEM98蛋白的定量檢測(cè)；和/或用于在PCR中合成TMEM98基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，所述引物用于TMEM98基因表達(dá)的定量檢測(cè)； 其中所述TMEM98蛋白優(yōu)選為人類TMEM98蛋白或小鼠TMEM98蛋白，所述TMEM98基因優(yōu)選為人類TMEM98基因或小鼠TMEM98基因。
10.成熟人類TMEM98蛋白N端氨基酸序列METVVIVAIG所對(duì)應(yīng)的DNA序列在下述方面的應(yīng)用 構(gòu)建包含所述N端氨基酸序列的人類TMEM98重組蛋白的原核或真核細(xì)胞表達(dá)載體；和/或 在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)包含所述N端氨基酸序列的人類TMEM98重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供人類潛在新細(xì)胞因子TMEM98的應(yīng)用。人TMEM98基因編碼一種非經(jīng)典分泌蛋白，其同時(shí)具有細(xì)胞膜定位形式和細(xì)胞外分泌形式，其在多種炎性因子刺激后表達(dá)上調(diào)，表明其與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。體內(nèi)及體外功能研究發(fā)現(xiàn)人TMEM98蛋白能促進(jìn)小鼠Th1細(xì)胞在體內(nèi)及體外的分化、促進(jìn)IFN-γ的分泌，抑制CD46和CD59的表達(dá)并且對(duì)小鼠黑色素瘤有抑制作用。因此，人TMEM98蛋白可能作為炎癥治療的新靶點(diǎn)和抗腫瘤藥物，并且可通過其功能發(fā)揮抑制和/或治療多種炎癥、感染、纖維化作用、過敏性疾病和自身免疫疾病的作用。
文檔編號(hào)A61P37/08GK102901826SQ20111021728
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者韓文玲, 馬大龍, 付偉偉, 張巖飛, 王平章, 石太平, 王文彥, 李婷, 潘文, 劉繪繪, 于鵬 申請(qǐng)人:北京大學(xué)