專利名稱：IL-17RC-hFc融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種白細(xì)胞介素受體的融合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(liheumatoid arthritis, RA)是一種慢性炎癥性自身免疫病，主要損傷關(guān)節(jié)滑膜、軟骨和骨，以多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的滑膜炎為其主要特征。隨著疾病進(jìn)展， 炎癥加重，逐漸導(dǎo)致骨質(zhì)破壞、關(guān)節(jié)畸形，勞動(dòng)能力喪失，致殘率極高。該病世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為1%，給個(gè)人和社會(huì)造成了沉重負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)RA的發(fā)病機(jī)制及治療藥物的研究具有重要的社會(huì)意義。現(xiàn)有的治療手段多為采用緩解病變的抗風(fēng)濕藥(DMARDQ。上世紀(jì)90 年代生物制劑開始應(yīng)用，目前已有的生物制劑對(duì)部分患者的療效并不滿意，不良反應(yīng)也比較常見。本發(fā)明針對(duì)RA發(fā)病中慢性炎癥反應(yīng)及骨破壞這兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的RA關(guān)鍵性病理學(xué)問題，研制IL-17RC-hFc融合蛋白，為RA的治療開辟了一種新的思路。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17是RA發(fā)生的核心炎性因子，與RA的滑膜炎癥及骨損傷有密切關(guān)系。IL-17的增加可加重關(guān)節(jié)炎癥的程度，故IL-17成為RA新的治療靶點(diǎn)。IL-17 于1993年被發(fā)現(xiàn)，主要由激活的記憶性T細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，該家族包含A F六個(gè)成員。IL-17A是該家族的典型分子，是二硫鍵相連的二聚體糖蛋白，并以同型二聚體的形式發(fā)揮作用，包含巧5個(gè)氨基酸，分子量35KD。該家族成員中IL-17F與IL-17A同源性最高，氨基酸序列一致性占50%以上，二者可形成同源二聚體或異源二聚體并與相應(yīng)受體結(jié)合?，F(xiàn)有的研究顯示兩者在炎癥性疾病和自身免疫病中發(fā)揮重要作用。IL-17作為重要的炎性因子對(duì)RA的發(fā)生發(fā)展起重要作用①RA患者關(guān)節(jié)滑液中IL-17含量增高，IL-17可以促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞產(chǎn)生 TNF- α、IL-I β、IL_6、GM-CSF等前炎癥細(xì)胞因子，并且在體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中加入IL-17可以刺激多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；②IL-17還可活化軟骨細(xì)胞，使其釋放基質(zhì)降解相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)等，IL-17刺激產(chǎn)生的IL-l、TNF-a可增加滑膜成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，侵入損傷的軟骨內(nèi)，并通過(guò)介導(dǎo)軟骨凋亡，嚴(yán)重破壞軟骨的修復(fù)功能；③正常情況下，核刺激因子受體配體(RANKL)作為激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞關(guān)鍵的和必需的因子主要表達(dá)在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞上并維持骨的代謝平衡，但在炎癥狀況及自身免疫失調(diào)情況下，RANKL的表達(dá)增加，RANKL分子進(jìn)一步可與M-CSF共同活化破骨細(xì)胞前體細(xì)胞成熟為破骨細(xì)胞，造成骨的侵蝕。IL-17可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及T細(xì)胞等膜表面RANKL分子(mRANKL) 的表達(dá)，特異性抗體染色顯示，CD4+T細(xì)胞、RANKL分子、血管翳在炎癥骨破壞關(guān)節(jié)有相似的分布模式，IL-17與⑶4+T細(xì)胞上RANKL分子的表達(dá)有劑量依賴性的關(guān)系。這從骨破壞角度揭示了 IL-17在RA中的重要作用；④影響RANKL表達(dá)的因素有很多，在體外培養(yǎng)情況下， IL-6、IL-11、甲狀旁腺激素(PTH)、前列腺素 E2 (PGE2) ,1,25 二羥維生素 D3 [1，25 (OH) 2D3] 以及TNF- α均可促使其表達(dá)，而這些因子中很可能存在與IL-17相互促進(jìn)形成正反饋環(huán)路的因子；⑤RANKL是一種跨膜蛋白，包含有受體結(jié)合的外功能區(qū)和膜錨著區(qū)，mRANKL在金屬
3蛋白酶解聚素腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(TACE)或某種相關(guān)的金屬蛋白酶作用下裂解為游離型 RANKL (sRANKL)，sRANKL可能在脫落后激活破骨前體細(xì)胞，而IL-17可以促使成纖維細(xì)胞金屬蛋白酶的表達(dá)，即有可能促進(jìn)sRANKL的形成而介導(dǎo)骨破壞。IL-17受體家族的第一個(gè)成員IL-17RA于1995年被發(fā)現(xiàn)，隨后用生物信息學(xué)方法先后確定了另外的四個(gè)受體相關(guān)分子，后命名為IL-17RB-E，均為一型跨膜蛋白。IL-17RA 由293個(gè)氨基酸組成細(xì)胞外區(qū)域，跨膜區(qū)含有21個(gè)氨基酸，胞漿內(nèi)是由525個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)段。介導(dǎo)IL-17的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要IL-17RC(IL-17RL)的參與，IL-17RA與IL-17RC可能以異源二聚體形式發(fā)揮作用。IL-17RC存在很多剪接變體(splice forms)，其意義尚不明確。IL-17RC(IL-17RL)在人的前列腺、軟骨、腎臟、肝臟、心臟和骨骼肌均有表達(dá)，新近有研究檢測(cè)了 IL-17A、IL-17F與IL-17RA以及IL-17RC的各種剪接變體的結(jié)合反應(yīng)，結(jié)果證實(shí)了 IL-17RA只能與IL-17A結(jié)合，與IL-17F的結(jié)合能力微弱。IL-17RC是IL-17F的受體， 且可與IL-17A高親和力結(jié)合。因?yàn)榇嬖诓煌募艚幼凅w，某些亞型的分泌蛋白保持了配基的結(jié)合能力，但因其不具有跨膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)片段而喪失了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。這就預(yù)示著， IL-17RC的可溶性胞外形式，因?yàn)椴话缒ざ魏桶麅?nèi)段，但卻可以結(jié)合IL-17A、IL-17F而阻斷其與天然受體結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，進(jìn)而阻止IL-17A、IL-17F所致的炎癥和骨質(zhì)破壞。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種IL-17RC_hFc融合蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明首先提供一種IL-17RC_hFc融合蛋白，其包含人IL-17RC與白細(xì)胞介素 17A、白細(xì)胞介素17F結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域(外顯子8-12區(qū)域)和人IgGl Fc段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述IL-17RC_hFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 ；本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)該片段，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。如，在活性區(qū)段，將第9位的(丙氨酸(A)) 替換為(蘇氨酸(T))或是在非活性區(qū)段，將第(164-178)位的氨基酸序列(鉸鏈區(qū))部分或全部缺失，或是在(164-178)位氨基酸前、中、后面增加(一個(gè)或多個(gè)脯氨酸)。因此， IL-17RC-hFc融合蛋白還包括SEQ ID No. 1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等活性的由SEQ ID No. 1衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼上述融合蛋白的基因。在本發(fā)明實(shí)施方案中，編碼該融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。可將本發(fā)明上述基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的重組表達(dá)載體，進(jìn)而可以將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到表達(dá)IL-17RC-hFc融合蛋白的基因工程菌。本發(fā)明所使用的表達(dá)載體可以選用各種已知的原核表達(dá)載體。本發(fā)明所使用的宿主細(xì)胞可以選用本領(lǐng)域公知的用于重組表達(dá)的菌株，如大腸桿菌BL21。本發(fā)明還提供一種制備上述融合蛋白的方法，包括如下步驟將編碼 IL-17RC_hFc融合蛋白的基因克隆到表達(dá)載體中，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌體培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，分離純化得到該融合蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)構(gòu)建重組基因，與pET_28a表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，表達(dá)融合蛋白，并通過(guò)凝膠過(guò)濾層析或離子交換層析等方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，采用SDS-PAGE、Western-blot等對(duì)融合蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定。本發(fā)明還提供所述的融合蛋白在制備治療IL17A和/或IL17F引起的炎癥性疾病和/或自身免疫性疾病中的應(yīng)用。優(yōu)選在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等疾病的藥物中的應(yīng)用。最優(yōu)選的，本發(fā)明的融合蛋白可應(yīng)用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。本發(fā)明提供的IL-17RC_hFc融合蛋白含有IL-17RC發(fā)揮結(jié)合作用的關(guān)鍵區(qū)段(外顯子8-12區(qū)域)，可作為誘餌蛋白結(jié)合兩種致炎因子發(fā)揮抑炎作用，添加IgGl Fc片段可穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，并有利于機(jī)體對(duì)結(jié)合后的復(fù)合物的處理。兩者均為人體自身蛋白結(jié)構(gòu)，不會(huì)作為異種蛋白產(chǎn)生抗原性，為該蛋白的安全性提供保障。研究結(jié)果表明，IL-17RC-hFc融合蛋白具有結(jié)合IL-17A、IL-17F的功效，并可在細(xì)胞水平抑制炎性細(xì)胞因子IL-6的釋放和膜表面RANKL分子的表達(dá)，發(fā)揮抑制炎癥和減輕骨破壞作用，可進(jìn)一步用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病治療的研究。本發(fā)明的IL-17RC_hFc融合蛋白可以作為治療性誘餌受體使用，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病提供了一種新的治療途徑和思路。本發(fā)明通過(guò)體外表達(dá)IL-17RC-hFc融合蛋白，表達(dá)量高，可控性強(qiáng)，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1顯示本發(fā)明所選用的表達(dá)載體pET18a(+)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為IL-17RC_hFc重組基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中，圖2A為重組基因的IL-17RC段PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道1 分子量Marker ；泳道2_5 JL-17RC(exon8-12)序列擴(kuò)增結(jié)果，目的基因全長(zhǎng)G89bp)；圖2B為重組基因的hFc段PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道1 分子量Marker ；泳道2_5 人IgGl Fc段(hinge-CH2_CH3)目的基因全長(zhǎng)(696bp)；圖2C為上述兩片段經(jīng)重疊PCR構(gòu)建IL-17RC-hFc重組基因PCR結(jié)果，泳道5 分子量Marker ；泳道1_4 上述兩片段拼接結(jié)果，目的基因全長(zhǎng)(Il^bp)。圖3為連接后表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果連接后的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后(Nco I、 EcoR I)；泳道3 分子量Marker ；泳道1 :pET-28a-IL-17RC_hIgG Fc重組表達(dá)質(zhì)粒；泳道2 PET-28a-IL-17RC-hIgG Fc雙酶切(Nco I和EcoR I)；酶切后的小片段與目的序列大小一致。圖4為IL-17RC_hFc融合蛋白表達(dá)狀況SDS-PAGE電泳圖譜分析；其中，泳道1 Marker ；泳道2 誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液；泳道3 裂菌后上清；泳道4 :4M尿素洗滌后上清；泳道5 4M尿素洗滌后沉淀；泳道6 :2M尿素洗滌后上清。顯示重組蛋白大量表達(dá)。圖5顯示的是IL-17RC_hFc融合蛋白經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化樣本分析泳道1 分子量Marker ；泳道2_6 變性蛋白依次洗脫樣本。圖6顯示的是狗8{6111-131(^分析IL-17RC_hFc融合蛋白，以抗人IL-17RC多克隆抗體檢測(cè)顯示，大量表達(dá)的蛋白為目的蛋白。圖7顯示的是目的蛋白與IL-17A，IL-17F的體外結(jié)合能力檢測(cè)。其中，圖7A是 IL-17RC-hFc與IL-17A結(jié)合能力ELISA檢測(cè)；圖7B是IL_17RC_hFc與IL-17F結(jié)合能力 ELISA檢測(cè)。
圖8顯示的是IL-17RC_hFc融合蛋白對(duì)IL-17A/IL-17F刺激小鼠成纖維細(xì)胞 NIH/3T3產(chǎn)生炎癥因子IL-6的抑制作用，加入融合蛋白的組分泌IL-6的量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖9顯示的是IL-17RC-hFc融合蛋白對(duì)IL-17A/IL-17F刺激小鼠成骨細(xì)胞 MC/3T3-E1表達(dá)膜表面RANKL分子的抑制作用，其中圖9A是MC/3T3-E1細(xì)胞的空白對(duì)照；圖 9B為融合蛋白對(duì)該細(xì)胞的作用；圖9C，D為IL-17A，IL-17F對(duì)膜表面RANKL分子的表達(dá)刺激作用，顯示細(xì)胞膜表面及胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加，圖9E，F(xiàn)為融合蛋白分別對(duì)IL-17A， IL-17F的抑制作用，顯示熒光強(qiáng)度減弱，圖9G，H為IL-17A，IL-17F的抗體對(duì)照，熒光強(qiáng)度同樣減低。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 IL-17RC_hFc重組基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)IL-17RC-hFc 融合蛋白重組片段(IL-17RC P208-371，IgGl FcP98_330)對(duì)應(yīng)的基因序列和pET48a(+)表達(dá)載體的特征設(shè)計(jì)引物(見下表)，以購(gòu)自^witrogen并經(jīng)測(cè)序正確的pD0NR223-IL-17RC ORF克隆質(zhì)粒為模板，3和4為引物，進(jìn)行IL_17RC_hFc蛋白 IL-17RC段編碼序列的PCR擴(kuò)增(圖2A)；以含人IgGl Fc基因序列質(zhì)粒pCMV6-XL4_IgGl Fc為模板(購(gòu)買自O(shè)rigene公司，貨號(hào)SC117595)，5和6為引物進(jìn)行人IgGl Fc段的擴(kuò)增 (圖2B)；然后以擴(kuò)增后的兩段PCR產(chǎn)物為模板，3和6為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到編碼重組蛋白IL-17RC-hFc的基因片段(圖2C)，后雙酶切克隆入pET48a(+)構(gòu)建得到表達(dá)載體為pET48a(+)-IL-17RC-hFc。相應(yīng)的重組基因序列如SEQ ID No. 2所示。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，按下述參數(shù)循環(huán)35次94°C變性30s，55 °C退火30s，72°C延伸90s，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察其大小，通過(guò)重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定和雙酶切鑒定(圖幻，PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶，且雙酶切鑒定重組質(zhì)粒含有的目的基因片段為預(yù)期大小，說(shuō)明本發(fā)明成功構(gòu)建了 IL-17RC-hFc融合蛋白的原核表達(dá)載體。表1相關(guān)引物
權(quán)利要求
1.IL-17RC"hFc融合蛋白，其包含人IL-17RC中與白細(xì)胞介素17A、白細(xì)胞介素17F結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域和人IgGl Fc段。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為1)由SEQID No. 1所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2)SEQ ID No. 1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的并具有與1)所述蛋白具有同等功能的蛋白質(zhì)。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.一種制備權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的方法，其包括如下步驟將權(quán)利要求3或4 所述的基因克隆到表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌體培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，分離純化得到該融合蛋白。
8.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備治療IL17A和/或IL17F引起的炎癥性疾病和/或自身免疫性疾病中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人白細(xì)胞介素受體C(IL-17RC)的融合蛋白，其包含人IL-17RC與白細(xì)胞介素17A(IL-17A)、白細(xì)胞介素17F(IL-17F)結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域和人IgG1 Fc段。本發(fā)明提供的IL-17RC-hFc融合蛋白具有結(jié)合IL-17A和IL-17F的能力，并可抑制IL-17A、IL-17F刺激的炎性細(xì)胞因子IL-6的釋放和RANKL分子的表達(dá)，可以用于治療與IL-17相關(guān)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，發(fā)揮抑制炎癥和拮抗骨破壞作用。本發(fā)明IL-17RC-hFc融合蛋白可以作為治療性誘餌受體使用，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病提供一種新的治療途徑和思路。本發(fā)明通過(guò)體外原核表達(dá)IL-17RC-hFc融合蛋白，該方法表達(dá)量高，可控性強(qiáng)，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102276727SQ201110218509
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者榮雨佳, 賈軍會(huì), 趙文明 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)