專利名稱：一種抗菌肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工合成的全新抗菌肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗生素由于產(chǎn)生藥物殘留及細(xì)菌耐藥性問題，因此迫切需要發(fā)現(xiàn)一種綠色、無污染和無細(xì)菌耐藥性的替代物?？咕氖巧矬w內(nèi)廣泛存在的一種具有廣譜抗菌活性的小肽類物質(zhì)，是生物非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠抑制多種細(xì)菌或真菌，甚至包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的生長(zhǎng)?？咕挠捎趲в袃粽姾?，從而通過物理作用與細(xì)菌胞膜產(chǎn)生物理作用；再通過疏水性殘基與磷脂中的疏水組分相互作用而抑制或者殺死細(xì)菌。而對(duì)于細(xì)菌等微生物很難改變其自身磷脂雙分子層的胞膜結(jié)構(gòu)，因此使得抗微生物肽產(chǎn)生耐藥性的幾率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成為基因工程和藥物開發(fā)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，具有極為廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景?？咕牡姆N類、數(shù)量繁多，結(jié)構(gòu)也是復(fù)雜多變的。因此很難找到統(tǒng)一的抗菌肽模型來進(jìn)行廣泛的研究。另外，盲目使用基因工程的方法表達(dá)抗菌肽，而沒有對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能以及體內(nèi)外活性進(jìn)行全面的探討，導(dǎo)致表達(dá)得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性和細(xì)胞毒性。目前為止，已經(jīng)有很多種方法來研究抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。 比如通過自然存在的天然抗菌肽的氨基酸替換或刪減來產(chǎn)生一系列衍生物，或通過構(gòu)建抗菌肽庫的方法篩選抗菌肽，或利用最簡(jiǎn)化的方法來得到僅含有幾種氨基酸的全新抗菌肽等方法。因此，本發(fā)明從抗菌肽的作用機(jī)制及其氨基酸組成特點(diǎn)入手來合成一組抗菌肽。通過使用堿性氨基酸精氨酸(Arg)殘基來提供正電荷來吸引細(xì)菌表面的負(fù)電荷，再通過由脂肪族氨基酸異亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Wie)與磷脂發(fā)生疏水性作用，從而產(chǎn)生生物學(xué)活性，為抗菌肽作用機(jī)制的研究及其應(yīng)用提供支持。國(guó)內(nèi)外還未見到利用精氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸作為結(jié)構(gòu)單元來研究抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的報(bào)道和研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了得到抗菌活性較高而細(xì)胞毒性相對(duì)較低的抗菌肽，從而設(shè)計(jì)并制備了一組抗菌肽，并最終篩選出抗菌肽B?？咕?B 的氨基酸序列是IIeTrpArgIIePheArgArgIIePhe抗菌肽B的設(shè)計(jì)和制備方法如下1)首先，根據(jù)抗菌肽的作用機(jī)理和氨基酸組成的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)由帶正電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、脂肪族氨基酸異亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Wie)作為基本結(jié)構(gòu)單元的一組氨基酸，即表1中的A-E五個(gè)抗菌肽；二、采用固相化學(xué)合成法，通過多肽合成儀來合成設(shè)計(jì)得到的多肽；三、將合成出來的多肽粗制品經(jīng)過反相高效液相色譜進(jìn)行純化，并利用點(diǎn)噴射質(zhì)譜進(jìn)行鑒定后，即完成多肽的制備。通過本方法制備的抗菌肽的實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)單，對(duì)得到的抗菌肽進(jìn)行抗菌和溶血活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽B不但對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革蘭氏陽性菌和陰性菌都有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。綜合來看，抗菌肽B的治
3療指數(shù)最高，細(xì)胞選擇性最佳，是一種具有較高應(yīng)用價(jià)值的抗菌肽。


圖1為抗菌肽A的質(zhì)譜圖。圖2為抗菌肽B的質(zhì)譜圖。圖3為抗菌肽C的質(zhì)譜圖。圖4為抗菌肽D的質(zhì)譜圖。圖5為抗菌肽E的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 根據(jù)抗菌肽的作用機(jī)理和氨基酸組成的特點(diǎn)，通過使用堿性氨基酸精氨酸(Arg) 殘基來提供正電荷來吸引細(xì)菌表面的負(fù)電荷，而通過脂肪族氨基酸異亮氨酸(Ile)和芳香族氨基酸苯丙氨酸(Wie)與磷脂發(fā)生疏水性作用，從而通過使得抗菌肽能對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用。依據(jù)此原理，本實(shí)施方式中共有五個(gè)抗菌肽，即表1中的A-E ；實(shí)施例2:將上述五個(gè)多肽使用多肽合成儀進(jìn)行合成，選用固相有機(jī)合成，合成方向從C端到N端逐一進(jìn)行，采用Fmoc保護(hù)合成法，具體步驟為選取已經(jīng)和C端第一個(gè)氨基酸連接的Wang樹脂，即Fmoc-A (trt) -Wang (9_芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A為C端第一個(gè)氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去雜質(zhì)；用含有20%哌啶的DMF脫除樹脂上的Fmoc保護(hù)，反應(yīng)20min，洗滌樹脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固體懸浮物即是脫保護(hù)的A-Wang。用印三酮檢測(cè)劑檢查 A-Wang脫保護(hù)的質(zhì)量。將Fmoc-B (trt)-OH (9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B為每個(gè)抗菌肽C端第二個(gè)氨基酸)與上述得到的脫保護(hù)的Wang樹脂進(jìn)行縮合反應(yīng)；然后再脫去Fmoc基團(tuán)。按照這個(gè)程序依次從C端到N端逐個(gè)延伸，直至將整個(gè)肽鏈合成完畢，當(dāng)最后一個(gè)氨基酸脫保護(hù)后，用 DMF洗滌8次，再用乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗滌8次。將三氟乙酸(TFA)三異丙基氯硅烷(TIS)水=95 2.5 2. 5 (體積比)進(jìn)行混合，配制成為切割試劑與上述得到的多肽20°C下反應(yīng)2小時(shí)，把多肽從樹脂上切割下來。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)TFA，再加入10倍左右體積的預(yù)冷無水乙醚沉淀多肽池，析出白色粉末狀固體。真空干燥，得到粗品多肽。將上述粗品多肽使用90%乙腈水溶液溶解，使用制備色譜柱進(jìn)行純化，分析型色譜柱檢測(cè)純度。半制備型高效液相色譜儀為Waters Delta Prep 4000，制備色譜柱為 WatersX-Bridge C18、5ym反相柱。洗脫液A為含有0. 1 % TFA的水溶液，B為含有0. 1 % TFA的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，洗脫方式為30 % B 65 % B的線性濃度梯度洗脫，流速為30ml/min。收集純度高于95%的餾分，并冷凍干燥。分析型高效液相色譜儀為Agilent 1100，分析型色譜柱為S印axGP-C18反相柱(4. 6mmX 150mm, 5 μ m)，洗脫液A液為0. 1 % TFA 的水溶液，B液為含0. 1% TFA的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。洗脫方式為50% B 75% B的線性濃度梯度洗脫，流速為1. Oml/min。多肽的質(zhì)譜鑒定將上述得到的多肽經(jīng)過電噴霧質(zhì)譜法分析，質(zhì)譜圖中顯示的分子量(見附圖1巧)與表一中的理論分子量基本一致，抗菌肽的純度大于95%。表1抗菌肽的氨基酸序列和分子量
權(quán)利要求
1.一種抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列為IIeTrpArgIIeWieArgArgIIeWie。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗菌肽，其特征在于，其制備方法如下1)由帶正電荷的精氨酸Arg、脂肪族的異亮氨酸Ile和芳香族的苯丙氨酸Phe作為基本結(jié)構(gòu)單元組成一組氨基酸，五個(gè)抗菌肽如下抗菌肽 A JleTrpArgIlePheArg ；抗菌肽 B =IleTrpArgIlePheArgArgIlePhe抗菌肽 C IIeTrpArgIIePheArgArgIIePheArgIIePhe抗菌肽 D IIeTrpArgIIePheArgArgIIePheArgIIePheIIeArgPhe抗菌肽 E IIeTrpArgIIePheArgArgIIePheArgIIePheIIeArgPheIIeArgPhe ；2)采用固相化學(xué)合成法，通過多肽合成儀合成五條多肽粗品；3)將合成的多肽使用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，并利用電噴霧質(zhì)譜法對(duì)合成的多肽進(jìn)行鑒定，至此完成多肽的制備；4)通過體外法檢測(cè)人工合成多肽的生物學(xué)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基酸序列為 IIeTrpArgIIeWieArgArgIIePhe的抗菌肽B具有最高的治療指數(shù)，其細(xì)胞選擇性最佳。
全文摘要
一種抗菌肽及其制備方法，其氨基酸序列為IleTrpArgIlePheArgArgIlePhe。方法如下1)利用抗菌肽的抑菌機(jī)理和氨基酸組成特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出了由異亮氨酸、精氨酸和苯丙氨酸為基本單元所組成的一組抗菌肽；2)使用多肽合成儀，進(jìn)行固相合成法合成多肽粗品；3)將合成得到的多肽使用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，并利用電噴霧質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定；4)體外活性試驗(yàn)結(jié)果表明，含有3個(gè)基本單元的抗菌肽B具有較強(qiáng)的抑菌活性和較弱的溶血活性，治療指數(shù)最高，細(xì)胞選擇性最佳，是一種具有較高應(yīng)用價(jià)值的抗菌肽。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102276691SQ20111022221
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者單安山, 李峰, 鄭燕斌, 馬清泉 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)