專利名稱：具有增強的生物學效用的干擾素-β的聚合物綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)生物化學及藥學和醫(yī)學領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供一種由水溶性聚合物(例如聚(乙二醇)及其衍生物)聯(lián)結(jié)細胞因子(例如β干擾素)產(chǎn)生綴合物的方法，相較于以標準合成方法合成的相同細胞因子的聚合物綴合物，該綴合物的效能增加。本發(fā)明也提供依該方法制作的綴合物，包含該綴合物的組合物，包含該綴合物以及組合物的試劑盒以及使用該綴合物和組合物預(yù)防、診斷以及治療各種醫(yī)學和獸醫(yī)病癥的方法。本發(fā)明也提供在某些條件下還原烷化以確定聚合物附著位點的方法。相關(guān)技術(shù)下列相關(guān)技術(shù)的描述包括解釋本案不屬于現(xiàn)有技術(shù)的部份。細胞因子是一種分泌的調(diào)控蛋白，其以內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌的方式控制細胞的生存、生長、分化、和/或效應(yīng)物功能(參見 Nicola, N. Α. (1994) in =Guidebook to Cytokines and Their Receptors, Nicola, N. A.，ed.，pp. 1-7, Oxford University Press, New York)。由于細胞因子的效能、 特異性、分子小以及較易在重組生物體中產(chǎn)生，因此具有許多潛在的治療劑用途。細胞因子及重組蛋白質(zhì)作為治療劑在發(fā)展上有二個重大阻礙其在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期短及潛在的抗原性和免疫原性。在本文及在本領(lǐng)域中，術(shù)語"抗原性"意指分子結(jié)合于已存在的抗體的能力，而術(shù)語"免疫原性"意指分子在活體內(nèi)喚起免疫反應(yīng)的能力， 不論該反應(yīng)是否涉及形成抗體("體液反應(yīng)")或刺激細胞免疫反應(yīng)。施用重組型治療性蛋白質(zhì)時，為了達到最高循環(huán)活性及減少生物利用度和降解方面的問題，經(jīng)常采取靜脈內(nèi)(i.v.)施用。然而，以i. v.施用后，小蛋白質(zhì)的半衰期通常極短(參閱例如 Mordenti，J.，等人，(1991)Pharm Res 8 :1351-1359 ；Kuwabara, T.，等人，(1995)Wiarm Res 12:1466-1469)。一般而言，健康的腎臟可保留血液中水動力半徑大于血清白蛋白(即Mokes半徑約0. 36人以及分子量約66，000道爾頓，66kDa)的蛋白質(zhì)。然而，較小型的蛋白質(zhì)，包括細胞因子，例如粒細胞集落刺激因子(“G-CSF“)、 白細胞介素-2("白細胞介素2")、干擾素干擾素-α")以及干擾素-γ ("干擾素1 “)，則經(jīng)腎小球的過濾快速地從血流中消除(Brenner, B. Μ.，等人，(1978)Am J Physiol 234 :F455-F460 ；Venkatachalam, Μ. Α.等人，(1978) Circ Res 43:337-347; Wilson,G.，(1979) J Gen Physiol74 :495-509 ；Knauf,M. J.，等人，(1988) J Biol Chem263 15064-15070 ；Kita, Y.，等人，(1990)Drug Des Deliv6 :157-167 ；Rostaing, L.，等人， (1998)，J Am Soc N印hrol9 :2344-2348)。結(jié)果，不易在施用后使循環(huán)中保有適當治療濃度的重組型小蛋白質(zhì)。因此，一般必須施用較高濃度的蛋白質(zhì)且注射次數(shù)更頻繁。該方式產(chǎn)生的療程使治療成本提高，降低病人的順服性并增加副作用的風險，例如免疫反應(yīng)。細胞以及體液免疫反應(yīng)會使在循環(huán)系統(tǒng)中重組蛋白質(zhì)的注射濃度減低，以致于抵消施用有效劑量，或?qū)е掠绊懼委煶尚У那樾危ㄇ宄铀?、中和功效及過敏性反應(yīng)(Ragnhammar，P.，等人，(1994)Blood 84 :4078-4087 ；ffadhwa,M.，等人，(1999)Clin Cancer Res 5 :1353-1361 ； Hjelm Skog，A.-L.，等人，(2001)Clin Cancer Res 7 :1163-1170 ;Li，J.，等人，(2001) Blood 98 :3241-3248 ；Basser, R. L.，等人，(2002) Blood99 :2599-2602 ；Schellekens, H.， (2002)Clin Ther 24:1720—1740)。目前已有許多研究著力于通過聚(乙二醇)(〃 PEG")的共價附著來修飾重組蛋白質(zhì)以改善上述缺點(評估于 Sherman，M.R.，等人，(1997) in =Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, Harris, J. Μ., 等人’ eds. , pp.155-169, American Chemical Society, Washington, D. C. ；Roberts, M. J.,等人，(2002)Adv Drug Deliv Rev M :459-476)。將PEG附著在蛋白質(zhì)上已顯示能在活體內(nèi)穩(wěn)定蛋白質(zhì)，改良其生物利用度和/或減低其免疫原性。(PEG共價附著至蛋白質(zhì)或其它底物，在本文中以及本領(lǐng)域中稱為"PEG化作用"。)此外，PEG化作用可顯著的增加蛋白質(zhì)的水動力半徑。當小蛋白質(zhì)，例如細胞因子，偶聯(lián)至單一長鏈的PEG(例如，其分子量至少約ISkDa)，所產(chǎn)生的綴合物的水動力半徑大于血清白蛋白，其經(jīng)由腎小球自循環(huán)系統(tǒng)中清除會顯著減緩。PEG化的組合效應(yīng)蛋白質(zhì)水解降低、免疫識別降低以及腎清除速率降低，均賦予PEG化蛋白質(zhì)作為治療劑的實質(zhì)優(yōu)點。自1970年代以來即已嘗試使用共價附著聚合物來改良各種醫(yī)藥用蛋白質(zhì)的安全性和功效(參閱，例如Davis, F. F.，等人，U. S. Patent No. 4，179，337)。一些實例包括將 PEG或聚(環(huán)氧乙烷)(〃 ΡΕ0")偶聯(lián)至腺苷脫氨酶(EC 3. 5. 4. 4)以治療重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病(Davis, S.，等人，(1981) Clin Exp Immunol 46 :649-652 ；Hershf ield, Μ. S.，等人， (1987)N Engl J Med 316:589-596)；偶聯(lián)至超氧化物岐化酶(EC 1.15.1.1)以治療炎性病癥(Saifer，Μ.，等人，美國專利第5，006, 333以及5，080, 891號)以及偶聯(lián)至尿酸氧化酶(EC 1.7.3.3)以從血液和尿液中去除過量的尿酸(Kelly，S.J.，等人，Q001)J Am Soc Nephrol 12 1001-1009 ;Williams，L. D.，等人，PCT 公告第 WO 00/07629A 3 號以及美國專利第 6，576，235 號；Sherman，Μ. R.，等人，PCT 公告第 WO 01/59078 A2 號)。PEOs以及PEk是一種由共價聯(lián)結(jié)的環(huán)氧乙烷單位所組成的聚合物。此類聚合物有下列的一般結(jié)構(gòu)R1-(OCH2CH2)n-R2其中&可為羥基(或其反應(yīng)性的衍生物)，而R1可為氫(如二羥基PEG(" PEG diol")中的)、甲基(如單甲氧基PEG(" mPEG")中的)、或其它低級烷基，例如異丙氧基 PEG或叔丁氧基PEG中的。PEG通式的參數(shù)η為聚合物中環(huán)氧乙烷單位的數(shù)目，在本文及在本領(lǐng)域中是指"聚合度"。相同通式的聚合物(其中R1SCh7烷基團)，也稱為環(huán)氧乙烷衍生物(Ya sukohchi,T.，等人，美國專利第6，455，639號)。PEGs以及PEOs可為線性、分支(Fuke, I.，等人(1994) J Control Release30 :27-34)或星形狀(Merrill, E. W. (1993) J Biomater Sci Polym Ed 5:1-11)。PEGs以及PEOs是兩性化合物，即其可溶解于水和某些有機溶劑中，且其可黏附至內(nèi)含脂質(zhì)的材料，包括有包膜病毒及動物和細菌細胞的細胞膜。 某些環(huán)氧乙烷(OCH2CH2)以及具有下列結(jié)構(gòu)的環(huán)氧丙烷的隨機或嵌段或交替共聚物
權(quán)利要求
1.一種增加非糖基化干擾素β的生物效力的方法，包含選擇性地偶聯(lián)一種或多種合成的水溶性聚合物至該干擾素β的氨基末端氨基酸上，其中該氨基-末端氨基酸位于該干擾素β的受體-結(jié)合功能域的遠端。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該生物效力在響應(yīng)于干擾素β的細胞培養(yǎng)測定法中測量。
3.權(quán)利要求1的方法，其中該一種或多種聚合物選自一種或多種聚亞烷基二醇類、一種或多種聚環(huán)氧烷、一種或多種聚乙烯醇、一種或多種聚羧酸酯、一種或多種聚(乙烯基吡咯烷酮)、一種或多種聚(氧亞乙基-氧亞甲基)、一種或多種聚(氨基酸)、一種或多種聚丙烯?；鶈徇?、一種或多種酰胺以及一種或多種烯化氧的一種或多種共聚物、一種或多種葡聚糖以及一種或多種透明質(zhì)酸。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該干擾素β具有SEQID NO 1所示的干擾素-β -Ib的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的方法，其中該干擾素β基本具有SEQID NO 1的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中該聚合物共價偶聯(lián)至該氨基末端氨基酸的α氨基上。
7.權(quán)利要求6的方法，其中該聚合物與該α氨基的共價偶聯(lián)是經(jīng)由仲胺連接的。
8.權(quán)利要求1的方法，其中該聚合物偶聯(lián)至該氨基末端氨基酸的化學反應(yīng)性側(cè)鏈基團上。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該反應(yīng)性側(cè)鏈是醛基，其是通過選擇性氧化裂解干擾素β 的氨基末端絲氨酸殘基而引入的。
10.權(quán)利要求3的方法，其中該聚合物是聚亞烷基二醇。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該聚亞烷基二醇選自聚(乙二醇)、單甲氧基聚(乙二醇)以及單羥基-聚(乙二醇)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該聚亞烷基二醇是單甲氧基聚(乙二醇)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中該聚亞烷基二醇是單羥基聚(乙二醇)。
14.權(quán)利要求10的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為lkDa-lOOkDa。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為8kDa-14kDa。
16.權(quán)利要求14的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為10kDa-30kDa。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為18kDa-22kDa。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為20kDa。
19.權(quán)利要求14的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為30kDa。
20.權(quán)利要求1的方法，其中該聚合物在該氨基末端氨基酸處偶聯(lián)至該干擾素β上模仿了該干擾素β糖基化作用或過糖基化作用的有利效應(yīng)。
21.一種綴合物，由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生。
22.—種藥物組合物，包含一種或多種權(quán)利要求21的綴合物及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體。
23.一種綴合物，包含在其氨基末端氨基酸處共價偶聯(lián)至一種或多種合成的水溶性聚合物上的干擾素β，其中該干擾素β與未如此偶聯(lián)的相同干擾素β相比其生物效力有所增加。
24.一種綴合物，包含在其氨基末端氨基酸處共價偶聯(lián)至一種或多種合成的水溶性聚合物上的干擾素β，其中該干擾素β綴合物的生物效力與其中一種或多種相同的合成水溶性聚合物隨機偶聯(lián)至溶劑可接近的賴氨酸殘基上的相同干擾素β的綴合物的生物效力相比有所增加。
25.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該綴合物的生物效力在響應(yīng)于干擾素β的細胞培養(yǎng)測定法中測量。
26.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該干擾素β具有SEQID NO :1中所示的干擾素-β-Ib的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求沈的綴合物，其中該干擾素-β-lb的生物效力增加至約等于具有SEQID NO 2所示氨基酸序列且于天冬酰胺殘基80處糖基化的干擾素- β -Ia的效力。
28.權(quán)利要求25的綴合物，其中所述響應(yīng)于干擾素β的細胞培養(yǎng)測定法選自抗增殖測定法、抗病毒測定法、信號傳導測定法以及基因活化測定法。
29.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該一種或多種聚合物選自一種或多種聚亞烷基二醇類、一種或多種聚環(huán)氧烷、一種或多種聚乙烯醇、一種或多種聚羧酸酯、一種或多種聚 (乙烯基吡咯烷酮)、一種或多種聚(氧亞乙基-氧亞甲基)、一種或多種聚(氨基酸)、一種或多種聚丙烯酰基嗎啉、一種或多種酰胺以及一種或多種烯化氧的一種或多種共聚物、 一種或多種葡聚糖以及一種或多種透明質(zhì)酸。
30.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該聚合物共價偶聯(lián)至該干擾素β的氨基-末端氨基酸的α氨基上。
31.權(quán)利要求30的綴合物，其中該聚合物經(jīng)由仲胺連接共價偶聯(lián)至該α氨基上。
32.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該聚合物偶聯(lián)至該氨基末端氨基酸的化學反應(yīng)性側(cè)鏈基團上。
33.權(quán)利要求32的綴合物，其中該反應(yīng)性側(cè)鏈是醛基，其是通過干擾素β氨基末端絲氨酸殘基的選擇性氧化裂解而引入的。
34.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該水溶性聚合物是聚亞烷基二醇。
35.權(quán)利要求34的綴合物，其中該聚亞烷基二醇選自聚(乙二醇)、單甲氧基聚(乙二醇)以及單羥基聚(乙二醇)。
36.權(quán)利要求35的綴合物，其中該聚亞烷基二醇是單甲氧基聚(乙二醇)。
37.權(quán)利要求35的綴合物，其中該聚亞烷基二醇是單羥基聚(乙二醇)。
38.權(quán)利要求34的綴合物，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為lkDa-lOOkDa。
39.權(quán)利要求38的綴合物，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為8kDa-14kDa。
40.權(quán)利要求38的綴合物，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為10kDa-30kDa。
41.權(quán)利要求40的綴合物，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為18kDa-22kDa。
42.權(quán)利要求41的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為20kDa。
43.權(quán)利要求38的方法，其中該聚亞烷基二醇具有的分子量約為30kDa。
44.權(quán)利要求23或M的綴合物，其中該聚合物在該氨基末端氨基酸處偶聯(lián)至該干擾素 β上模仿了該干擾素β的糖基化作用或過糖基化作用的有利效應(yīng)。
45.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求21、23以及M中任何一項的綴合物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
46.一種試劑盒，包含權(quán)利要求21的綴合物。
47.一種試劑盒，包含權(quán)利要求23或M的綴合物。
48.一種試劑盒，包含權(quán)利要求22的藥物組合物。
49.一種試劑盒，包含權(quán)利要求45的藥物組合物。
50.一種預(yù)防、診斷、或治療患有或易患有干擾素β響應(yīng)性身體病癥的動物中所述身體病癥的方法，包括給所述動物施用有效量的權(quán)利要求21、23和25中任一項的綴合物。
51.一種預(yù)防、診斷、或治療患有或易患有干擾素β響應(yīng)性身體病癥的動物中所述身體病癥的方法，包括給所述動物施用有效量的權(quán)利要求22或45的藥物組合物。
52.權(quán)利要求50的方法，其中該動物是哺乳動物。
53.權(quán)利要求51的方法，其中該動物是哺乳動物。
54.權(quán)利要求52或53的方法，其中該哺乳動物是人。
55.權(quán)利要求50的方法，其中該干擾素β響應(yīng)性身體病癥選自癌癥、傳染病、神經(jīng)變性病癥、自體免疫病癥以及遺傳疾病。
56.權(quán)利要求55的方法，其中該癌癥選自乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、 肺癌、白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、胃腸的癌癥、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、骨癌、神經(jīng)癌癥、頭部以及頸部癌癥、皮膚癌、癌、肉瘤、腺瘤以及骨髓瘤。
57.權(quán)利要求55的方法，其中該干擾素β響應(yīng)性傳染病選自病毒性肝炎、親心性病毒以及HIV/AIDS引起的疾病。
58.權(quán)利要求55的方法，其中該干擾素β響應(yīng)性神經(jīng)變性疾病是多發(fā)性硬化。
59.權(quán)利要求58的方法，其中該多發(fā)性硬化選自復(fù)發(fā)-緩解性多發(fā)性硬化、原發(fā)性進行性多發(fā)性硬化以及繼發(fā)性進行性多發(fā)性硬化。
60.權(quán)利要求51的方法，其中該干擾素β響應(yīng)性身體病癥選自癌癥、傳染病、神經(jīng)變性病癥、自體免疫病癥以及遺傳疾病。
61.權(quán)利要求60的方法，其中該癌癥選自乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、 肺癌、白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、胃腸的癌癥、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、骨癌、神經(jīng)癌癥、頭部以及頸部癌癥、皮膚癌、癌、肉瘤、腺瘤以及骨髓瘤。
62.權(quán)利要求60的方法，其中該干擾素β響應(yīng)性傳染病選自病毒性肝炎、親心性病毒以及HIV/AIDS引起的疾病。
63.權(quán)利要求60的方法，其中該干擾素β反應(yīng)性神經(jīng)變性病癥是多發(fā)性硬化。
64.權(quán)利要求63的方法，其中該多發(fā)性硬化選自復(fù)發(fā)-緩解性多發(fā)性硬化、原發(fā)性進行性多發(fā)性硬化以及繼發(fā)性進行性多發(fā)性硬化。
65.一種用于測定以還原性烷基化合成的聚合物-蛋白質(zhì)綴合物中連接到具有N-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)的氨基末端上的聚合物數(shù)量的方法，該方法包括a)將所述綴合物和充分量的氧化劑反應(yīng)充分的時間使該聚合物從絲氨酸或蘇氨酸殘基裂解下來；以及b)測量該制劑中非綴合蛋白質(zhì)部分的增加量。
66.權(quán)利要求65的方法，其中該蛋白質(zhì)是細胞因子。
67.權(quán)利要求66的方法，其中該細胞因子是干擾素β。
68.權(quán)利要求66的方法，其中該細胞因子是巨核細胞生長和發(fā)生因子。
69.權(quán)利要求65的方法，其中該氧化劑包含高碘酸鹽，其選自偏高碘酸鈉、偏高碘酸鉀、偏高碘酸鋰、高碘酸鈣、高碘酸鋇以及高碘酸。
70.權(quán)利要求65的方法，其中該測量是以一種或多種選自下列的方法進行的大小-排阻層析法、反相層析法、凝膠電泳法、毛細管電泳法、超速離心法、超濾法、光散射以及質(zhì)譜法。
71.一種用于選擇性氧化裂解生物活性蛋白質(zhì)的N-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基、而不氧化該生物活性蛋白質(zhì)的功能必需氨基酸殘基的方法，包括a)調(diào)節(jié)該生物活性蛋白質(zhì)溶液的氫離子濃度至pH介于約7至約8之間；b)將該生物活性蛋白質(zhì)溶液以每摩爾生物活性蛋白質(zhì)對約0.5至約5摩爾高碘酸鹽的比例與高碘酸鹽混合；以及c)令該混合物在溫度介于約2°C至約40°C之間溫育至少一個小時。
72.權(quán)利要求71的方法，其中該生物活性蛋白質(zhì)是干擾素β。
73.權(quán)利要求72的方法，其中該干擾素β為具有SEQID NO :1所示氨基酸序列的干擾素-β-lb。
74.—種增加干擾素-β -Ib制劑的生物效力的方法，包括從該干擾素-β -Ib制劑中除去一種或多種抑制性成分。
75.權(quán)利要求74的方法，其中使用一種或多種層析法從該干擾素-β-Ib制劑中除去一種或多種抑制性成分，該層析法選自大小排阻層析法、反相層析法、疏水性相互作用層析法以及親和層析法。
76.權(quán)利要求74的方法，其中該干擾素-β-Ib制劑的生物效力是在響應(yīng)于干擾素β 的細胞培養(yǎng)測定法中測量的。
77.權(quán)利要求76的方法，其中該干擾素β響應(yīng)性細胞培養(yǎng)測定法選自抗增殖測定法、抗病毒測定法、信號傳導測定法以及基因活化測定法。
全文摘要
提供了合成細胞因子和其受體結(jié)合拮抗劑，特別是非糖基化的干擾素-β的聚合物綴合物的方法，該綴合物保留了非常高的生物學效能。根據(jù)本發(fā)明方法制備聚合物綴合物消除或避免了受體-配體相互作用的空間抑制，該空間抑制通常產(chǎn)生于聚合物向細胞因子的受體結(jié)合區(qū)域及其激動性和拮抗性類似物的附著。本發(fā)明也提供了由這些方法生產(chǎn)的綴合物和組合物。本發(fā)明也提供了含有此類綴合物和/或組合物的試劑盒，以及這些綴合物和組合物在各種診斷、預(yù)防、治療和生物處理應(yīng)用中的使用方法，包括治療多發(fā)性硬化。
文檔編號A61P25/28GK102319437SQ20111022433
公開日2012年1月18日 申請日期2003年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者梅瑞·R·歇爾曼, 艾爾·D·威廉斯, 艾雷沙·L·馬丁納, 馬克·G·P·塞佛 申請人:山景醫(yī)藥公司