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穩(wěn)定的油產(chǎn)品及其制備方法和提高乳酸桿菌菌株存活的方法

文檔序號:866077閱讀:679來源:國知局
專利名稱:穩(wěn)定的油產(chǎn)品及其制備方法和提高乳酸桿菌菌株存活的方法
穩(wěn)定的油產(chǎn)品及其制備方法和提高乳酸桿菌菌株存活的方
法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及選擇和利用乳酸菌以改進用于哺育嬰兒的母乳。相關(guān)技術(shù)的說明過敏性疾病的衛(wèi)生學(xué)認為,在工業(yè)化世界中的環(huán)境變化將導(dǎo)致在幼年與微生物的接觸減少從而導(dǎo)致在生長表皮出現(xiàn)過敏性疾病,例如特應(yīng)性濕疹、過敏性鼻膜炎、和哮喘。 一個這樣的環(huán)境變化被認為是由于衛(wèi)生條件、生活標準、飲食習(xí)慣等的改善而導(dǎo)致食入的各種天然微生物種類的變化。這導(dǎo)致我們自然腸菌群組成的變化(《過敏與臨床免疫期刊》, 2001 ; 108 =516-520)并且也改變了哺乳母親的母乳成分。這樣的變化與普遍的各種類型的過敏反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。還有報道說,大家庭中較后出生的嬰兒比其那些出生早的兄弟姐妹(家中的第一個)患上過敏反應(yīng)的危險性要小。這也暗示著母親的母乳隨著懷孕的次數(shù)而“改進”。人乳中包含在免疫系統(tǒng)很重要的各種成分,例如巨噬細胞、免疫球蛋白、或抗生素蛋白,其被認為能使母乳哺育的后代的胃腸道和呼吸道避免感染和發(fā)炎。此外,其它潛在的免疫調(diào)節(jié)因子的存在(例如,寡糖復(fù)合物、生長因子、酶、激素、或細胞因子)已經(jīng)被討論過。 人乳中這些有益的特性加上高營養(yǎng)獲得性和低抗原濃度是目前兒科專家認為母乳是嬰兒最好的食物的生理學(xué)基礎(chǔ),尤其對那些具有過敏反應(yīng)史的家庭。因此,已經(jīng)知道母乳包含一系列能夠?qū)雰旱倪^敏反應(yīng)發(fā)展造成潛在影響的細胞因子和趨化因子。此前已有報道說調(diào)節(jié)過敏性反應(yīng)的成分,例如細胞因子、趨化因子、和粘附分子,被隱藏在哺乳期的各個階段乳液中(S Rudloff等,過敏反應(yīng)1999,54,206-211)。 細胞因子或趨化因子對于母乳哺育的嬰兒可能是有益的也可能是不利的。還已經(jīng)知道,由動物乳汁傳遞的細胞因子具有通過后代GI通道仍存活的能力。例如,假定斷奶之前的存活是由于通過母乳傳遞的TGF-beta-Ι的結(jié)果,那么在斷奶之后純合 TGF-beta-Ι-敲除小鼠死于普遍的炎癥疾病(Kulkarni AB 等,Am J Pathology 1993 ;143, 3-9)。TGF-beta以各種方式通過腸并保持活性。IL-10也可以這樣的方式保持活性,從而由母乳傳遞來的IL-10到達GI通道,并能潛在地產(chǎn)生有益的抗炎效果。而且,Hawkes JS等(Lipids 2001 Oct 36 :1179-81)報道說,長鏈多聚不飽和脂肪酸與包括細胞因子生產(chǎn)在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)的各方面相關(guān)。這一研究的目的是為了調(diào)查母親飲食補充富含二十二碳六烯酸(DHA)的金槍魚油的效果,其在一定濃度下在母乳中可以轉(zhuǎn)變成生長因子beta 1 (TGF-beta-1)和TGF-beta-2。在這項隨機的飲食干預(yù)試驗中,嬰兒的母親日常補充2000mg油,其包含空白對照劑(placebo) (η = 40),或300mg DHA (η = 40),或者600mg DHA(η = 40) 0在母乳和淋巴液中DHA的升高與飲食中DHA成正比。在乳液DHA 狀態(tài)、TGF-beta-Ι水平、以及TGF-beta-2水平之間彼此無關(guān)聯(lián)。IL-10是一種已被廣泛討論和接受的抗炎癥細胞因子。這暗示著其在嬰兒的GI通道中具有抗炎癥效果。這對于母乳哺育的嬰兒是有好處的,通常認為母乳在某種程度上幫助嬰兒抗炎,嬰兒在生命早期不應(yīng)該對腸道中的病原體/感染過度反應(yīng)。而且,動物數(shù)據(jù)指出在乳液中IL-10可能有利于后代。一個澳大利亞研究小組觀察了一個動物模型,其中觀察了對蜱的過敏反應(yīng)。對于蜱的皮膚刺痛檢測(SPT)陰性的動物具有IL-10和IL-4產(chǎn)物, 具有IL-10減弱了的IgE (過敏性應(yīng)答)而動物沒有出現(xiàn)過敏反應(yīng)。在過敏性SPT+ve (組氨酸)動物中,只產(chǎn)生了 IL-4而沒有IL-10產(chǎn)物。因此IgE沒有被降低而過敏反應(yīng)發(fā)生了。 因此IL-10減弱IgE作用引發(fā)的過敏反應(yīng)并且可以防止過敏反應(yīng)發(fā)生。TGF-beta-2(轉(zhuǎn)移生長因子)也是一種被廣泛討論的生長因子/細胞因子。其來源包括例如血小板,其產(chǎn)生毫克數(shù)量的TGF-beta/千克。該因子及其同源物(見以下)也能從其它組織(微克TGF/kg)中分離出來并且在脾臟和骨組織中占優(yōu)勢。人乳中也包含該因子并且其合成也是通過例如巨噬細胞(TGF-beta-Ι)、淋巴細胞(TGF-beta-Ι)、內(nèi)皮細胞 (TGF-beta-Ι)、角質(zhì)形成細胞(TGF-beta-2)、粒層細胞(TGF-beta-2)、軟骨(TGF-beta-l)、 成膠質(zhì)細胞瘤細胞(TGF-beta-2)、白血病細胞(TGF-beta-l)。依賴于細胞類型和條件,TGF-beta的分泌可以由一系列不同的刺激因子誘導(dǎo)包括類固醇、視黃醛衍生物、EGF(表皮生長因子)、NGF、淋巴細胞活化劑、維生素D3、和 ILl0 TGF-beta的合成可以被EGF、FGF(成纖維細胞生長因子)、地塞米松、鈣、視黃醛衍生物和卵泡刺激激素抑制。TGF-beta還影響其自身基因的表達而這可能在傷口愈合中是重要的。TGF-beta存在至少五種同源物,已知為TGF-beta-1、TGF-beta-2, TGF-beta-3、 TGF-beta-4、TGF-beta_5,而與TGF-alpha無關(guān)。這些同源物的氨基酸顯示出70-80%的同源性。TGF-beta-l是普遍形式并且?guī)缀鯚o處不在,而其他同源物只在更加局限的光譜的細胞和組織中表達。從不同種類中分離出來的同源物在進化上很接近并且具有98%的相同序列。成年人、豬、猿猴和牛的TGF-beta-l是相同的而與鼠的TGF-beta-Ι在一個氨基酸位置上有所不同。人和雞的TGF-beta-l也是相同的。還有報道稱轉(zhuǎn)移生長因子beta (TGF-beta)家族的成員是多效細胞因子,在組織形態(tài)建成和生長中扮演關(guān)鍵角色Qngman WV, Bioessays 2002 Oct 24:904-14)。 TGF-beta-l、TGF-beta-2和TGF-beta-3在哺乳動物生殖組織中含量豐富,其中發(fā)育和循環(huán)重建持續(xù)至出生后和成人期。TGF-beta的潛在角色在性腺和第二性器官發(fā)育、精子發(fā)生和卵巢功能、懷孕的免疫調(diào)節(jié)、胚胎移植和胎盤發(fā)育中被確認。Rautava 等在 Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition38 378-388, April 2004 中認為 TGF-beta-2 和 IL-10 表現(xiàn)出了在 IL-10 生產(chǎn)中與 TGF-beta-2 的協(xié)同作用。乳腺炎是乳房的一種炎癥,其通常以觸痛和紅斑及某些時候發(fā)熱為特征,并且與 TGF-beta-2相關(guān)。在乳腺炎期間,乳腺泡細胞的緊密連接被打開,該過程伴隨著鈉、炎癥細胞、以及炎癥和免疫調(diào)節(jié)劑在母乳中的升高。乳腺炎通常是單側(cè)的,并且在母乳哺育的最初幾周最常出現(xiàn)。在工業(yè)化國家,乳腺炎通常被認為是一種低發(fā)病率的問題,受影響的婦女通常由助產(chǎn)士或護士治療。而經(jīng)過對美國、芬蘭和澳大利亞哺乳婦女大規(guī)模長時間的調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳腺炎比以前認為的要更加普遍(Semba R.,Annals of the New York Academy of Sciences. November 2000 ;918 :156-62),認為大約有20-33%的婦女可能發(fā)展為臨床上明顯的乳腺炎。而哺乳婦女中亞臨床乳腺炎的數(shù)量甚至就更多。
而且最近發(fā)現(xiàn)乳腺炎與母乳中更高的人免疫缺陷病毒(HIV)量以及更高的母嬰傳播 HIV 風(fēng)險相關(guān)聯(lián)(Semba,R. D.,N. Kumwenda, Τ. E. Taha,等 1999. Mastitis and immunological factors in breast milk of human Immunodeficiency virus-infected women. J. Hum. Lact. 15 (4) :301-306)。母乳中的TGF-beta-2大部分是上皮起源的,即使它由許多其它細胞合成,包括 B-細胞和T-細胞。因此TGF-beta-2水平的提高可能是亞臨床乳腺發(fā)炎的一種調(diào)節(jié)劑或一種結(jié)果。在母乳中鈉和鉀的比率(Na/K比)據(jù)說是一種公知的感染和亞臨床乳腺發(fā)炎的預(yù)測因子。而且,KalIiomaki等在 J Allergy Clin Immunol. 1999 Dec ; 104 (6) :1251-7 中認為初乳中的TGF-beta可以防止在整個母乳哺育期間過敏性疾病的發(fā)生并提高人體中特異 IgA的產(chǎn)量。而且,人體和其他哺乳動物體的各種不同部分被許多不同種類的細菌所居住,包括很多不同種類的乳酸桿菌。這樣的細菌很多時候與它們的宿主共生,給與宿主各種有益的作用,目前已知是不同的并且取決于實際的菌株。例如,不同的乳酸菌菌株,即,羅伊乳酸桿菌SD2112,具有特異的抗原,或位于其表面,或通過細菌釋放于母親的胃腸道中。例如,在 Valeur等,AEM,70,1176-1181 (2004)的數(shù)據(jù)中顯示食入的羅伊乳酸桿菌SD2112可以影響健康人回腸中CD4+T-伴侶細胞的水平。這樣的觀察也在哺乳動物種類和禽類中完成,其顯示這可能是腸菌群和宿主之間的一個功能信號系統(tǒng)。通過所謂的腸-乳腺聯(lián)系,來自活性菌株的抗原被保持活性運輸?shù)搅馨蛥^(qū)域,即派爾淋巴集結(jié)(Peyer' s patches),在GI通道的上皮之下。在上皮抗原-特異性的B-cells從GI通道經(jīng)過循環(huán)而移動身體內(nèi)其它粘膜包括唾液和乳腺的之后,上皮抗原-特異性的B-cells隨后被激活。這些細胞上特異分子的表達被認為引導(dǎo)它們粘附在這些組織上。一旦在乳腺中,這些免疫細胞隨后就引發(fā)其它過程從而確定局部所產(chǎn)生的細胞因子的水平。通過腸-乳腺聯(lián)系的這種類型的信號被證明促進母乳中IgA的分泌并且還非??赡軕?yīng)用于細胞因子的產(chǎn)生。較早的時候有人建議(Laiho等,Pediatric Research 53 :642_647,2003)所觀察到的母乳中營養(yǎng)和炎癥因子之間的關(guān)系顯示通過對母親的飲食進行干涉有可能影響母乳的免疫學(xué)特性。同一研究小組注意到患有過敏性疾病的母親與沒有患病的母親相比, 乳液中的TGF-beta-2濃度較低。在他們手中檢測了 IL-10,只是在低水平并且頻率自然, 在患病和不患病的母親乳液中沒有不同。這說明對過敏性疾病的抵抗主要是通過誘導(dǎo) TGF-beta-2和IL-10的口服耐受量,而且尤其是母乳中TGF-beta-2可能在過敏性疾病的防治中扮演關(guān)鍵角色。然而,Weiner H.在 Microbes and Infection, Volume 3,Issue 11, September2001, pages 947-954中報道說,由于通過口服抗原所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)T細胞是在一種特異性抗原中被觸發(fā)的,但是在一種非特異性抗原中會被抑制,當(dāng)它們在靶器官中遇到食入的自身抗原時會調(diào)節(jié)旁路抑制。因此,粘膜耐受量可以被用于治療在自然狀態(tài)因不具有自身免疫而產(chǎn)生的發(fā)炎。不同的乳酸桿菌種類,包括羅伊乳酸桿菌,已被用于所謂生物制劑的形成,意味著將存活的和有益的微生物提供給一種動物,包括人。羅伊乳酸桿菌是動物胃腸道中最常見的居民之一,通常發(fā)現(xiàn)在腸中,偶爾見于包括人的生殖道、母乳和健康動物口腔中。已知它具有抗菌活性。例如,參見美國專利 Nos. 5,439,678,5,458,875,5,534,253,5,837,238,和
55,849,2890當(dāng)羅伊乳酸桿菌細胞在甘油存在的情況下生活在厭氧條件時,它們所產(chǎn)生的抗生素物質(zhì)被稱為羅伊素(B-羥基-丙醛)。較早已有報道說乳酸菌被用于防止和治療各種類型的過敏反應(yīng)例如可參見如下專利或?qū)@暾?,Stadler等人的EP 1239032公開了新的重組菌株,Clancy等的 W001/37865公開了通過乳酸桿菌降低IgE的量。因此,本發(fā)明的目的之一是提供經(jīng)過選擇的乳酸菌和其成分,用于改進哺育嬰兒的母乳,和進行這種選擇的方法。更具體地說,本發(fā)明的目的是提高在母乳中抗炎癥細胞因子IL-10的水平以減少哺育嬰兒發(fā)生過敏反應(yīng)的危險性,同時減少母乳中TGF-beta-2的量以減少哺乳的母親發(fā)生乳腺炎的危險性。本發(fā)明的一個目的是在母乳哺育之前或期間通過給予母親經(jīng)選擇的、特異的乳酸菌株來彌補微生物菌群的不良變化。本發(fā)明的另一目的是采用這里所描述的或類似的方法來選擇區(qū)分受測菌株在相關(guān)細胞類型上的特異細胞因子影響,并且用這樣的特定乳酸菌株作為母親的飲食成分,以刺激IL-10在母乳中的產(chǎn)量提高,同時由于降低TGF-beta-2水平,指示在母乳乳腺和其他組織亞臨床發(fā)炎水平的降低,因而減少了發(fā)生乳腺炎的危險性。乳腺炎和亞臨床乳腺炎被認為妨礙母乳哺育而不利于嬰兒,而通過本發(fā)明的方法提供所選擇的乳酸桿菌可以改進母親的健康并使她們能哺育更長時間。本發(fā)明的又一目的是提供包含所述菌株、突變體、代謝體或其成分的產(chǎn)品,包括制劑,用于給動物包括人的服用。其它目的和優(yōu)點將通過以下說明和權(quán)利要求而更加清楚。發(fā)明概述本發(fā)明包括乳酸桿菌,及其成分,其特性經(jīng)過選擇以改進用于哺育嬰兒的母乳,更精確的說是提高抗炎癥細胞因子IL-10在母乳中的水平從而減少所哺育嬰兒發(fā)生過敏反應(yīng)的危險性,同時降低誘因并因此降低TGF-beta-2在母乳中的量,這意味著降低了哺乳的母親發(fā)生乳腺炎的危險性,從而提高了哺乳能力和為幼兒提供最佳保護和最佳生長。這里,本發(fā)明還包括選擇這樣的乳酸桿菌菌株的方法。本發(fā)明還包括一種在調(diào)配油產(chǎn)品中保存活的乳酸桿菌,作為活性成分平均分送的新方法。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將通過以下說明內(nèi)容和權(quán)利要求而更加清楚。附圖簡要說明

圖1是可用于制造本發(fā)明的產(chǎn)品的制造工藝流程圖。發(fā)明詳細說明和優(yōu)選實施例本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品用于改進哺育嬰兒的母乳,更準確地說,提供了一種產(chǎn)品以提高抗炎癥細胞因子IL-10在母乳中的水平,并且降低被哺育嬰兒發(fā)生過敏反應(yīng)的危險性,同時減少觸發(fā)細胞信號物質(zhì)(TGF)產(chǎn)生的原因因子也就是TGF-beta-2在乳液中的量,從而降低哺乳的母親發(fā)生乳腺炎的危險性。與本發(fā)明相關(guān)的TGF-beta-2的降低被認為是一種消耗所選擇的乳酸菌產(chǎn)生的抗炎效果,意味著在最近日常攝入細菌的乳酸菌組中亞臨床乳腺炎降低。這里本發(fā)明所選擇的菌株的一個例子是羅伊乳酸桿菌SD2112(ATCC 55730)。在臨床試驗中,在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中,在分析中僅僅有三種因子與母親初乳中IL-10的水平相關(guān)a)采用或不采用所選擇的乳酸菌治療;b)母親以前所生的孩子的數(shù)量; 以及c)以前懷孕的次數(shù)。因此,母親懷孕次數(shù)或嬰兒數(shù)量越多,她的初乳中IL-10就越多。 在分娩以前給予懷孕母親4周的特異選擇的乳酸菌也能提高初乳中IL-10的水平而不要求以前懷過孕。已知在某種情況下提高IL-10的系統(tǒng)表達還可防止I型糖尿病,因此根據(jù)本發(fā)明所選擇的菌株也可用于該目的。這里所用的選擇方法中,用于誘導(dǎo)母乳中IL-10,并顯示TGF-beta-2降低的最佳菌株,是采用一個已建立的鼠模型和傳統(tǒng)分析方法來選擇的。其它類似在乳液中檢測細胞因子產(chǎn)物的方法也可采用。其細節(jié)將通過例子而被更清楚的理解。本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)選包含所選擇菌株的存活細胞;但是,如果這樣細胞的分離的代謝體或部分對菌株存活細胞的活性是可靠的,本發(fā)明的產(chǎn)品可以包括這樣的代謝體或部分于存活細胞之外或替代它。本發(fā)明的產(chǎn)品可以是婦女使用的任何產(chǎn)品,例如油滴產(chǎn)品、食品、片劑、膠囊、粉囊、以及類似物。特別適用于本發(fā)明的產(chǎn)品包括一種油滴(如實施例3),其有助于維持活性成份穩(wěn)定較長時間。乳酸桿菌細胞可以被用于油的成分中以提高細菌的穩(wěn)定性,見于例子Gehrman等的U. S.專利4518696。但是在目前乳酸菌在油和脂肪中存在的形式中我們沒有發(fā)現(xiàn)包含如這里例子所提到的重要步驟,即在成形前通過真空的方式干燥油以提高細菌培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。本發(fā)明產(chǎn)品中為達到效果所需要的所選擇乳酸桿菌細胞的濃度取決于食物的類型和被攝取的食物量(或在口腔中使用一種非食物咀嚼治療產(chǎn)品的時間),但是產(chǎn)品的日常攝入量通常優(yōu)選等于大約IO5-IO8CFU(菌落形成單位)或更多。數(shù)量達到大約 1010-10nCFU是可能的,并且能被用于提高效果而不會影響產(chǎn)品的感官特性(其味道或氣味)。當(dāng)產(chǎn)品是一種酸乳或其他乳酸發(fā)酵產(chǎn)品時,生產(chǎn)產(chǎn)品的乳酸發(fā)酵菌株優(yōu)選是標準培養(yǎng)基(例如,在酸乳中S. thermophilus和L. bulgaricus)。重要的是根據(jù)本發(fā)明所選擇的菌株具有預(yù)期的細胞因子效應(yīng),與產(chǎn)品中所用的任何標準培養(yǎng)基相容,因而所采用的每個菌株重要特性是不被其他其它菌株的使用所影響。這能通過本領(lǐng)域已知的篩選檢測而確定。 用于本發(fā)明的菌株可以在產(chǎn)品發(fā)酵之前或之后加入,水平大約為酸乳形式每天IO6-IO8CFU 或如上討論的更多。優(yōu)選地,本發(fā)明產(chǎn)品不包括其它抗細菌成分,至少沒有抑制或殺傷所選擇的乳酸桿菌菌株、或代謝體或其成分的物質(zhì)、或影響其活性的物質(zhì)。乳酸桿菌菌株或代謝體或其成分,可以以本領(lǐng)域公知的方式加入混合到原料中以配制特定類型的產(chǎn)品。在采用細胞并且如果制備所選擇的食物或本發(fā)明的其它產(chǎn)品時,需要一個加熱步驟,乳酸桿菌菌株應(yīng)該在加熱之后被加入。一旦所選擇的乳酸桿菌細胞位于產(chǎn)品中,優(yōu)選的是不要將產(chǎn)品加熱至60-70°C或以上至一個較長時間。本發(fā)明的特征將結(jié)合以下例子得到更清楚的理解,其不是對本發(fā)明的限制。實施例1 選擇菌株的方法根據(jù)本發(fā)明所采用的乳酸桿菌菌株的選擇方法可以通過以下步驟進行wiitmψn-io 的產(chǎn)量禾口 TGF-beta-2的減少量這是選擇方法的一個例子;本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對該方法作出一定變換和替代,而不脫離本發(fā)明的范圍。材料和方法動物51只無菌的BALB/c小鼠(雄性和雌性)從Wisconsin University, USA購買。小鼠被裝入無菌塑料薄膜運載箱中。15只小鼠被轉(zhuǎn)移入3個隔離箱中(隔離箱#2,3, 和4)。兩籠每個包含2雄和4雌的被放置在隔離箱#1 (繁殖)中。動物處理小鼠被放置在無菌可伸縮薄膜隔離箱中(Class Biologically Clean, Ltd, Madison,WI,USA)。隔離箱采用含有0. 1% Naconal (Stepan Co.,Rocksport,IL. USA)的2% 過氧乙酸(FMC Corporation,Philadelphia,PA,USA)溶液滅菌。5至6只小鼠被放置在過氧乙酸滅菌的帶有不銹鋼絲蓋子的聚苯乙烯籠中。同樣性別的小鼠被放置在每個籠中。小鼠采用熱壓消毒的嚙齒類飼料 Agway rodent chow 3500(Agway, Granville, Creedmoore, NC, USA)喂養(yǎng)。食物、水和墊褥均被高熱高壓消毒。食物和墊褥在不銹鋼圓筒中高熱高壓消毒然后無菌轉(zhuǎn)移入隔離箱。瓶裝的可觸發(fā)水高熱高壓消毒然后在放入隔離箱時用過氧乙酸滅菌。所有小鼠隨意接受食物和水。食物和水的水平每天進行檢查。墊褥一個星期更換一次。動物被維持在一個12小時的白天/黑夜循環(huán)中。室內(nèi)溫度和相對濕度每天進行檢查。細菌乳酸菌的檢測采用生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進行鑒定和定性。乳酸桿菌首先在 IOml 的 Man-Rogosa-Sharp (MRS)培養(yǎng)基(BBL, Cockeysville, MD)中生長,在 37°C中孵育18小時然后轉(zhuǎn)移至90ml的MRS中,在37°C中孵育18小時然后轉(zhuǎn)移至IOOOml的MRS中。 在37°C中孵育18小時,培養(yǎng)基在一臺冰凍離心機(S0RVALL RC2-B,S0RVALL, Norwalk, CN, USA)中以3000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘,棄除上清液,采用無菌磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗沉淀兩次,以3000rpm離心10分鐘。每個菌株的沉淀采用30ml的PBS再懸浮。培養(yǎng)基被放置在 1. 2-ml冷凍管中并且存放在-70°C直至使用。在將細菌提供給小鼠之前,檢查培養(yǎng)基的純度和濃度。乳酸桿菌懸浮液連續(xù)的1/10稀釋液被培養(yǎng)在具有1. 5%瓊脂的MRS培養(yǎng)基平板上并且在包含厭氧產(chǎn)物(Anaero Gen Oxoid Ltd. , Wake Road, Basingstoke, Hampshire, England, GB)的厭氧罐中(GasPaK :BBL, Cockeysville, MD, USA)在 37°C孵育 48 小時。檢查培養(yǎng)基的克隆形態(tài)和羅伊素產(chǎn)量。檢測處理(在本實施例中)對照菌株羅伊乳酸桿菌SD2112,ATCC 55730.菌株乳酸桿菌4000菌株乳酸桿菌4020實施例2 乳酸桿菌克隆的確定在小鼠被放入隔離箱中之后一天,取自每個籠中小鼠的糞便樣本被檢測微生物的存在。從11:00am至7:00pm小鼠被禁止飲水。這段時期之后,1. 2ml的乳酸菌懸浮液被加入到含有200ml水的瓶中并提供給小鼠。隔離箱#2中的小鼠接受羅伊乳酸桿菌SD2112。 加入水中的懸浮液含油Z.OxKTcfu/ml的羅伊乳酸桿菌SD2112。隔離箱#4中的小鼠接收乳酸桿菌4000菌株,而隔離箱#5中的小鼠接收乳酸桿菌4020菌株。加入到每瓶水中的乳酸菌懸浮液含有3. Ox 1010cfu/mL·隔離箱#3中的小鼠僅僅接受水(對照)。來自每個隔離箱中的小鼠(籠組)的糞便樣本(10小球)每周取一次,以檢測乳酸菌克隆及可能的其他微生物污染。采用改變了的schaedler菌群〃常規(guī)化"克隆形成之后的6天,采用檢測菌株開始的小鼠使用改變了的schaedler菌群 “常規(guī)化”。接收改變了的khaedler' s菌群的C3H小鼠購買自Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY, USA)。兩只小鼠被放置在每個隔離箱中并且立即取走糞便樣本以檢測受測菌株的存在。對照小鼠和帶有受測菌株克隆化的小鼠被禁水過夜。第二天將C3H小鼠的10個糞球放入每瓶飲用水中,懸浮在水中,并提供給小鼠。該程序連續(xù)進行3天。來自 BALB/c和C3H小鼠的糞便在一個月中每周獲取一次以檢查改變了的Schaedler菌群克隆情況和存在受測菌株。Mi受測菌株形成單克隆之后45天,并且〃常規(guī)化〃之后30天,每個處理小組中的5 只小鼠被安樂死,并且動物樣本分離脾臟和T-淋巴細胞,并且測定細胞因子。制備脾臟細胞脾臟被滅菌取出并放置在冷的PBS+0. 5 %牛血清白蛋白(BSA) (Sigma Chemical Co.,St Louis, MO, USA) +0. 疊氮化鈉(NaN3) (Sigma)中。來自脾臟的單細胞懸浮液通過用5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)+0. lmg/ml of慶大霉素(Sigma) 灌注它而獲得。細胞懸浮液被轉(zhuǎn)移入15ml無菌錐形管中,并且在一臺冰凍離心機中以 2000rpm離心10分鐘。倒出上清液將每管中的血紅細胞通過將細胞再懸浮于0. 5ml PBS IX中裂解,然后加入9ml蒸餾水,充分混合,并且最終快速加入Iml的PBS 10X并充分混合。 懸浮液如上被離心隨后去除上清液而將細胞再懸浮于5ml的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中。懸浮液的樣本在顯微鏡下檢查,并且如果有不是細胞的顆粒存在,懸浮液通過一個無菌尼龍布過濾并且再次離心。小球再懸浮于5ml的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,洗兩次,最后再懸浮于5ml的完全培養(yǎng)基中。細胞活力通過臺酚藍(Sigma)排除法測定。20 μ 1細胞懸浮液稀釋于380μ1的0. 臺酚藍溶液(1 20稀釋)中并且采用血細胞計數(shù)器計數(shù)。細胞懸浮液的濃度在完全的RPMI-1640中被調(diào)整至1. Ox 106cells/ml。細胞培養(yǎng)細胞被培養(yǎng)在無菌96孔平底組織培養(yǎng)板上(Fisherbrand,F(xiàn)isher Scientific, Pittsburgh, PA, USA),采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基,存在或不存在(不刺激) 誘導(dǎo)試劑,例如Concavalin Α(5μ g/ml)、來自鼠傷寒沙門氏菌LPS (lg/ml)、佛波醇12-豆蔻酸-13-醋酸(PMA;10ng/ml)、離子霉素(I ;0. 5 μ g/ml)、以及熱滅活的羅伊乳酸桿菌 G.5mg蛋白/ml)。含有1.0 χ IO5細胞的100 μ 1細胞懸浮液和50 μ 1熱滅活的羅伊乳酸桿菌(4. 5mg蛋白/ml)被加入到每孔中。每組重復(fù)5遍。細胞培養(yǎng)基在5% CO2大氣中37°C 中帶有促細胞分裂劑孵育48小時,而帶有羅伊乳酸桿菌孵育96小時。從5孔中收集上清液,聚集并且儲存在-70°C直至用于細胞因子檢測。細胞因子定量上清液中的細胞因子(IL-10,TGF-beta-2)采用鼠的 Quantikine M試劑盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)按照制造商推薦的程序通過 ELISA進行檢測。MM細胞因子為免疫系統(tǒng)蛋白,其為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。它們協(xié)同抗體和T細胞免疫系統(tǒng)相互作用,并且放大免疫反應(yīng)。細胞因子包括由巨噬細胞合成的單核因子和活化的T淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK)產(chǎn)生的淋巴因子。羅伊乳酸桿菌SD2112受測菌株顯示出比來自菌株4000,4020或?qū)φ招∈蠹毎叩?P < 0. 05) IL-10濃度。而且TGF-beta-2水平高于SD2112菌株。這個菌株是根據(jù)本發(fā)明選擇的。b.確定由gL酸桿菌菌株在人gL中刺激的IL-10的產(chǎn)量和TGF-beta-2的減Φ量這個例子證實所選擇的菌株在體內(nèi)給出了預(yù)期的效果。測得羅伊乳酸桿菌, ATCC55730 ( nJ/Λ The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA ) ^ 測。受測乳酸桿菌菌株生長在MRS培養(yǎng)液(Difco)中,通過以IOOOx g離心而在指數(shù)生長期收集,采用磷酸鹽緩沖液(PBS ;pH 6. 8)清洗兩次并用相同的緩沖液再懸浮。之后將培養(yǎng)物加入到油滴產(chǎn)品中,按照以下例子3的方法。該項研究是雙盲的,空白對照劑對照存活確定了在過敏反應(yīng)中所選擇乳酸菌的潛在性能,實施于J6nk0ping,Motala和NorrkSping縣立醫(yī)院的兒科,以及University Hospital in Link0ping, Sweden。來自具有過敏性疾病歷史的家族的懷孕婦女在研究前的4個星期隨機口服接收羅伊乳酸桿菌SD2112,ATCC 55730,每天劑量為IxlO8CFU或空白對照劑。過敏性疾病的歷史由一名有經(jīng)驗的護士通過電話調(diào)查確認。總之,從2001年1月至2003年4月232個家族被包括在實驗中,并且平等的隨機分成實驗組和空白對照劑組。通過收集所有用過的研究產(chǎn)品的瓶子來評價配合程度并隨后評估她們的堅持程度。本研究包括初乳,取自分娩后頭3天,以及成熟乳,取自分娩后一個月,來自109名母親。采用一個手工的吸乳泵收集母乳樣本進入無菌塑料管并且儲存在-70°C直至分析。融化之后,母乳樣本被離心以去除脂肪和細胞碎片(Bottcher,2000)。剩余物一部分立即被用于分析IL-10濃度而其余被存放在_70°C并隨后被用于分析TNF- α、IL4、 TGF-beta-1、TGF-beta-2、可溶 CD14(sCD14)、全部 IgA、分泌型 IgA(sIgA),以及鈉和鉀。TGF-beta-1、TGF-beta-2和CD14(可溶CD14)的水平采用商業(yè)化的ELISA試劑盒 (R&D Systems, Abingdon, UK)根據(jù)制造商推薦的方法進行分析。TGF-beta-1和TGF-beta-2 的分析在酸處理潛在的TGF-beta前體之后進行,如較早所述(Bottcher 2000)。IL-10和 TNF-α 的水平采用商業(yè)化的 ELISA 試劑盒(CLB PeliPair reagent set, Amsterdam, the Netherlands)根據(jù)制造商推薦的方法進行測定。檢測低限對于TGF-beta-l和TGF-beta-2 為 62. 5pg/mL,對于 CD14 為 250 pg/mL,對于 IL-10 為 2. 3pg/mL,對于 TNF- α 為 7. 8pg/mL。IgA和IgA的總量采用較早所述的ELISA(Bottcher 200 檢測。檢測低限是 31. 2ng/mL對于這兩種檢測。鈉和鉀的水平在Link^pingUniversity Hospital的臨床化學(xué)系根據(jù)標準路線進行檢測(離子選擇電極)。血清中對應(yīng)于吸入的過敏原的IgE水平采 M UniCap Pharmacia CAP System Phadiatop (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)進行分析。統(tǒng)計分析計算研究小組的大小是假定羅伊乳酸桿菌小組與空白對照劑小組相比80 %的比率足以顯示臨床真實差異。計算的基礎(chǔ)是假定臨床出現(xiàn)過敏反應(yīng)或濕疹的發(fā)生率在空白對照劑小組中為40%而在實驗小組中可減少一半。能算出每組所需要的對象為91個而半途而廢的頻率估計為25%。通過外面的公司完成了隨機列表并以4為字區(qū)大小對每個中心分層抽樣。需要登記的對象總數(shù)是基于以上的計算,包括預(yù)期的半途而廢率和字區(qū)大小,結(jié)果為每組116名婦女和他們的后代。倫理學(xué)考虎根據(jù)Helsinki法典對人的醫(yī)學(xué)研究的規(guī)定,參加者收到一個書面信息并且簽字表示同意。在油中的羅伊乳酸桿菌SD2112受測菌株被認為是充分討論過的并且對于幼兒和成人都是安全的食物,因此不會引發(fā)倫理問題。帶有不同檢測的研究程序也可見一個小問題,即這個危險人群有很大比例將會發(fā)生過敏反應(yīng)并且通過過敏反應(yīng)篩選程序。該研究是由University Hospital of Linkdping的倫理審查委員會同意的。MM在研究中,當(dāng)懷孕婦女在分娩前常規(guī)口服羅伊乳酸桿菌菌株SD2112,四星期時我們檢查了對母乳的效果。母親分布兩組相比是相似的。當(dāng)母親日常攝入研究的產(chǎn)品時的星期數(shù)量在兩組之間沒有不同,至于在一個月內(nèi)全部母乳哺育。兩組之間的不連續(xù),大到一個月之多,主要是由于對嬰兒保護的治療安排(排除標準之一)。可見兩組之間沒有差異。在羅伊乳酸桿菌受測菌株小組中細胞因子在母乳中的分布由于抗炎癥因子IL-10 在初乳中的水平提高而變化(平均值6. 61pg/mL[范圍1. 15-150]),超過了空白對照劑小組中的母親(4. 78pg/mL[l. 15-150]) ;ρ = 0. 046。同時看到了 TGF-beta-2的水平在羅伊乳酸桿菌SD2112小組中降低。在羅伊乳酸桿菌小組中TGF-beta-2的水平(平均值674pg/ mL[102. 5-2800]比上 965pg/mL[211. 7-2800])明顯低于空白對照劑小組;ρ = 0. 020。而其他參數(shù)的水平在兩組中是類似的。分娩后4周獲得的母乳和不連續(xù)日常攝入生物產(chǎn)品的,與空白對照劑小組相比沒
有差異。實施例3制備含有所選擇菌株的產(chǎn)品在這個例子中,制造了一種被稱為"羅伊油滴"的產(chǎn)品。該產(chǎn)品是在油的基礎(chǔ)上包含了具有良好穩(wěn)定性和存活性的羅伊乳酸桿菌SD2112。產(chǎn)品生產(chǎn)過程中獨特的工藝是一個干燥步驟,其用于去除油中的大部分水分。本發(fā)明這里所用的油是一種純的食用植物油,優(yōu)選向日葵油。雖然一種油,例如一種純的向日葵油不期望包含水,但是通過將其置于真空中而干燥油的工藝步驟有一種意想不到的效果,即顯著提高了乳酸桿菌在成品中的穩(wěn)定性。因此,本發(fā)明所用的油應(yīng)該是盡可能去除水。雖然以前已經(jīng)知道這樣的培養(yǎng)基的穩(wěn)定性與成品中水的活性密切相關(guān),但是不知道的是在真空下干燥油用于使乳酸桿菌穩(wěn)定化。制造工藝的說明優(yōu)選的制造工藝流程圖如圖1所示。一個這樣的可行工藝的細節(jié)可如下用于本發(fā)明。原料混合
1、在一個 Bolz 混合器 / 罐(Alfred BOLZ Apparatebau GmbH, Wangen imAllgau, Germany)混合中鏈三酸甘油酯(例如,Akomed R, (Karlshamns AB,Karshamn Sweden)和帶有二氧化硅的向日葵油(例如,Akosun,Karlshamns),以及氣相二氧化硅[Cab-o_sil M5P, M5P,卡博特(Cabot)]。2、均質(zhì)化。一臺 Sine 泵和分散器(Sine Pump,Arvada,Colorado)被連接至 Bolz 混合器而混合物被均質(zhì)化。3、真空干燥?;旌衔镌贗OmBar真空下在Bolz罐中干燥12小時。4、加入羅伊乳酸桿菌。大約20kg干燥過的油混合物被轉(zhuǎn)移至一個50升的不銹鋼容器中。加入羅伊乳酸桿菌粉末(優(yōu)選凍干的,所用羅伊乳酸桿菌的數(shù)量變化取決于相放在油中的量,但一個例子是加入0. 2kg具有10"CFU/g的培養(yǎng)物)。緩慢混合直至同質(zhì)。5、混合。羅伊乳酸桿菌的預(yù)混合返回Bolz混合器中進行。6、排出。懸浮液排出到一個200升的不銹鋼容器中,以氮覆蓋。懸浮液維持在容器中直至灌入瓶子。雖然這里介紹了一定的代表性實施例,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出改變而不脫離本發(fā)明的精神或范圍。
羅伊乳酸桿菌菌株(簡稱羅伊乳桿菌菌株)SD2112,保藏號為ATCC 55730,于1995年 12月07日保藏在ATCC,ATCC的地址為美國馬里蘭州20852羅克維爾市。
1權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的油產(chǎn)品,所述油產(chǎn)品包括在可食用植物油中的凍干的乳酸桿菌菌株,其中,所述可食用植物油在添加到所述乳酸桿菌菌株之前經(jīng)真空干燥制得。
2.如權(quán)利要求1所述的油產(chǎn)品,其中,所述可食用植物油為向日葵油。
3.如權(quán)利要求1所述的油產(chǎn)品,其中,所述可食用植物油為中鏈三酸甘油酯。
4.如權(quán)利要求1 3任一所述的油產(chǎn)品,其中,在添加到所述乳酸桿菌菌株之前,所述可食用植物油的真空干燥步驟能夠使凍干的乳酸桿菌菌株培養(yǎng)物存活。
5.一種提高乳酸桿菌菌株存活的方法,所述方法包括將所述乳酸桿菌菌株的凍干的存活培養(yǎng)物與未經(jīng)真空干燥的可食用植物油混合。
6.一種制備如權(quán)利要求1 4任一所述的油產(chǎn)品的方法,所述方法包括如下步驟a)混合可食用植物油,以獲得一混合物;b)在真空下干燥所述混合物,以獲得一干燥混合物;和c)將所述干燥混合物添加到羅伊乳酸桿菌培養(yǎng)物中,以獲得一懸浮液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,所述可食用植物油包括向日葵油。
8.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,所述可食用植物油還包括中鏈三酸甘油酯。
9.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,所述培養(yǎng)物是凍干的。
10.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,所述混合物在IOmBar真空下干燥12小時。
11.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,所用羅伊乳酸桿菌的數(shù)量是具有l(wèi)O^CFU/gW 0. 2kg羅伊乳酸桿菌培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的油產(chǎn)品及其制備方法和提高乳酸桿菌菌株存活的方法,所述油產(chǎn)品包括在可食用植物油中的凍干的乳酸桿菌菌株,其中,所述可食用植物油在添加到所述乳酸桿菌菌株之前經(jīng)真空干燥制得。該油產(chǎn)品能夠提高母乳中抗炎癥細胞因子IL-10的水平并降低被哺育嬰兒發(fā)生過敏反應(yīng)的危險性,同時降低母乳中誘因并因此降低TGF-beta-2的水平,從而降低哺乳的母親發(fā)生乳腺炎的危險性。
文檔編號A61K35/74GK102334561SQ201110228888
公開日2012年2月1日 申請日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日
發(fā)明者伊麗莎白·舍貝里, 布·莫爾斯泰姆, 本特·比約克斯滕 申請人:生命大地女神有限公司
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