專利名稱：表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程皮膚技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種以幾丁質(zhì)膜作為支架培養(yǎng)表皮干細(xì)胞構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
大面積創(chuàng)面處理離不開覆蓋物，有時甚至需要進行皮膚移植，但自體皮源不足而限制了手術(shù)實施?，F(xiàn)有技術(shù)的人工皮膚研究中，通常使用表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等終末細(xì)胞加入支架材料，以構(gòu)成有一定生物活性的復(fù)合皮，但這類終末細(xì)胞，增殖能力較弱，影響修復(fù)效果。以往組織工程皮膚的種子細(xì)胞中，表皮成分主要是來源于自體或異體的表皮細(xì)胞， 雖然不斷改進培養(yǎng)體系，縮短周期或建立表皮細(xì)胞株，但尚無突破性進展。真皮種子細(xì)胞主要來源于成纖維細(xì)胞，取材方便生長速度較快，但功能單一，對構(gòu)建皮膚附屬器無明顯優(yōu)勢。由于表皮干細(xì)胞(印idermis stem cells, ESCs)具有很大的可塑性，是潛在的多能干細(xì)胞，在合適條件下可誘導(dǎo)形成汗腺、毛發(fā)和毛囊等皮膚附屬器，從而在解決表皮成分的種子細(xì)胞上具有優(yōu)勢。而ESCs的培養(yǎng)及其與載體的結(jié)合，是構(gòu)建組織工程皮膚的關(guān)鍵所在。幾丁質(zhì)膜作為一種生物材料，除了具有良好的組織相容性和生物學(xué)性能外，還具有來源廣泛、價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定及重復(fù)性好等優(yōu)點，是構(gòu)建組織工程皮膚的較好選擇。本發(fā)明人以幾丁質(zhì)膜作為介質(zhì)支架，體外與ESCs共同培養(yǎng)，取得了突破性進展，ESCs在幾丁質(zhì)膜纖維1 2w上形成集落，為ESCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建仿生覆蓋物并實現(xiàn)誘導(dǎo)組織再生、功能重建提供了基礎(chǔ)。但仍然存在著以下缺陷幾丁質(zhì)生物膜材料孔徑較大(500 IOOOnm)、網(wǎng)格不均勻、致密性差，僅適合用于傷口的暫時性覆蓋，不利于細(xì)胞的貼附及立體生長，細(xì)胞容易遺漏，細(xì)胞貼附量有限，從而影響了表皮干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的能力，不能很好地促進創(chuàng)面愈合，難以獲得理想的創(chuàng)面修復(fù)效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對幾丁質(zhì)膜進行表面修飾改性后與表皮干細(xì)胞共同培養(yǎng)構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，使表皮干細(xì)胞在支架材料上均勻地、充分鋪展并具有良好的生長狀態(tài)，以利于表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面中從毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化，并產(chǎn)生毛囊等附屬器，從而獲得理想的創(chuàng)面修復(fù)效果，實現(xiàn)病損組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)再生、功能重建。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明提供的一種表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法， 采用來源于成體皮膚組織的表皮干細(xì)胞與修飾幾丁質(zhì)膜共同培養(yǎng)制備，包括以下步驟a)表皮干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取大鼠或小兒包皮全層皮膚，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細(xì)胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用IV型膠原預(yù)包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C下靜置10 15min，貼壁細(xì)胞即為表皮干細(xì)胞(ESCs)；棄去未貼壁的細(xì)胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細(xì)胞用于實驗；b)采用膠原混合液表面修飾幾丁質(zhì)膜b-i)膠原混合液的制備在冰上進行如下操作將無菌10XPBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮IN NaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml I型膠原10XPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，無菌蒸溜水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 3mg/ml ；為減少或避免產(chǎn)生氣泡，混合采用吸管上下吸勻的方式進行，如出現(xiàn)氣泡采用離心方式去除；放置15min獲得膠原混合液；b-2)修飾幾丁質(zhì)膜根據(jù)模具，幾丁質(zhì)膜裁成呈正方形、且雙層十字型放置，在其上加入所述膠原混合液，膠原混合液的添加量為0. 2 0. 4ml/cm2幾丁質(zhì)膜面積，冰上放置30min lh，然后放置在37°C孵育箱45min lh，促進膠體形成；之后在溫度-70 -80°C下預(yù)冷20h或過夜，-30 -40°C冷凍真空干燥20 25h ；Co60 5 IOKgy輻照，連續(xù)3 5次交聯(lián)并滅菌而獲得修飾幾丁質(zhì)膜；所述修飾幾丁質(zhì)膜具有圖案式的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格孔徑為2 IOnm ；c)表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜共培養(yǎng)修飾幾丁質(zhì)膜使用時用培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1 X IO6 2X IO6個/ml，表面種植濃縮為0. 2 0. 5ml細(xì)胞懸液，滴加在修飾幾丁質(zhì)膜表面，靜置30min Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1 2w，隔天換液，獲得表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜仿生皮膚覆蓋物。本發(fā)明可采取如下進一步措施所述步驟b-Ι)中，平衡液的pH為6. 9 7.2 ;1 型膠原可以采用從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原；混合后I型膠原的終濃度為 0. 25 0. 5mg/ml。所述步驟b_2)中，采用Co60 5Kgy輻照，連續(xù)4 5次交聯(lián)并滅菌。本發(fā)明以幾丁質(zhì)膜作為支架材料，經(jīng)膠原混合液對其進行表面親水性改性，并獲得圖案化表面修飾，材料孔徑較小、網(wǎng)格均勻。與表皮干細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞貼附量大且密，并且能夠有效調(diào)控表皮干細(xì)胞的定向分化，從而激發(fā)和誘導(dǎo)組織的自身修復(fù)、再生能力，實現(xiàn)病損組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)再生、功能重建。


下面將結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述圖1是本發(fā)明實施例分離ESCs形態(tài)與細(xì)胞集落顯微鏡觀察結(jié)果；圖2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志CK5、CK19、p63 ；圖3是流式細(xì)胞儀檢測ESCs表面標(biāo)志結(jié)果⑶四、CD49d、CD71、CD34 ；圖4是幾丁質(zhì)膜修飾前后激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；圖5是修飾幾丁質(zhì)膜上細(xì)胞集落肉眼觀察情況；圖6是幾丁質(zhì)膜其修飾前后用DiI染色和GFP標(biāo)記細(xì)胞檢測貼附效果的觀察結(jié)果；
圖7是掃描電鏡觀察下修飾幾丁質(zhì)膜上的孔徑及細(xì)胞生長情況；圖8是幾丁質(zhì)膜空白材料在大鼠全厚層缺損動物模型上的體內(nèi)降解試驗結(jié)果；圖9是幾丁質(zhì)膜以及ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜在裸鼠全層皮膚缺損模型的創(chuàng)面愈合外觀對照；圖10是幾丁質(zhì)膜以及ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜修復(fù)創(chuàng)面的表皮巢形成對照；圖11是免疫組織化學(xué)檢測體內(nèi)早期表皮干細(xì)胞標(biāo)志⑶34、⑶200表達變化；圖12是免疫組織化學(xué)檢測體內(nèi)早期表皮巢毛囊干細(xì)胞主要部位標(biāo)志⑶34、 CD200 ；圖13是體內(nèi)實驗表皮干細(xì)胞早期標(biāo)志的蛋白水平0^9、p63、VEGF、DSg3 ；圖14是體內(nèi)實驗短暫增殖細(xì)胞(TAC)標(biāo)志的蛋白水平CK5、CK10、CK14、CK15 ；圖 15 是定量 PCR 檢測 CD29、p63、VEGF、CK15mRNA 水平及調(diào)控因子 micro-203mRNA 水平。
具體實施例方式圖1 圖15所示為本發(fā)明一種表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法的實施例，對幾丁質(zhì)膜進行表面修飾改性后獲得具有較好相容性的生物材料， 通過體外與表皮干細(xì)胞共同培養(yǎng)，構(gòu)建成類生物仿生皮膚覆蓋物并進行鑒定檢測；然后以此為暫時性敷料進行體內(nèi)實驗，在裸鼠全層皮膚缺損動物模型上進行原位誘導(dǎo)組織再生， 并定期取材進行各項指標(biāo)檢測。具體方法如下主要材料來源Defined keratindly SFM培養(yǎng)液(Gibco，10785，美國)；IV型膠原(Sigma，美國)； 小鼠抗大鼠β 1整合素(⑶29)單克隆抗體、小鼠抗大鼠角蛋白CK5、CK10、CK14、CK15、 CK19、小鼠抗大鼠 p63、vEGF、Dsg (均來源于 Canta Cruz，美國)；CD34、CD200 (ABCam，英國)；氨基聯(lián)苯胺顯色試劑(DAB，武漢博士德生物有限公司)；幾丁質(zhì)膜天然生物膜(捷舒美，湖南櫻花生物醫(yī)學(xué)有限公司)；定量PCR用酶STOR Green PCR Master Mix(T0Y0B0公司)；RNase-free d Rnase I (Promega) ；MaxVision HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit (深圳邁新生物有限公司)。實時熒光定量PCR 儀(ABI PRISM 73OOkquence Detection System，美國)；激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 510META，日本)；掃描電鏡(XL-30型EnvironmentaBcanning Electron Microscope. Philips,荷蘭)。1體外構(gòu)建表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜仿生皮膚覆蓋物及鑒定檢測1-1表皮干細(xì)胞分離和培養(yǎng)清潔級1 3d SD幼大鼠(中山大學(xué)實驗動物中心)20只，雌雄不限，體質(zhì)量15 25g，實驗過程的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。取SD幼大鼠全層皮膚(或小兒包皮)，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細(xì)胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用IV型膠原預(yù)包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C下靜置10 15min，貼壁細(xì)胞即為表皮干細(xì)胞(ESCs)；棄去未貼壁的細(xì)胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細(xì)胞用于鑒定檢測和實驗。ESCs的鑒定檢測如下I-I-IESCs形態(tài)學(xué)觀察
IV型膠原快速貼附表皮干細(xì)胞，培養(yǎng)3 6d后，如圖1所示，倒置顯微鏡下表皮干細(xì)胞形成集落，細(xì)胞呈圓形或小的多角形，無成纖維細(xì)胞混雜(見圖1中a)。表皮干細(xì)胞培養(yǎng)1 2w已融合成片，呈鵝卵石樣鋪滿瓶底(見圖1中b相差顯微鏡觀察)。Acridine Orange染色，核漿比例大，細(xì)胞核大而圓、居中，呈亮綠色；胞漿少，呈橘紅色，可見集落和核分裂相(見圖1中c激光共聚焦顯微鏡觀察)。1-1-2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測ESCs表面標(biāo)志細(xì)胞CK15、CK19、p63陽性細(xì)胞表達采用鏈霉親和素.生物素復(fù)合物(SABC)法測定。將細(xì)胞爬片放入體積比為30% H2A 100%甲醇=1 10的混合液中，室溫浸泡 IOmin滅活內(nèi)源性酶，PBS洗滌3次，熱修復(fù)抗原、破膜處理、羊血清封閉，分別加入CK15、 CK19、P63單克隆抗體，置濕盒內(nèi)4°C過夜，次日加入生物素二抗、SABC，二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色，蘇木素復(fù)染封片。如圖2所示，CK15+、CK19+棕色顆粒在細(xì)胞質(zhì)表達，p63+棕色顆粒在細(xì)胞核表達。 CK15和CK19是細(xì)胞早期分化過程表達的角蛋白。p63為轉(zhuǎn)錄因子，是p53基因家族成員， 對ESCs生物性能維持和增殖分化起著決定性作用。1-1-3流式細(xì)胞儀檢測ESCs表面標(biāo)志及細(xì)胞周期用流式細(xì)胞儀檢測⑶29、⑶49d、⑶71、⑶34，取培養(yǎng)的ESCs，消化離心獲取細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3X105/ml，分別與一抗室溫反應(yīng)30min，PBS液洗滌兩次，分別與 FITC標(biāo)記或PE標(biāo)記的二抗避光作用30min，用PBS液重懸細(xì)胞置于冰上，然后進行流式細(xì)胞儀檢測。如圖3所示，其陽性表達率分別為β 1整合(⑶29)為99. 06 %、CD49d為87. 74 %、 CD71為23. 11%、⑶34為1.34%。當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)低于30%時視為表達陰性，因此本實施例分離的ESCs表達⑶29、⑶49d，不表達⑶71、⑶34，是一組高增殖低分化的表皮干細(xì)胞群。 細(xì)胞周期檢測98%細(xì)胞留在GO-Gl期。1-2采用膠原混合液修飾幾丁質(zhì)膜1-2-1膠原混合液的制備在冰上進行如下操作將無菌10XPBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮IN NaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml I型膠原IOXPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，如 5mg/ml I 型膠原10XPBS IN NaOH = 1 0. 5 0. 1，無菌蒸餾水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 3mg/ml，以0. 25 0. 5mg/ml為宜，如0. 5mg/ml ；采用吸管上下吸勻的方式混合，如出現(xiàn)氣泡采用離心300gX IOmin去除；放置15min獲得膠原混合液；其中I型膠原可采用從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原，如鼠I型膠原。1-2-2修飾幾丁質(zhì)膜幾丁質(zhì)膜面積5cmX5cm，雙層十字型放置在同等面積的模具上，每個模具加入膠原混合液5ml ；冰上放置lh，然后放置在37°C孵育箱lh，促進膠體形成；之后在溫度_80°C 下預(yù)冷20h或過夜，-40°C真空干燥25h ；Co60 5Kgy輻照，連續(xù)4次交聯(lián)并滅菌而獲得修飾幾丁質(zhì)膜。激光共聚焦顯微鏡下觀察，如圖4所示，幾丁質(zhì)膜經(jīng)鼠I型膠原混合液表面修飾后，孔徑有了根本變化，孔徑小而致密。經(jīng)凍干消毒后，表面結(jié)粉較薄，網(wǎng)孔均勻，更適合細(xì)胞生長。掃描電鏡下可見修飾后的幾丁質(zhì)膜形成圖案式的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格孔徑約2 IOnm (見圖 7A)。1-3表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜共培養(yǎng)將修飾幾丁質(zhì)膜裁制成IOmmX IOmm/塊，培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的ESCs消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2X IO6個/ml，表面種植濃縮為0. 5ml細(xì)胞懸液，滴加在修飾幾丁質(zhì)膜表面，靜置Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1 2w，隔天換液，獲得ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜仿生皮膚覆蓋物，用于檢測或動物實驗。如圖5所示，1 2w在修飾幾丁質(zhì)膜上形成肉眼可見棋盤樣細(xì)胞集落。如圖6所示，激光共聚焦顯微鏡觀察材料的孔徑發(fā)生了根本變化，修飾前幾丁質(zhì)膜材料的孔徑大，細(xì)胞貼附少；而本實施例修飾幾丁質(zhì)膜材料孔徑小，細(xì)胞密而均勻，表層掃描顯示材料已被細(xì)胞遮擋，中層可見原幾丁質(zhì)膜纖維，顯示表皮干細(xì)胞具有良好的生長狀態(tài)。如圖7B所示，掃描電鏡下可見修飾后的幾丁質(zhì)膜具有圖案式的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格孔徑為2 lOnm.，表皮干細(xì)胞直徑是15 20nm，在均勻網(wǎng)格上充分鋪展，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)與膠原網(wǎng)格交織成片(見圖7C)。2體內(nèi)裸鼠全層皮膚缺損動物模型的原位誘導(dǎo)組織再生實驗2-1建立大鼠全厚層缺損動物模型以及幾丁質(zhì)膜空白材料體內(nèi)降解試驗選用健康大鼠動物12只(來源于廣東省實驗動物中心)，每時間點2只。以50mg/ kg 0.6%戊巴比妥鈉麻醉，剃去背部毛，稱重。消毒，用利刀在背脊柱的兩側(cè)肌肉豐滿處各切長約2cm的小口，深至皮下，形成機械損傷動物模型。3面切口呈“U”形，留一邊不切游離出皮膚。面積約2cmX2cm，距脊柱旁開1. 5cm，每只大鼠創(chuàng)面分左右兩側(cè)，左上側(cè)實驗組 幾丁質(zhì)膜空白材料，每個傷口植入Icm2的幾丁質(zhì)膜空白材料，三面縫合；右下側(cè)對照假手術(shù)組，沒有材料。上下創(chuàng)面間隔約3cm。造模后大鼠傷口暴露，單籠飼養(yǎng)。lw、2w、#、6w、8w、 IOw取材，石蠟包埋，H&E染色。如圖8所示，2 #幾丁質(zhì)膜組有炎癥包塊，幾丁質(zhì)膜纖維在6 8w被降解為短桿樣，被結(jié)締組織包裹，IOw時基本降解。與對照組比較，鏡下的差別不明顯。體外觀察及手感修復(fù)處有包塊，隨時間逐漸變軟。2-2表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜在裸鼠全層皮膚缺損模型原位誘導(dǎo)表皮再生選用健康裸鼠動物12只，同上麻醉、消毒，距脊柱旁開1. 5cm，左右兩側(cè)左上側(cè)實驗，右下側(cè)對照，上下創(chuàng)面間隔約3cm，切口約IcmX Icm,全層皮膚切除，深至皮下，暴露筋膜，造成全層皮膚缺損模型。左上側(cè)每個傷口植入Icm2的ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜作為實驗組；右下側(cè)每個傷口植入Icm2的無細(xì)胞未修飾的幾丁質(zhì)膜作為對照組。四角縫合，加壓包扎。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，于 dl、d3Uw,2w,4w,6w取材H&E染色，觀察傷口修復(fù)的組織學(xué)變化。如圖9所示，裸鼠動物全層皮膚缺損模型的創(chuàng)面愈合顯示，對照組形成的創(chuàng)面修復(fù)較薄、淡紫色、容易破裂出血。實驗組形成的創(chuàng)面修復(fù)較厚、紅潤，有皮紋；組織包埋切片、H&E染色發(fā)現(xiàn)修復(fù)皮膚的結(jié)締組織中，表皮巢和小血管的形成有規(guī)律的增多假手術(shù)組 <幾丁質(zhì)膜< ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜(見圖10)。2-3定期取材進行各項指標(biāo)檢測2-3-1免疫組織化學(xué)檢測體內(nèi)表皮干細(xì)胞標(biāo)志表達
中性福爾馬林固定、石蠟包埋、常規(guī)組織切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化， 浸泡于蒸餾水中待用；PH6. 0檸檬酸緩沖液120°C高溫高壓修復(fù)2分鐘，取出自然冷卻至室溫，蒸餾水沖洗2次，PBS(pH = 7. 2 7. 4)沖洗;3minX3次；為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，每張切片加入50 μ L過氧化酶阻斷劑(Endogenous peroxidase blocking solution)室溫中孵育lOmin，蒸餾水沖洗，PBS沖洗3minX3次；除去PBS每張切片加1滴或50 μ L—抗工作液(1 100)，4°C下過夜。？85沖洗511^11\3次；滴加5(^1^ MaxVision HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit 試劑室溫孵育 20 分鐘，PBS 沖洗，3minX3次；除去PBS液每張切片加入2滴或100 μ L新鮮配制的DAB顯色劑顯色3 15min ；自來水充分沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封固。⑶34是血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型標(biāo)記，人表皮干細(xì)胞在體外和體內(nèi)實驗表達陰性，但在鼠表皮干細(xì)胞表達陽性，故也是鼠表皮干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志之一。如圖11所示，實驗組⑶34陽性表達主要在基底層的濾泡性上皮，出現(xiàn)在手術(shù)后d3，從d5 #，保持高表達，到6w后減弱。而對照組(無ESCs的空白幾丁質(zhì)膜)是出現(xiàn)在#后。結(jié)果顯示， 表皮干細(xì)胞在修飾幾丁質(zhì)膜上生長良好，在^之前高度增殖，但未分化，維持其表皮干細(xì)胞的特征。⑶200是近年來發(fā)現(xiàn)的一個表皮干細(xì)胞的標(biāo)志，大部分慢周期標(biāo)記殘留細(xì)胞位于毛囊隆突(bluge)部，即豎毛肌毛囊附著處與皮脂腺開口之間的毛囊外根鞘(outer root sheath, 0RS)中。如圖11所示，實驗組⑶200陽性表達出現(xiàn)在手術(shù)后d3，定位在毛囊表皮干細(xì)胞，從d3持續(xù)6w，提示表型維持時間較長；對照組陽性出現(xiàn)在(17, 減弱，提示細(xì)胞分化開始，失去表型。表皮巢是毛囊細(xì)胞的不同橫切面，如圖12所示，⑶34表達在毛球部有較強的陽性，⑶200表達在外毛根鞘。2-3-2ffestern blot檢測ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜皮膚修復(fù)過程的表皮干細(xì)胞的早期蛋白表達維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，需要穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。⑶^、p63、VEGF、Dsg3是表皮干細(xì)胞早期標(biāo)志，顯示未分化狀態(tài)。如圖13所示，本實施例VEGF-A在d7有高表達，提示早期有血管形成，dl4下降至正常，不會由于大量VEGF-A產(chǎn)生引起癌變。2-3-3ffestern blot檢測ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜皮膚修復(fù)過程的短暫增殖細(xì)胞 (TAC)的蛋白表達表皮干細(xì)胞在分化過程中，形成表皮干細(xì)胞-短暫增殖細(xì)胞(TAC)-角脘細(xì)胞的分化過程。TAC增多，說明表皮干細(xì)胞分化開始。如圖14所示，本實施例CK5、CK10、CK14、 CK15等短暫增殖細(xì)胞標(biāo)志顯示實驗組與對照組(無ESCs的空白幾丁質(zhì)膜)無顯著性差別， 表明ESCs在修飾幾丁質(zhì)膜上顯示增殖未分化狀態(tài)，具有良好的生長狀態(tài)。2-3-4qRT-PCR 檢測 ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜皮膚修復(fù)過程的 CD29、CK15、p63、VEGFA mRNA表達水平以及調(diào)控因子microRNA-203變化(l)Q^9、CK15、p63、VEGFA mRNA 表達水平為了評估早期修復(fù)時ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜的基因水平變化，同上裸鼠動物全層皮膚缺損模型延長時間點dl-d42。術(shù)后定時取材，總RNA抽提；使用RNase-free 的DNaseI (Promega)去基因組，按說明書體系配置反應(yīng)液，37 °C消化30min，65 V滅活I(lǐng)Omin ；總RNA純度和完整性檢測；逆轉(zhuǎn)錄后進行定量PCR 內(nèi)參片段18SrRNA_112bp， 目的片段CD29-357bp CK15_271bp CK19_171bp p63_383bp VEGFA_240bp。 引物 設(shè)計CD29_F 5' acaagagtgccgtgacaa 和 qm_CD29-R 5' attggcactagcagtgtc ； CK15 — F 5 ‘ attcagcagtcaactggct 禾口 CK15 — R 5 ‘ gagctgagactgc ￡1 ￡1 C C ￡1 CK19-F 5 ‘ cagctcagcatgaaagct 禾口 CK19-R 5‘ gatgtccatgagctgctt ；p63_F 5 ‘ aagctgagcatgtcaccga 禾口 p63_R 5 ‘ tctgatgctgtcttcatctg ； qm-VEGFA-F 5，atgccggttccaaccagaa 禾口 VEGFA-R :5，gtggaggagcgagctgaa。 反應(yīng) 體系 cDNA(l 25)5. 0 μ 1，10 μ M 上游引物 0.5 μ 1，10 μ M 下游引物 0.5 μ l，2x SYBR Green PCR Master Mix 10 μ 1, dH20 4. 0 μ 1，總體積為 20 μ 1。反應(yīng)條件預(yù)變性 95°C lOmin，變性 95°C 15s，退火60°C 15s,延伸72°C 30s，循環(huán)40次后讀板，融解曲線分析溫度60°C -95°C， 每分鐘讀1次。 采用裸鼠自體對照，定量PCR檢測基因水平表皮干細(xì)胞在早期參與修復(fù)變化， ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜實驗組與沒有ESCs的空白幾丁質(zhì)膜對照組比較，如圖lfe-e所示，d3 時，實驗組整合素⑶四、毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志CK15、轉(zhuǎn)錄因子p63、血管生長因子A(VEGFA) mRNA水平均有高表達。以CK15持續(xù)高表達最明顯d3升高3倍，d5升高4. 5倍，d28升高到40倍，d42還能保持2. 5倍。
(2) microRNA-203 變化同上方法同時取標(biāo)本檢測microRNA-203變化，引物設(shè)計hsa-microRNA-203F :5， ACACTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTAGGACCA 和 hsa-microRNA_203R :5’ CTCAACTGGTGTCGTGGA,內(nèi)參片段U6-F :5，CTCGCTTCGGCAGCACA 和 U6-R :5，AACGCTTCACGAATTTGCGT。microRNA-203是表皮干細(xì)胞分化的調(diào)控基因，如表皮基底層細(xì)胞過表達 microRNA-203會導(dǎo)致基底層細(xì)胞過早分化并失去增殖潛能，microRNA-203調(diào)節(jié)p63是通過翻譯抑制，有較強抑制的P63蛋白表達。本實施例表明實驗組p63mRNA在d3時與對照組比較升高了 5倍，并維持到d28(見圖15b)；如圖15f所示，microRNA-203mRNA在d3時與對照組比較無差別，到業(yè)8時對照組micrORNA-203mRNA升高，比實驗組高出8. 7倍，顯示 microRNA-203在d28時ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜實驗組與無細(xì)胞的幾丁質(zhì)膜組比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，P < 0. 05，提示對照組ESCs開始分化，而實驗組仍然維持ESCs增殖未分化狀態(tài)，表明ESCs在修飾幾丁質(zhì)膜上具有良好的生長狀態(tài)，在創(chuàng)面修復(fù)中起著重要的作用。microRNA-203是在表皮分化和發(fā)育過程中大量表達并且進化保守的miRNA， microRNA-203是以ANp63mRNA為靶目標(biāo)，在成體表皮細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化過程中充當(dāng)開關(guān)，因此microRNA-203是一個關(guān)鍵分子，控制角質(zhì)形成細(xì)胞從基態(tài)到基底層分化。microRNA-203缺失后，表皮上基部的p63翻譯將升高，microRNA-203過表達ΔΝρ63的 mRNA降低。統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13. O統(tǒng)計軟件分析進行ANOVA Oneway方差分析， 以P <0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)論和效果生物誘導(dǎo)性材料通過表面或界面與細(xì)胞直接接觸，材料的表面特性是調(diào)控干細(xì)胞增殖與分化的重要因素。本實施例幾丁質(zhì)膜經(jīng)表面親水性改性的同時，獲得圖案化表面修飾，材料的孔徑較小、網(wǎng)格均勻，細(xì)胞貼附量大且密。圖案化表面修飾影響著細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與可溶性因子的相互作用，進而影響了干細(xì)胞分化，從而有效調(diào)控干細(xì)胞行為。本實施例通過材料在體內(nèi)形成特殊的“生物仿生修飾表面”及局部微環(huán)境，實現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等活性物質(zhì)的分配和重組，從而介導(dǎo)材料與細(xì)胞的作用。體外實驗結(jié)果表明幾丁質(zhì)膜經(jīng)膠原混合液修飾后，表皮干細(xì)胞在膜表面高度鋪展，細(xì)胞外基質(zhì)分泌旺盛，增殖速度明顯增大。體外培養(yǎng)2 3w后，90%表皮干細(xì)胞仍保持其表型的未分化狀態(tài)，并依然具有分化潛能。體內(nèi)實驗表明在全層皮膚缺損部可見表皮層與真皮層的重建， 毛囊干細(xì)胞增多，修復(fù)創(chuàng)面皮膚較厚、紅潤、有皮紋。3 5d早期蛋白轉(zhuǎn)錄水平、蛋白合成比對照組高，短暫增殖細(xì)胞沒有增加，業(yè)8后無ESCs的空白幾丁質(zhì)膜覆蓋的創(chuàng)面上的檢測 microRNA-203標(biāo)志顯示細(xì)胞已經(jīng)開始分化，失去增殖潛能，但有ESCs的修飾幾丁質(zhì)膜覆蓋的創(chuàng)面還能繼續(xù)保持表皮干細(xì)胞增殖，最終修復(fù)的效果出現(xiàn)類正常皮膚的皮紋，并有類毛孔的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。本實施例ESCs-修飾幾丁質(zhì)膜適合早期表皮干細(xì)胞增殖。修飾幾丁質(zhì)膜起誘導(dǎo)作用，表皮干細(xì)胞ESCs在修飾幾丁質(zhì)膜生長是以毛囊干細(xì)胞生長為主，毛囊干細(xì)胞分化成表皮細(xì)胞及皮膚附屬組織，完成表皮與真皮修復(fù)，而不需要分開構(gòu)建表皮層和真皮層的組織工程皮膚，用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復(fù)。本實施例通過對表皮干細(xì)胞所處微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和功能模擬實驗，構(gòu)建仿細(xì)胞外基質(zhì)和信息分子的生物誘導(dǎo)性材料，有效調(diào)控表皮干細(xì)胞的定向分化，從而激發(fā)和誘導(dǎo)組織的自身修復(fù)、再生能力，實現(xiàn)病損組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)再生、功能重建，對臨床創(chuàng)面(如燒傷、 皮膚創(chuàng)傷、糖尿病足等)的修復(fù)具有重要意義。
權(quán)利要求
1.一種表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于采用來源于成體皮膚組織的表皮干細(xì)胞與修飾幾丁質(zhì)膜共同培養(yǎng)制備，包括以下步驟a)表皮干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取大鼠或小兒包皮全層皮膚，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細(xì)胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用IV型膠原預(yù)包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C下靜置10 15min，貼壁細(xì)胞即為表皮干細(xì)胞；棄去未貼壁的細(xì)胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細(xì)胞用于實驗；b)采用膠原混合液表面修飾幾丁質(zhì)膜b-Ι)膠原混合液的制備在冰上進行如下操作將無菌10XPBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮INNaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml I型膠原10XPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，無菌蒸溜水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 ;3mg/ml ；放置15min獲得膠原混合液；b-2)修飾幾丁質(zhì)膜根據(jù)模具，幾丁質(zhì)膜裁成呈正方形、且雙層十字型放置，在其上加入所述膠原混合液， 膠原混合液的添加量為0. 2 0. 4ml/cm2幾丁質(zhì)膜面積，冰上放置30min lh，然后放置在37°C孵育箱45min lh，促進膠體形成；之后在溫度_70 -80°C下預(yù)冷20h或過夜，-30 -40°C冷凍真空干燥20 25h ；Co60 5 IOKgy輻照，連續(xù)3 5次交聯(lián)并滅菌而獲得修飾幾丁質(zhì)膜；c)表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜共培養(yǎng)修飾幾丁質(zhì)膜使用時用培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1 X IO6 2X IO6個/ml，表面種植濃縮為0. 2 0. 5ml細(xì)胞懸液，滴加在修飾幾丁質(zhì)膜表面，靜置30min Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1 2w，隔天換液，獲得表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜仿生皮膚覆蓋物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，所述平衡液的pH為6. 9 7. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 0. 5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，I型膠原為從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，I型膠原與平衡液的混合采用吸管上下吸勻的方式進行溫和混合，如有氣泡采用離心方式去除。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-幻中，采用Co60 ^igy輻照，連續(xù)4 5次交聯(lián)并滅菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-幻中，修飾幾丁質(zhì)膜具有圖案式的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格孔徑為.2 10nm。
8.權(quán)利要求1-7之一所述表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建的仿生皮膚覆蓋物，其特征在于用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，采用來源于成體皮膚組織的表皮干細(xì)胞與修飾幾丁質(zhì)膜共同培養(yǎng)制備，即對幾丁質(zhì)膜支架材料進行表面修飾改性后與表皮干細(xì)胞共同培養(yǎng)，使表皮干細(xì)胞在修飾幾丁質(zhì)膜上均勻地、充分鋪展并具有良好的生長狀態(tài)，以利于表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面中從毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化、并產(chǎn)生毛囊等附屬器，完成表皮與真皮修復(fù)，從而獲得理想的創(chuàng)面修復(fù)效果，實現(xiàn)病損組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)再生、功能重建，用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復(fù)，對臨床創(chuàng)面的修復(fù)具有重要意義。
文檔編號A61L27/60GK102294055SQ20111023234
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者戴麗冰, 李孝建, 梁蓉, 沈雁 申請人:戴麗冰, 李孝建, 梁蓉, 沈雁