專利名稱：抗VEGF單克隆抗體Vancolizumab及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及治療性單克隆抗體藥物，特別涉及抗腫瘤血管新生的抗人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體藥物。
背景技術(shù)：
早在一個多世紀(jì)以前，就有文獻(xiàn)報道過腫瘤生長伴隨著新生血管生成(Ferrara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在著某種腫瘤來源的血管生長刺激因子為腫瘤的生長提供血管供應(yīng)(Ide et al. 1939)。數(shù)年后，由于觀察到血管密度的增高會先于腫瘤的快速生長，Algire等人認(rèn)為“腫瘤的快速擴(kuò)散取決于豐富的血管供給” (Algire et al. 1945)。在上個世紀(jì)六十年代，Greenblatt、Shubik (Greenblatt et al. 1968)和Ehrmann、Knoth (Ehrmann et al. 1968)兩個研究小組的實(shí)驗(yàn)相繼提供初步證據(jù)， 證實(shí)腫瘤的血管生成是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的某些可擴(kuò)散因子介導(dǎo)。1971年，美國科學(xué)家?？寺?Judah Folkman)在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中提出，抗血管生成可能是一種有效的抗癌手段(Folkman 1971)。從七十年代早期開始，以這個前瞻性的假說為基礎(chǔ)，?？寺捌溲芯啃〗M致力于從人體和動物的腫瘤中分離某種‘腫瘤血管生成因子‘(R)lkman et al. 1971 )。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌癥的觀點(diǎn)(Gullino 1978)。隨后，多種血管源因子(如，表皮生長因子EGF，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-α、 丁6卩吐6丨3，腫瘤生長因子1順-0和血管生長素等)先后被發(fā)現(xiàn)(Folkman et al. 1987)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)
血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF,也可寫作 VEGF-A) 是一個血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對于VEGF基因家族在血管生成調(diào)節(jié)中所扮演的角色， 人們已經(jīng)深入研究了十多年之久(Ferrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成員 (VEGF-A)、胎盤生長因子(placenta growth factor, P1GF) (Maglione et al. 1991)、 VEGF-B (Olofsson et al. 1996)、VEGF-C (Joukov et al. 1996)、VEGF-D (Orlandini et al. 1996)。其中VEGF-A是誘導(dǎo)腫瘤血管生成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長因子。 VEGF有3個高親合性的酪氨酸激酶受體(RTKs)，分別為VEGFR-I (Flt-I) (Shibuya et al. 1990; de Vries et al. 1992)、VEGFR_2(KDR、Flk_l)(Yoshiji et al. 1996; Ellis et al. 1998; Tomisawa et al. 1999)禾口 VEGFR3 (Flt-4) (Joukov et al. 1996)。 KDR 是血管形成的主要調(diào)控分子，具有明顯的化學(xué)趨化和促分裂作用，與血管島、血管形成和造血有關(guān)。腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，是促成上述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會超過廣2 mm3。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因，而在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的多步驟過程中，血管生成均發(fā)揮著重要作用。原位雜交研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA在多種人類腫瘤中都有表達(dá)，包括肺癌(Volm et al. 1997)、乳腺癌(Yoshiji et al. 1996)、胃腸癌(Ellis et al. 1998)、腎癌(Tomisawa et al. 1999)和卵巢癌(Sowter ei a人1997)。多家實(shí)驗(yàn)室使用多種抗VEGF 的手段均已實(shí)現(xiàn)了腫瘤生長的抑制，這些方法包括針對VEGF或其受體(VEGFRs)的抗體、可溶性受體，VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制劑以及利用VEGF的突變異二聚體封閉其受體結(jié)合位點(diǎn)等。1993年，費(fèi)拉拉制備了 VEGF的鼠源性抗體，在體外實(shí)驗(yàn)中，鼠源性抗體可以顯著抑制數(shù)種人類癌細(xì)胞系的生長。從此，VEGF抗體的臨床應(yīng)用價值開始顯露。為了降低鼠源性抗體的免疫原性，費(fèi)拉拉將鼠源抗體的骨架換做了人源抗體IgGl的部分，由此誕生了基因泰克公司“重磅炸彈級”藥物一貝伐單抗(Avastin)。它是一種抗VEGF的人源化抗體(IgGl)，93%的人源結(jié)構(gòu)域和7%的鼠源結(jié)合區(qū)域組成，是全世界第一個被批準(zhǔn)用于抑制血管生長的單克隆抗體藥物，2004年2月美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)該藥用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(mCRC)、小細(xì)胞分子肺癌(GBM)和轉(zhuǎn)移性腎癌。阿瓦斯汀區(qū)別于已有抗癌藥物，以VEGF為藥物靶點(diǎn)，加之抗體的特異性結(jié)合能力，使其臨床療效顯著。在人體試驗(yàn)中，即使對于晚期的癌癥患者，注射阿瓦斯汀也可延長壽命數(shù)月。2007年ASCO會議Souglakos報道Avastin聯(lián)合靶向EGFR的單克隆抗體 Cetuximab (西妥昔單抗)可以安全有效地治療化療失敗的晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌?；蛱┛斯菊谟肁vastin對超過40種癌癥進(jìn)行適應(yīng)癥研究，希望可以生產(chǎn)出更多的單抗延伸產(chǎn)品。同時，他們也在研究將全抗體分子IgG切割之后，先將蛋白用原核細(xì)胞表達(dá)，然后再將其通過基因工程的手段連接為IgG。除了癌癥外，VEGF也是治療包括老年性黃斑變性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在內(nèi)的多種眼科疾病關(guān)鍵。為了治療這些疾病，在Avastin的基礎(chǔ)上，基因泰克公司又將其全抗體分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡化，保留能夠中和VEGF的抗體片段，同時將給藥途徑由靜脈注射改為玻璃體直接注射，由此成就另一藥物一Avastin的孿生姊妹蘭尼單抗(Lucentis)。 2006年，蘭尼單抗被美國藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于治療老年黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)，很快就成為治療老年性黃斑變性，糖尿病引起的眼底病的首選藥，占領(lǐng)北美市場80%以上的份額。
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發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明提供Vancolizumab，其運(yùn)用基因工程等技術(shù)手段，將識別VEGF的抗體分子在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)，其抑制腫瘤組織血管新生的效果能達(dá)到基因泰克公司已上市的“重磅炸彈”級單抗藥物Avastin的水平，且Vancolizumab為人源化成度更高，可以極大降低病人使用后產(chǎn)生的人體免疫反應(yīng)。技術(shù)方案
抗VEGF單克隆抗體Vancolizumab，其特征在于所述的抗體由2個相同的重鏈和輕鏈構(gòu)成，同時兩條重鏈通過二硫鍵結(jié)合，形成標(biāo)準(zhǔn)的抗體全分子；其中SEQ. 1—SEQ. 2與SEQ. 5相連接構(gòu)成抗體的重鏈部分，SEQ. 3和SEQ. 4結(jié)合構(gòu)成抗體的輕鏈部分；同時SEQ. 2通過二硫鍵與SEQ. 4結(jié)合，SEQ. 1和SEQ. 2連接構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合片段Fab，?？筕EGF單克隆抗體Vancolizumab在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用本發(fā)明實(shí)際上是人源化的抗VEGF-A單克隆抗體IgG分子。有益效果
1、目前上市的抗體藥物中人源化抗體只占20%，鼠源性抗體導(dǎo)致排異大，毒副作用強(qiáng)。 本專利涉及的單克隆抗體是使用人源化噬菌體抗體庫篩選針對VEGF-A的抗體Fab片段，篩選定型后進(jìn)一步構(gòu)建成的重組IgG全抗體，極大降低使用后人體的免疫反應(yīng)。2、本專利涉及的單克隆抗體具有針對VEGF-A的高親和力，能夠有效抑制新生血管的生長，可以治療多種腫瘤，在腫瘤治療中有顯著療效。3、本專利涉及的單克隆抗體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)量遠(yuǎn)高于國內(nèi)平均水平，達(dá)到克級/升。


圖 1. Vancolizumab 結(jié)構(gòu)示意圖2. Vancolizumab重鏈，輕鏈共表達(dá)載體示意圖3.純化后的Vancolizumab還原條件下SDS-PAGE電泳圖。Vancolizumab為IgG分子，50 kDa附近條帶為抗體重鏈，輕鏈條帶分子量約為25 kDa。圖4. ELISA測定抗體與抗原VEGF165特異性結(jié)合能力及抗體活性。與作為陽性對照的Avastin比較，在濃度分別為10，1,0. 1和0. 01 ug/ml時，Vancolizumab的活性與同等濃度的Avastin沒有明顯區(qū)別。本圖中數(shù)據(jù)為5次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。圖 5. Biacore T100 測試 Vancolizumab 的親和力。測試表明，Vancolizumab (圖 5B)與avastin (圖5A)對抗原VEGF的親和力相似?？贵w的濃度由上至下分別為32，16，8， 4,2,0 nM,每個濃度分別測試3次。圖6. Vancolizumab在CHO細(xì)胞中表達(dá)與生產(chǎn)流程圖。構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞后，篩選陽性克隆獲得穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞株逐級放大培養(yǎng)，最后在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
噬菌體表面展示技術(shù)篩選人源抗VEGF-A單克隆抗體Fab片段，，參照Dimitrova et al. 2009，Urushibata et al. 2010，Liu et al. 2011, Wang et al. 2011，
將新鮮制備的約IXlO11噬菌體抗體用固相抗原篩選。將噬菌體抗體加入hVEGF-A包被的免疫板中，37°C孵育1小時。用洗滌試劑PBST IX洗滌10次，去除未結(jié)合或親合力較弱的噬菌體抗體。胰酶(Trypsin/EDTA，Lonza)消化結(jié)合在抗原上的噬菌體，感染XL-I blue 大腸桿菌(Stratagene)。選取Wiage ELISA值最高的克隆，PCR擴(kuò)增(97°C變性IOs ；60°C 退火k ；70°C延伸30s ；35個循環(huán))其包含的Fab重鏈和輕鏈基因，得到人源化抗VEGF-A 單克隆抗體Fab片段基因。噬菌體抗體庫為公司自己構(gòu)建，具體方法為
1)提取抗VEGF-A強(qiáng)陽性的老年黃斑變性患者外周血淋巴細(xì)胞(1X107)的總RNA，提取使用QIAamp RNA Mini Kit (Qiagen)。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增Fab輕鏈(L)和重鏈(Fd)，擴(kuò)增引物Fd 鏈 3，端 5 ‘ — GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGA TTTGGG — 3 ‘；擴(kuò)增 Vh 段 5'端的引物為，VHla: 5' — CAGGTGCAGCTCGAG CAGTCTGGG — 3'，VaIf 5' 一 CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG—3 ‘，Vh 2f 5 ‘ — CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGG—3 ‘，Vh 3a 5' —GAGGTGCAGCTC GAGGAGTCTGGG—3 ‘ , VH3f 5' 一GAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG— 3 ‘ , VH4f 5 ‘ — CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG— 3 ‘ , VH6f 5 ‘ —CAGGTG CAGCTACTCGAGTGGGG—3‘ , VH6a 5' 一CAGGTACAGCTCGAGCAGTCA GG-3'；擴(kuò)增 κ 鏈 3' 端的引物— GCGCCGTCTAGAATTAACACT CTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGA
ACTCAG-3'；擴(kuò)增 κ 鏈 5'端的引物為VKla:5' — GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA— 3 ‘，Vk 2a 5 ‘ — GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCA—3 ‘，Vk 3a 5 ‘ — GAAATTGAGCTCACG CAGTCTCCA—3'，Vk Is 5' 一GACATCGAGCTCACCCAGTCTCC— 3‘。擴(kuò)增 λ 鏈 3'端引物 CL2 為5' — CGCCGTCTAGAATTA TGAACATTCTGTAGGC— 3 ‘。擴(kuò)增 λ 鏈 5'端引物為VlI 5' — AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC—3 ‘， VL2 5' 一TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG— 3'，Vl3 5' — TCTGTG GAGCTCCAGCCGCCCTCACTG— 3‘，VL4 5' 一TCTGAAGAGCTCCAGGAC CCTGTTGTGTCTGTG—3 ‘，VL5 5 ‘ — CAGTCTGAGCTCACGCAGCCCCCC—3 ‘，VL6 5 ‘ -CAG ACTGAGCTCACTCAGGAGCCC— 3 ‘。PCR 擴(kuò)增條件為94°C變性 4 ;52°C退火 4 ;72°C延伸 lmin。2)將PCR擴(kuò)增的輕鏈基因(lug)和pComb3質(zhì)粒(IOug)用Sac I和Xba I于37°C 雙酶切4小時。酶切產(chǎn)物純化后，于室溫下將輕鏈基因插入載體，純化后轉(zhuǎn)化XL-I blue大腸桿菌(Stratagene)。涂平板選取陽性菌株培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒獲得輕鏈基因文庫。用Bio I和Spe I對重鏈基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和構(gòu)建好的輕鏈基因文庫質(zhì)粒雙酶切，純化后連接并轉(zhuǎn)化XL-I blue大腸桿菌。涂平板選取陽性克隆，加入到100 ml SB培養(yǎng)液內(nèi)(含Amp 20 mg /1及Tet 10 mg /1 )搖動1 h，補(bǔ)加Amp至50 mg /1，繼續(xù)搖菌2 h。加入輔助噬菌體VCSM13 1 ml,繼續(xù)搖菌1 h，加入卡那霉素至終濃度為70 mg /1，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。次日，離心收集細(xì)菌培養(yǎng)上清，加入PEG 8000和NaCl，至終濃度分別為4%和3%，攪拌溶解置冰浴30 min后，于4°C以9000 rmp離心20 min。棄上清，沉淀懸浮于2 mlPBS(pH 7. 內(nèi)，即得噬菌體抗體庫。幻抗體庫的滴度測定用SB培養(yǎng)液將所制備的噬菌體抗體庫作ΙΧΚΛ Ο Ο11、 IO12)稀釋，分別加入100 μ 1 XL-I blue菌株(A600=l)。在室溫下感染20 min,涂LB平板(含Amp 100 mg/1)，于37°C培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)集落并計(jì)算出抗體庫的滴度3X10"。 實(shí)施例2
本實(shí)施例參照文獻(xiàn)〈〈Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition)) 作者 Joe Sambrook, Chapter 1,8,15 ；
1.Vancolizumab核苷酸序列設(shè)計(jì)和合成
該單抗重鏈Fab段包含篩選所得的抗VEGF IgG Fab重鏈可變區(qū)(Vh)和恒定區(qū)CHl段， Fc段包括恒定區(qū)CH2和CH3 ；輕鏈包括篩選所得的IgG Fab輕鏈可變區(qū)(\)和輕鏈恒定區(qū) (Cl)0重鏈CHl段中與輕鏈中的半胱氨酸(Cys)殘基共價形成二硫鍵，使重鏈和輕鏈形成二聚體結(jié)構(gòu)；CHl和CH2間鉸鏈區(qū)連接Fab和Fe，重鏈間二硫鍵也位于鉸鏈區(qū)。分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 Vh — CHl，V— Cl 和 Fc 段基因。Vh — CHl 5，-GGTCTAGATGATTATGAAAAAGAATATCGCA-3’，5’ -CTTCCACCTCCGCCGGAGCCATTTCTTGTCGACCTTGGTGTT-3‘ ；Vl-Cl :5’ -GGGCTAGCTGATTAT GAAAAAGAATATCGCA-3，，5，-GGCTCGAGATCAGCTTAACACTCTCCCCT-3‘ ；Fc :5，-GGCTCCGGCGGAGGT GGAAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC-3’，5 ’-ATCTGCGGCCGTCATTTACCCGGGGACAGGGAG-3 ’。VH— CHl 5’端加入損a I位點(diǎn)，F(xiàn)c 3’端加入Afoi I位點(diǎn)，\一Q 5’端加入Me I位點(diǎn)，3，端加入煬ο I位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增Vh—CH1，Vl — Cl和Fc三個片段(97°C變性IOs ；60°C退火5s ； 70°C延伸30s ；35個循環(huán))；將Vh_CH1和Fc擴(kuò)增產(chǎn)物混合，兩個片段可以通過鉸鏈區(qū)互補(bǔ)配對，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增(條件同上)，純化得到完整的Vancolizumab重鏈基因VH_CH。
2.Vancolizumab表達(dá)載體和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建
1)將Vancolizumab輕鏈基因和共表達(dá)載體pIRES (Clontech)用船e I和損ο I雙酶切。酶切后用Τ4連接酶將輕鏈與載體于室溫過夜連接，純化后得到pIRES-VfQ。將插入輕鏈的載體與重鏈基因用Xba I和I雙酶切，酶切產(chǎn)物用Τ4連接酶于室溫過夜連接， 純化后得到含Vancolizumab輕鏈和重鏈基因的共表達(dá)載體pIRES_Vf Cf IRES_VH_CH。2)用無菌水稀釋12ug構(gòu)建好的表達(dá)載體至200ul，之后將稀釋后的200ul載體加入含有慢病毒包裝質(zhì)粒pLV-iVSV-G和pLV-HELP的LENTI-Smart GnvivoGen)中，室溫靜置15min ；之后加入800ul無菌水使總體積達(dá)到Iml ；準(zhǔn)備IXlO7 HEK 293T細(xì)胞，加入12ml 預(yù)熱的培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基，含10% FBS，葡萄糖4. 5g/l，青霉素50U/ml，鏈霉素50ug/ml， 丙酮酸鈉lmM，L-谷氨酰胺4mM，非必需氨基酸0. ImM)，再加入Iml慢病毒載體混合物， 37°C培養(yǎng)12h ；更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 后收集培養(yǎng)基上清，4°C，2000 rpm離心5 min，再用0. 45um孔徑過濾器過濾上清，得到攜帶pIRES-Vf Cf IRES-Vh-Ch共表達(dá)載體的慢病毒顆粒；確定慢病毒滴度(3X105 TU/ml)。3)將IXlO5CHO細(xì)胞接入6孔板，加入:3ml DMEM培養(yǎng)基(成分如上)，24h后，每孔加入Iml含慢病毒的培養(yǎng)基上清(M0I=3) ’轉(zhuǎn)染24h后，移除含病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，同時加入400ug/ml的G418，連續(xù)篩選10天，存活的細(xì)胞即為穩(wěn)定表達(dá)Vancolizumab 輕鏈和重鏈的細(xì)胞株。
3. Vancolizumab的表達(dá)，分離和純化
經(jīng)鑒定的陽性CHO細(xì)胞株接入75cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含400ug/ml G418的DMEM 培養(yǎng)基(成分同上)，37° C培養(yǎng)。待細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底后，棄培養(yǎng)基，加入含蛋白酶抑制劑的檸檬酸鈉低滲液刮取收集并裂解細(xì)胞。13000 rpm，4° C離心收集上清。上清中的單抗用親和層析法(Protein G)和分子篩層析分離提純分子量為150 kDa左右的完整IgG分子。提純后的各個組分通過SDS-PAGE法鑒定，見圖3。具體方法
1).上樣應(yīng)用ftOtein G-Sepharose CL-4B親和層析法純化單克隆抗體，A KTA explorer 100進(jìn)行監(jiān)測。將裂解細(xì)胞收集的可溶蛋白混合物用0. 02M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋，以lml/min的流速上樣。2).洗脫用上樣緩沖液進(jìn)行流洗，10倍柱床體積，流速為lml/min。然后用 0.02M，pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體。同時用A KTA explorerlOO進(jìn)行監(jiān)測，當(dāng)出現(xiàn)洗脫峰時，取干凈的離心管收集。每收集3ml后，立即用1M，pH9. 0的Tris-HCl緩沖液調(diào)整pH 值至7.0。 實(shí)施例3
抗原抗體結(jié)合測試(ELISA法)本實(shí)施例參考Klettner et al. 2009, Li et al. 2011，Liu et al. 2011
1.包被用0.05M PH9.軸碳酸鹽包被緩沖液將抗原(VEGF165)稀釋至蛋白質(zhì)含量為 5ug / ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。2.加樣加一定稀釋的待檢抗體(Vancolizumab，avastin) 0. Iml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3.加酶標(biāo)抗體(羊抗人IgG):于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37°C孵育0.5 1小時，洗滌。4.加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0. Iml, 370C 10 30分鐘。5.終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸 0.05ml。6.結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + ”、“-”號表示。也可測OD值 在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD 值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2. 1倍，即為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果見圖4，ELISA測定抗體與抗原VEGF165特異性結(jié)合能力及抗體活性。與作為陽性對照的Avastin比較，在濃度分別為10，1,0. 1和0. 01 ug/ml時，Vancolizumab的活性與同等濃度的Avastin沒有明顯區(qū)別。本圖中數(shù)據(jù)為5次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。該單抗與抗原VEGF-A的結(jié)合能力與全抗體Avastin基本一致。 實(shí)施例4
Vancolizumab親和力測試使用表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmons Resonance, SPR),在 Biacore TlOO 上分別測試Vancolizumab和作為陽性對照的avastin對抗原h(huán)VEGF_A的親和力。1)用 HEPES (10 mM HEPES-KOH, pH 7. 6，150 mM NaCl)緩沖液將 hVEGF-A 稀釋為 lmg/ml，并以2 ul/min的流速通過芯片表面，持續(xù)1小時，使hVEGF_A固定在芯片上。2)使用0. IM的NaOH洗滌芯片，除去未結(jié)合的hVEGF_A。3)用0. 1 mg/ml的BSA以20 ul/min的流速通過芯片表面5分鐘，避免抗體的非
特異性結(jié)合。4)將純化后的Vancolizumab或avastin用HEPES緩沖液做梯度稀釋(0，2，4，8， 16，32 nM)，各濃度的抗體分別以20 ul/min的流速通過芯片表面，重復(fù)2次，每次實(shí)驗(yàn)之間用0. 1 M的HCl和0. 1 M的NaOH重生芯片。5)用BIAcore evaluation軟件分析抗原抗體的結(jié)合和解離曲線，結(jié)果見圖5A和圖5B，測試表明，Vancolizumab (圖5B)與avastin (圖5A)對抗原VEGF的親和力相似?？贵w的濃度由上至下分別為32，16,8,4,2,0 nM，每個濃度分別測試3次。參考文獻(xiàn)
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Vancolizumab對人肺癌H460裸小鼠異種移植腫瘤生長抑制試驗(yàn)取生長旺盛期的瘤組織剪切成1. 5mm3左右，在無菌條件下，接種于裸小鼠右側(cè)皮下。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100-200mm3后動物隨機(jī)分組。使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察被試動物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測量次數(shù)為每2天1次，每次測量同時還需稱量鼠重。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射Vancolizumab，每天1次，陰性組同時給等量生理鹽水。腫瘤體積計(jì)算公式TV=O. 52XaXb2
其中a、b分別表示長寬。根據(jù)測量的結(jié)果計(jì)算出相對腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評價指標(biāo)為相對腫瘤增殖率T/C (%)，計(jì)算公式如下 T/C(%) =Tetv/CetvX100% Tetv 治療組RTV ；Cetv 陰性對照組RTV
表1. Vancolizumab對人肺癌H460裸鼠異種移植腫瘤生長的抑制作用
權(quán)利要求
1.抗VEGF單克隆抗體Vancolizumab，其特征在于所述的抗體由2個相同的重鏈和輕鏈構(gòu)成，同時兩條重鏈通過二硫鍵結(jié)合，形成標(biāo)準(zhǔn)的抗體全分子；其中SEQ. 1 — SEQ. 2 與SEQ. 5相連接構(gòu)成抗體的重鏈部分，SEQ. 3和SEQ. 4結(jié)合構(gòu)成抗體的輕鏈部分；同時 SEQ. 2通過二硫鍵與SEQ. 4結(jié)合，SEQ. 1和SEQ. 2連接構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合片段Fab。
2.抗VEGF單克隆抗體Vancolizumab在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本專利涉及抗VEGF單克隆抗體Vancolizumab及其應(yīng)用，抗VEGF單克隆抗體Vancolizumab，其特征在于所述的抗體由2個相同的重鏈和輕鏈構(gòu)成，同時兩條重鏈通過二硫鍵結(jié)合，形成標(biāo)準(zhǔn)的抗體全分子；其中SEQ.1—SEQ.2與SEQ.5相連接構(gòu)成抗體的重鏈部分，SEQ.3和SEQ.4結(jié)合構(gòu)成抗體的輕鏈部分；同時SEQ.2通過二硫鍵與SEQ.4結(jié)合，SEQ.1和SEQ.2連接構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合片段Fab，保持對抗原VEGF的高特異性和高親和力，且鼠源比例低，不易引起人體免疫反應(yīng)；半衰期長，可以減少病人用藥次數(shù)。
文檔編號A61K39/395GK102276723SQ20111023455
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者葉亞東, 朱文華, 滕凌, 潘鸝, 路易斯易格那羅, 霍世元 申請人:常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司