專利名稱：抑制可卡因誘發(fā)的高運動活性的多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種抑制可卡因誘發(fā)的高運動活性的多肽及其應用。
背景技術：
可卡因，是目前吸食非常普遍的一種成癮性精神興奮藥物。可卡因成癮也是對人類健康以及社會安定具有著嚴重危害的疾病。可卡因急性刺激，可以誘發(fā)運動活性增高。這主要是由于可卡因可以抑制突觸前膜的多巴胺轉運體，從而阻斷多巴胺的重攝取，導致突觸部位多巴胺濃度增高。可卡因誘發(fā)運動活性的程度，則可以反映出機體對于可卡因的行為學敏感性，進而為研究可卡因成癮的分子機制及其治療提供某些啟示。多巴胺刺激，可以激活突觸后膜的多巴胺受體。多巴胺受體，屬于典型的G蛋白偶聯受體，具有典型的七次跨膜結構。多巴胺受體主要有5種亞型，即D1、D2、D3、D4和D5受體，根據其偶聯的G蛋白類型以及對于腺苷酸環(huán)化酶的作用，可以分為Dl樣受體，包括Dl 和D5受體，以及包括D2、D3和D4受體在內的D2樣受體。Dl樣受體與興奮性Ga s蛋白偶聯，激活腺苷酸環(huán)化酶；D2樣受體則相反，與抑制性Gai蛋白偶聯，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性。多巴胺系統(tǒng)對于運動的調節(jié)，主要集中在基底節(jié)部位。錐體外系運動受到基底神經節(jié)的神經環(huán)路調控，黑質-紋狀體DA系統(tǒng)是其中重要的神經環(huán)節(jié)，紋狀體是調控中心部位?；咨窠浌?jié)內含直接和間接兩種神經環(huán)路。直接環(huán)路由大腦皮質一紋狀體一黑質網狀區(qū)(SNR)—丘腦一大腦皮質；間接環(huán)路大腦皮質一紋狀體一蒼白球外側區(qū)(GPe)—底丘腦(STN)—蒼白球內側區(qū)(GPi)—丘腦一大腦皮質。生理情況下，由黑質網狀區(qū)和蒼白球內側區(qū)輸出緊張性抑制沖動，作用于丘腦。時相性興奮，激活直接環(huán)路，使丘腦去抑制，增強丘腦-皮質神經元活動；而激活間接環(huán)路，進一步抑制丘腦-皮質神經元活動。其結果是， 直接環(huán)路能夠增強運動功能，而間接環(huán)路抑制運動功能。它們受到黑質-紋狀體DA系統(tǒng)調控，Dl受體易化直接環(huán)路傳遞，而D2受體減弱間接環(huán)路傳遞。雖然突觸功能不相同，DA對兩環(huán)路產生的效果是一致的，減弱丘腦-皮質神經元的抑制，易化從皮質始發(fā)的運動功能。 而現有研究證據證實，可卡因敏化現象，主要傾向于激活直接環(huán)路的Dl受體。研究證據表明，激活Dl受體可以增強可卡因誘發(fā)的運動活性?？煽ㄒ虼碳?，突觸部位的多巴胺水平增高，進而可以激活黑質紋狀體神經元內的Dl受體。通過cAMP/PKA信號通路，Dl受體可以增強這些神經元對于谷氨酸的興奮性，因而黑質紋狀體直接通路的信號傳出和所誘發(fā)的運動活性。反之，Dl受體敲除的小鼠，對于可卡因的運動活性增強反應減弱甚至消失。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供了一種抑制可卡因誘發(fā)高運動活性的多肽及其應用。本發(fā)明提供的多肽，為如下所示a)或b)或C)或d)
a)、由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；b)、由序列表中序列1自5’末端第412-425位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；C)、由序列表中序列1自5’末端第3四_446位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；d)、將a)或b)或c)限定的多肽的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分別有a)或b)或c)限定的多肽衍生的多肽。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由23個氨基酸殘基組成，序列表中的序列1由446個氨基酸殘基組成。所述多肽的編碼基因也是本發(fā)明保護的范圍。所述基因是如下1)-5)中任意一種的DNA分子1)序列表中序列5所示的DNA分子；2)序列表中序列6自5’末端第1234-1275位核苷酸；3)序列表中序列6自5’末端第985-1338位核苷酸；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子。所述嚴格條件為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列5由72個核苷酸組成，序列表中的序列6由1341個核苷酸組成.含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系也是本發(fā)明保護的范圍。所述的多肽、所述的編碼基因、所述的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系在制備抑制成癮藥物誘發(fā)人或動物高運動活性藥物中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述成癮藥物為可卡因，所述動物為大鼠，所述高運動活性通過提高運動路程值體現。所述抑制成癮藥物誘發(fā)動物高運動活性通過如下1)-3)中至少一種實現1)抑制I型多巴胺受體的磷酸化；2)抑制I型多巴胺受體的細胞質膜定位；3)抑制I型多巴胺受體的下游信號分子的磷酸化；所述I型多巴胺受體的的氨基酸序列為序列表中的序列1 ；所述下游信號分子為ERK(I型多巴胺受體的下游信號分子)和/或CREB (轉錄 ia^if^AMP EMjti^^·^^ (cAMP response elements binding protein, Ι^,ΤΜ^ CREB))，所述ERK的氨基酸序列為序列表中的序列7 ；所述CREB的氨基酸序列為序列表中的序列8。
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所述抑制I型多巴胺受體的磷酸化是通過所述多肽競爭性抑制I型多巴胺受體的第421位絲氨酸的磷酸化實現的。所述I型多巴胺受體的第421位絲氨酸為序列表序列1自5’末端第412位氨基酸或序列表序列2自5’末端第19位氨基酸。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制可卡因誘發(fā)的人或動物高運動活性的藥物。本發(fā)明提供的藥物，其活性成份為所述的多肽、所述的編碼基因、所述的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現I型多巴胺受體(D1 dopamine receptor,以下簡稱D1R，氨基酸殘基序列為序列1)可以被蛋白激酶Dl (protein kinase D1，以下簡稱PKD1) 磷酸化，由于第三胞內環(huán)2 位絲氨酸在人類序列中已經突變?yōu)楸彼幔粫涣姿峄?，因此只考慮了 C末端的421位絲氨酸。DlR-CT (Dl受體C末端)-S421是根據421位絲氨酸附近的氨基酸殘基序列，包含了 PKDl的磷酸化偏好序列選取的核心序列，據此序列，構建具有穿膜能力的TAT融合肽Tat-D1R-CT-S421。體外激酶磷酸化實驗表明，Tat-D1R-CT-S421 可以干擾PKD1對DIR-CT的磷酸化，使其磷酸化程度降至對照組的53. 39 士 5. 62 % (P < 0. 05)。背側紋狀體核團注射實驗表明，Tat-D1R-CT-S421使PKDl對DlR-CT的磷酸化程度降至對照組的45. 98士 17. 69% (P < 0. 05)?？煽ㄒ蛘T發(fā)運動活性行為學實驗表明， 與對照組Tat-D1R-CT-S421A相比，在可卡因注射后20_50min，Tat_DlR-CT_S421可以使可卡因誘發(fā)的運動活性幅度減弱至對照組的55. 46士 12. 50% (P < 0. 05)。并且這種行為學抑制作用是通過抑制DlR的細胞質膜定位和下游信號轉導來實現的。SK-N-MC細胞系實驗表明，Tat-D1R-CT-S421可以顯著降低DlR的細胞質膜定位和下游信號分子細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，以下簡稱ERK)的磷酸化程度。背側紋狀體核團注射實驗表明，Tat-D1R-CT-S421可以使DlR的細胞質膜定位降至對照組的64. 80 士 12. 95%，而其下游信號分子ERK及轉錄因子環(huán)化AMP反應元件結合蛋白(cAMP response elements binding protein，以下簡稱CREB)的磷酸化程度以及即刻早期基因 c-fos的蛋白水平顯著降低。以上結果表明，Tat-D1R-CT_S421通過干擾PKDl對于DlR C末端421位絲氨酸的磷酸化程度，進而抑制DlR的細胞質膜定位和下游信號轉導，繼而抑制可卡因誘發(fā)的高運動活性。因此，本發(fā)明的多肽及其編碼基因在抑制可卡因誘發(fā)的高運動活性方面具有廣闊的應用前景?？s寫詞D1多巴胺受體(DlR)；可卡因(cocaine)；細胞外信號調節(jié)激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK) ； ￠^ERK(phosphorylated ERK, pERK)；環(huán)化 AMP 反應元件結合蛋白(cyclic AMP response element binding protein, CREB)；磷酸化 CREB (phosphorylated CREB, pCREB) ； S卩刻早期基因 c-fos ；多巴胺 (dopamine, DA)。


圖1為PKDl對DlR磷酸化位點的鑒定圖2為Tat-D1R-CT-S421對PKDl磷酸化DlR C末端421位絲氨酸的影響圖3為Tat-D1R-CT_S421對DlR-CT 421位絲氨酸磷酸化的影響
圖4為Tat-D1R-CT_S421對可卡因誘發(fā)運動活性的影響圖5為Tat-D1R-CT_S421減弱DlR在細胞質膜的定位圖6為Tat-D1R-CT_S421抑制DlR下游信號轉導
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、PKDl (蛋白激酶Dl)磷酸化DlRC末端具體磷酸化位點的鑒定一、連有GST標簽的蛋白的制備I型多巴胺受體(以下簡稱DlR)全長446個氨基酸，屬于典型的G蛋白偶聯受體， 具有經典的七次跨膜結構，因此將Dl受體分段，分別定義為N末端，第一跨膜結構域，第一胞內環(huán)，第二跨膜結構域，第一胞外環(huán)，第三跨膜結構域，第二胞內環(huán)，第四跨膜結構域，第二胞外環(huán)，第五跨膜結構域，第三胞內環(huán)，第六跨膜結構域，第三胞外環(huán)，第七跨膜結構域，C 末端(圖la)。I型多巴胺受體的氨基酸序列為序列表中的序列1，其核苷酸序列為序列6。本實施例中使用如下肽段DlR-CT-WT(序列表中的序列1所示自5’末端第 329-446位氨基酸，DlR蛋白N端起第3四_446位氨基酸肽段)、D1R_CT_S421A (將DlR-CT-WT 的第421位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬碾亩?、D1R-CT-無關突變(將D1R-CT421位以外的氨基酸殘基突變后的肽段，序列4)、D1R-IL3-WT(序列表中的序列1自5’末端第212-268位氨基酸)、D1R-IL3-S229A (將D1R-IL3-WT的第2 位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、D1R_IL3_S256A (將 D1R-IL3-WT 的第 256 位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、D1R_IL3_S2^A+S256A (將 D1R-IL3-WT 的第2 位絲氨酸和第256位絲氨酸同時突變?yōu)楸彼?，實驗時在各肽段前加GST標簽。幾種帶有GST標簽的蛋白的制備如下構建原核表達載體然后進行制備。GST-tag 菌體裂解液10mM PMSF/1 XPI/1 XPBS ；GST-tag elution buffer IOmM 還原型谷胱甘肽(Roche), 50mM Tris-Cl (pH8. 0)表1、引物對序列表
6序號質粒名稱酶切位點引物1pGEX-5X-1-D1R-IL3BamHi5' - AGCGGATCCCCAGTATCTACAGGATTGCCC -3'Xhol5' - AGCCTCGAGCGTCTCCCTCTTGAAGGACAT -3’2PGEX-5X-1-D1R-CTBamHi5' -AGCGGATCCCCATTATTTATGCTTTTAATGCT -3'XhoI5' - AGCCTCGAGTCAAGTGGAATGCTGTCCACT -3'3pGEX-5X-1-D1R-S421A5‘ -CTGTCCCCAGCCTTAGCGGTCATATTGGACTat-3’5' -ATAGTCCAATATGACCGCTAAGGCTGGGGACAG -3’4PGEX-5X-1-D1R-S229A5' -CAAATCCGGCGCATCGCAGCCTTGGAGAGGGCA -3’5' - TGCCCTCTCCAAGGCTGCGATGCGCCGGATTTG -3’5pGEX-5X-1-D1R-S256A5' -GTCGAATGCGCCCAGGCTGAAAGTTCCTTTAAG -3’5' CTTAAAGGAACTTTCAGCCTGGGCGCATTCGAC 3'分別連有GST標簽的蛋白的制備1)各蛋白的編碼基因的擴增以雄性SD大鼠(北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部) 紋狀體(具體提取方法如后所述)cDNA (提取RNA，反轉錄獲得cDNA)為模板，分別以表1中所示序列為引物，進行PCR擴增，分別得到如下多肽片段的PCR產物，將PCR產物進行測序驗證，結果產物序列正確DlR-CT-WT的核苷酸序列為序列表中序列6自5’末端第985-1338位核苷酸；氨基酸序列為序列表中序列1自5’末端第3四-446位氨基酸，采用的引物為表1中的引物對 2。D1R-IL3-WT的核苷酸序列為序列表中序列6自5’末端第634-804位核苷酸；氨基酸序列為序列表中序列1自5’末端第212-268位氨基酸，采用的引物為表1中的引物對 1。2)點突變質粒載體的構建采用 Stratagene QuikchangeR XL site-directed mutagenesis kit， USA， CAT# 200517-5進行點突變，具體步驟如下PCR擴增反應體系
5XPrimeSTAR buffer10 μ 1
dNTP mix2μ 1
D1R-CT-WT/D1R-IL3-WTIOOng
DMSO2. 5μ 1
5，primer(lOOng/μ 1)1. 25μ 1
3，primer(lOOng/μ 1)1. 25μ 1
PrimeSTAR HS polymerase1 μ 1
力口 ddH20 至 50 μ 1
反應條件
權利要求
1.一種多肽，為如下所示a)或b)或c)或d):a)、由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；b)、由序列表中序列1自5’末端第412-425位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；c)、由序列表中序列1自5’末端第329-446位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；d)、將a)或b)或c)限定的多肽的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的分別有a)或b)或c)限定的多肽衍生的多肽。
2.權利要求1中所述多肽的編碼基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)-5)中任意一種的DNA分子1)序列表中序列5所示的DNA分子；2)序列表中序列6自5’末端第1234-1275位核苷酸；3)序列表中序列6自5’端第985-1338位核苷酸；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的多肽的 DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系。
5.權利要求1所述的多肽、權利要求2或3所述的編碼基因或權利要求4所述的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系在制備抑制成癮藥物誘發(fā)人或動物高運動活性藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述成癮藥物為可卡因，所述動物為大鼠， 所述高運動活性通過提高運動路程值體現。
7.一種抑制可卡因誘發(fā)的人或動物高運動活性的藥物，其活性成份為權利要求1所述的多肽、權利要求2或3所述的編碼基因或權利要求4所述的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制可卡因誘發(fā)高運動活性的多肽及其應用。本發(fā)明提供的多肽，為如下所示a)或b)或c)或d)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；b)由序列表中序列1自5′末端第412-425位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；c)由序列表中序列1自5′末端第329-446位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的多肽；d)將a)或b)或c)限定的多肽的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分別有a)、b)或c)限定的多肽衍生的多肽。本發(fā)明的實驗表明，本發(fā)明的多肽對于降低機體對于可卡因刺激的行為學敏感性具有重要意義。
文檔編號A61K48/00GK102276731SQ20111023507
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權日2011年8月16日
發(fā)明者康凱, 王寧, 王韻, 蘇萍 申請人:北京大學