專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具抗β-乳球蛋白過(guò)敏效果的乳桿菌完整肽聚糖的制備方法、產(chǎn)品及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肽聚糖的制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種乳桿菌的完整肽聚糖的制備方法，還涉及由該完整肽聚糖制備成的微乳制劑，其制備方法及其在制備抗β-乳球蛋白過(guò)敏的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛乳營(yíng)養(yǎng)豐富，是嬰幼兒重要的食物蛋白來(lái)源。但據(jù)國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查表明， 2% 6%的兒童對(duì)牛乳產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重影響其對(duì)優(yōu)質(zhì)乳蛋白的吸收利用。β-乳球蛋白(β-lactglobulin)被視為最主要的牛乳過(guò)敏原蛋白之一，β-乳球蛋白對(duì)小牛具有類(lèi)似免疫球蛋白的功能，但對(duì)于嬰兒來(lái)說(shuō)卻是主要的過(guò)敏原，容易造成嬰兒的過(guò)敏反應(yīng)， β-乳球蛋白主要誘發(fā)特異性IgE抗體介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，可引起嘔吐、腹痛和腹瀉等胃腸不適。且過(guò)敏引起的胃腸道疾病(如嬰幼兒結(jié)腸炎)常致兒童生長(zhǎng)遲緩。如何減少乳球蛋白所致牛乳過(guò)敏癥已成為現(xiàn)代乳制品生產(chǎn)中急待解決的問(wèn)題。申請(qǐng)者三年來(lái)在益生菌調(diào)節(jié)Thl/Th2失衡緩解β -乳球蛋白過(guò)敏方面取得了一定的研究成果，篩選到一株對(duì)IgE介導(dǎo)的乳球蛋白過(guò)敏具有較好療效的約氏乳桿菌 KLDS1. 7032，并新發(fā)現(xiàn)該約氏乳桿菌抗過(guò)敏的作用與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)，其細(xì)胞壁肽聚糖是抑制過(guò)敏的主要成分。目前，對(duì)完整肽聚糖的生理功能及功能機(jī)制研究的較多，而對(duì)其產(chǎn)品制備方法的研究較少。現(xiàn)有細(xì)胞壁肽聚糖基本采用注射方式給藥，存在口服生物利用度低及過(guò)高劑量會(huì)引起不良反應(yīng)的問(wèn)題。而微乳是一新型理想的藥物釋放載體。具有透明，穩(wěn)定吸收完善， 靶向釋藥等特點(diǎn)，并提高了藥物療效，降低毒副作用。臨床應(yīng)用價(jià)值日益提高，具有很大的發(fā)展前景。因此，本發(fā)明將提取的乳桿菌完整肽聚糖制備成微乳制劑，其經(jīng)口服到達(dá)體內(nèi)后，可自發(fā)形成粒徑小于IOOnm的0/W微乳，由于藥物以分子形式分散于微乳中，可明顯提高藥物的釋放度，穩(wěn)定性增加，口服生物利用度是普通制劑的3 4倍，為新型免疫增強(qiáng)劑的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是公開(kāi)了乳桿菌完整肽聚糖微乳在制備抗 β-乳球蛋白過(guò)敏的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用；特別是應(yīng)用于制備抗IgE介導(dǎo)的乳球蛋白過(guò)敏的免疫增強(qiáng)劑中。所述的免疫增強(qiáng)劑可進(jìn)一步用于抗β -乳球蛋白過(guò)敏的藥物或食品制備中。優(yōu)選的，所述的乳桿菌完整肽聚糖是從約式乳桿菌KLDS1. 7032中提取的。所述的約氏乳桿菌KLDS1. 7032，為乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為CGMCCN0. 5050，保藏日期為2011年7月
48曰。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供了一種制備乳桿菌完整肽聚糖的方法，具體的包括以下步驟(1)菌體的清洗與收集將約氏乳桿菌菌種活化傳代后，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)18h ；培養(yǎng)完畢后迅速降溫至4°C。在5000g、4°C離心20min，收集菌體沉淀；4°C蒸餾水反復(fù)洗滌至菌體白色，收集菌體，置于100°C沸水水浴箱中滅活30min，得到熱致死菌泥；(2)去磷壁酸將步驟(1)所述的熱致死菌泥懸浮于預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，5000g、4°C離心15min，收集沉淀；(3)脫脂濃度為0. 02mol/L，pH值為4. 6的乙酸鈉溶液，與氯仿、甲醇，三者按體積比4 5 10混合；用混合液溶解步驟( 得到的沉淀，所述混合液的體積比與沉淀體積比為15 1 ；室溫?cái)嚢?8h，8000g、4°C離心20min，收集沉淀；(4)去蛋白上述步驟(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀體積的含有;3mg/mL胰蛋白酶和;3mg/mL堿性蛋白酶的pH 8. 0的0. lmol/L磷酸緩沖液，37°C水浴振蕩12h，以5000g、 4°C離心5min，沉淀用去離子水洗2次；(5)提純步驟(4)得到的沉淀經(jīng)0. Olmol化―1硫酸溶液85 95°C處理5min。冰水浴中立即冷卻，12000g、4°C離心30min后棄上清，沉淀用去離子水在4°C條件下連續(xù)透析 7天，冷凍干燥后置4°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供了一種按照以上所述的制備方法制備得到的完整肽聚糖。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供了一種抗乳球蛋白過(guò)敏的微乳制劑， 其特征在于包括有效劑量的以上所述的完整肽聚糖微乳作為活性成分、還包括油相、表面活性劑、助表面活性劑和水。優(yōu)選的，所述的表面活性劑為吐溫-80，所述的助表面活性劑為無(wú)水乙醇，所述的油相為正丁酸乙酯和維生素E的混合物。更優(yōu)選的，所述的微乳制劑包括以下重量分?jǐn)?shù)的各物質(zhì)以上任一所述的完整肽聚糖3. 00%，質(zhì)量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E組成的混合物1.07% 13.59%， 質(zhì)量比為2 8的吐溫-80和無(wú)水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%，及水58. 00% 89. 00%。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之五是提供了制備所述的抗乳球蛋白過(guò)敏的微乳制劑的方法，其特征在于是由以下方法制備得到的將質(zhì)量比為2 8的吐溫-80和無(wú)水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%分散于58. 00% 89. 00%水中成水相，質(zhì)量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E的混合物1.07% 13. 59%為油相，所述的完整肽聚糖3. 00%加入油相中，兩相分別預(yù)熱至70°C，將油相和水相混合后經(jīng)高速剪切乳化機(jī)在 BOOOrpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍體積的生理鹽水稀釋6倍，再采用高壓均質(zhì)機(jī)在 70MPa的壓力下均質(zhì)6次，調(diào)節(jié)pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min，即得微乳制劑。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之六是提供了所述的微乳制劑在制備抗乳球蛋白過(guò)敏免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。本研究基于乳酸菌與抑制食物過(guò)敏的發(fā)生、發(fā)展之間的緊密聯(lián)系，通過(guò)建立BLG致敏動(dòng)物模型，研究給予肽聚糖微乳對(duì)致敏模型動(dòng)物過(guò)敏反應(yīng)的干預(yù)作用，說(shuō)明了由完整肽聚糖制成的肽聚糖微乳制劑經(jīng)口服到達(dá)體內(nèi)后，能有效刺激淋巴細(xì)胞分泌IL-12和 IFN- γ，降低IL-4水平，逆轉(zhuǎn)Th2細(xì)胞過(guò)度亢進(jìn)，在抑制IgE介導(dǎo)的β -乳球蛋白過(guò)敏炎癥中發(fā)揮了重要作用。在開(kāi)發(fā)具有抗過(guò)敏性能的免疫增強(qiáng)劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為為乳酸菌及其菌體成分防治食物過(guò)敏提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于制備的乳桿菌完整肽聚糖微乳組合物，遇體液可自發(fā)形成納米級(jí)粒徑的微乳，可明顯提高藥物的溶解度，增加藥物穩(wěn)定性、提高藥物的生物利用度；乳桿菌完整肽聚糖制備方法簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定；制備得到的完整肽聚糖采用微乳作為藥物載體制成口服完整肽聚糖微乳，在開(kāi)發(fā)具有抗過(guò)敏性能的免疫增強(qiáng)劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖1為約氏乳桿菌的顯微鏡鏡檢圖；圖2為約氏乳桿菌的透視電鏡圖；圖3Sekine提取肽聚糖的透視電鏡圖㈧與本發(fā)明的改良法提取肽聚糖的透視電鏡圖⑶；圖4為肽聚糖微乳對(duì)BLG致敏小鼠血清中總IgE、BLG特異性IgE和總IgG的影響。1 空白微乳組；2 致敏組；3 肽聚糖組；4 肽聚糖微乳組
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1乳桿菌完整肽聚糖、完整肽聚糖微乳的制備1. 1. 1實(shí)驗(yàn)菌株約氏乳桿菌KLDS1. 7032由嬰兒腸道中篩選得到，約氏乳桿菌KLDS1. 7032，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC 5050，保藏日期為2011年7月8日。1.1. 2實(shí)驗(yàn)試劑鹽酸、濃硫酸、磷酸、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、無(wú)水乙醇(食用級(jí))、正丁酸乙酯、甲醛、甲醇、丙酮、過(guò)氧化氫、高氯酸、抗壞血酸、乙酸、乙醚、乙酸內(nèi)酮、苯酚、氯仿、葡萄糖、膽固醇、溶菌酶、Tris、乙酸鈉、苯酚、Triton X-100, SDS，胰蛋白酶、堿性蛋白酶(均為分析純，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)。結(jié)晶紫、碘液、沙黃(均為分析純，Sigma公司)。吐溫-80、維生素E(市售，食品級(jí))。對(duì)二甲氨基苯甲醉、氨基葡萄糖等(均為分析純，購(gòu)自南京博爾迪生物科技有限公司)。去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。1. 1.3實(shí)驗(yàn)儀器
阿貝折光儀上海光學(xué)儀器廠(chǎng)
FA25型高剪切分散乳化機(jī)上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司
激光粒徑儀
美國(guó)PSS公司
6
定氮儀KDN-04B上海新嘉電子有限公司
氨基酸分析儀835-50日本HITACHI
核酸蛋白檢測(cè)儀HD-2上海滬西分析儀器
LGJ-I冷凍干燥機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠(chǎng)
UV-2401PC分光光度計(jì)日本島津林式會(huì)社
離子色譜DIONEX 1(^2500
倒相型系統(tǒng)光學(xué)顯微鏡奧林巴斯光學(xué)エ業(yè)林式會(huì)社
透射電鏡日本日立H-7650
核酸/蛋白質(zhì)分析儀DU-800Beckman Coulter
光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS )奧林巴斯光學(xué)エ業(yè)林式公社
酸度計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司
高壓均質(zhì)機(jī)Niro Soavi-NS 1001L
恒溫磁力撹拌器常州國(guó)華電器有限公司
電導(dǎo)率儀梅特勒-托利多儀器有限公司1. 2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1乳桿菌完整肽聚糖的提取(1)菌體的清洗與收集將約氏乳桿菌菌種活化傳代后，按3%接種于IOOOmLMRS 液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)18h ；培養(yǎng)完畢后迅速降溫至4°C。在5000g、4°C離心20min， 收集菌體沉淀；4°C蒸餾水反復(fù)洗滌至菌體白色，收集菌體，置于100°C沸水水浴箱中滅活 30min，得到熱致死菌泥；(2)去磷壁酸將步驟(1)所述的熱致死菌泥懸浮于200mL預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，5000g、4°C離心15min，收集沉 淀；(3)脫脂用濃度為0. 05mol/L乙酸調(diào)節(jié)濃度為0. 02mol/L乙酸鈉溶液pH值至 4. 6，將上述溶液混合后再與氯仿、甲醇，三者按體積比4 5 10混合。用混合液溶解步 驟⑵得到的沉淀，體積比為15 1。室溫?cái)嚢?8h，8000g、4°C離心20min，收集沉淀。(4)去蛋白上述步驟C3)得到的沉淀中加入15倍沉淀體積的胰蛋白酶和堿性蛋 白酶磷酸緩沖液(3mg/mL胰蛋白酶和:3mg/mL堿性蛋白酶；0. lmol/L磷酸緩沖液；pH 8. 0)， 37°C水浴振蕩12h，以5000g、4°C離心5min，沉淀用去離子水洗2次。(5)提純步驟(3)得到的沉淀經(jīng)0. Olmol じ1硫酸溶液IOmL 95°C處理5min。冰 水浴中立即冷卻，12000g、4°C離心30min后棄上清，沉淀用去離子水在4°C條件下連續(xù)透析 7d，冷凍干燥后置4°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 2肽聚糖提取物的化學(xué)鑒定(1)乳桿菌完整肽聚糖形態(tài)學(xué)檢查采用顯微鏡(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)和透射電鏡(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心)觀察。(2)乳桿菌完整肽聚糖化學(xué)組分分析i Morgan-Elson比色法測(cè)定氨基己糖取一定量的完整肽聚糖樣品用經(jīng)6mol/L 鹽酸105°C水解lOhrs，用2mol/L碳酸鈉中和至pH7.0。取IOmL帶塞刻度試管，加入樣液 2mL,加入ImL乙酞丙酮試劑，搖勻，沸水浴30min，取出冰水冷卻，加入2mL無(wú)水乙醇、ImL對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑，搖勻，用無(wú)水乙醇補(bǔ)至10mL，于60°C水浴保溫1小時(shí)，冷卻，在30min 內(nèi)530nm下測(cè)定吸光值。同法以100 μ g/mL氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品濃度計(jì)算一含量。 蛋微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)采用國(guó)標(biāo)GB/T5009. 5-850測(cè)定蛋白質(zhì)含量。iii中性糖的測(cè)定精密稱(chēng)取105°C干燥至恒重的葡萄糖10mg，置IOOmL容量瓶中，用蒸餾水溶解混勻，定容成lOOmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0. lmL、0. 2mL、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL、0. 7mL至IOmL帶塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)足體積至ImL作為標(biāo)準(zhǔn)管，取蒸餾水ImL作為空白對(duì)照管，取檢測(cè)樣品ImL作為檢測(cè)管，分別向各管加入1. 4mL 5%苯酚搖勻，濃硫酸5mL搖勻，置100°C水浴25min，在490nm處檢測(cè)各管吸光度值，計(jì)算和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并按以下公式推算出樣品中的糖含量多糖含量(％) =CXDXV/WX100其中C為樣品中葡萄糖濃度(yg/mL)，D為樣品的稀釋倍數(shù)，V為樣品體積(mL)， W為樣品重量(mg)iv總脂肪的測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液與乙醇搖勻后，分別取0. 2mL，加入濃硫酸混勻后 100°C水浴IOmin使脂類(lèi)水解，冷卻至室溫后加入顯色劑，室溫靜置20min，于525nm處測(cè)定光吸收，取兩管平均值，以標(biāo)準(zhǔn)膽固醇含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?？傊瑴y(cè)定程序同上，測(cè)得光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得總脂含量。ν氨基酸的測(cè)定測(cè)定方法采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14965-1994。取一定量的肽聚糖提取物，用6mol/L鹽酸110°C真空水解20hrs，用日立835-50型氨基酸分析儀分別測(cè)定氨基酸組成。vi微量磷法測(cè)核酸根據(jù)核酸為含磷的有機(jī)化合物，其含磷量為9. 5%，因此，可以通過(guò)有機(jī)磷總磷一無(wú)機(jī)磷的含量來(lái)計(jì)算出核酸的含量。(3)溶菌酶溶解試驗(yàn)稱(chēng)取肽聚糖提取物，以pH6. 2的磷酸鹽緩沖液配成lmg/mL溶液，加蛋清溶菌酶 200 μ g/mL,可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)A450后，37°C，120r/min震蕩處理，分別于不同時(shí)間測(cè)A45(1。(4)提取乳桿菌完整肽聚糖得率的計(jì)算本試驗(yàn)用用三批生產(chǎn)菌粉提取肽聚糖，計(jì)算出kkine法和改良法提取約氏乳桿菌肽聚糖的得率。1. 2. 3肽聚糖微乳制備及其類(lèi)型的鑒別方法本實(shí)驗(yàn)通過(guò)偽三元相圖法研究肽聚糖微乳的形成條件，并對(duì)所制備肽聚糖微乳的粒徑大小、分布范圍、初步理化性質(zhì)、微乳形態(tài)及體系類(lèi)型等進(jìn)行研究。(1)肽聚糖微乳的制備稱(chēng)取吐溫-802. 348g，無(wú)水乙醇9. 392g，分散于79g水中成水相，稱(chēng)取4. 382g正丁酸乙酯，維生素E 1.878g混合成溶液做為油相，實(shí)施例1. 2. 1節(jié)制備得到的完整肽聚糖3g加入油相中，兩相分別預(yù)熱至70°C，將油相和水相混合后經(jīng)高速剪切乳化機(jī)在6000rpm下剪切5min制得IOOg粗乳，加入5倍體積的生理鹽水稀釋6倍，再采用高壓均質(zhì)機(jī)在70MPa的壓力下均質(zhì)6次，調(diào)節(jié)pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min， 即得微乳制劑。(2)微乳的鑒別方法性狀透明或略帶乳光的溶液，偏光顯微鏡下無(wú)雙折射現(xiàn)象。離心法采用lOOOOr/min離心15min，觀察其是否分層及是否維持澄明，如仍維持澄明可判為微乳。染色法利用油溶性染料蘇丹紅和水溶性染料亞甲蘭在微乳中紅色或藍(lán)色的擴(kuò)散快慢來(lái)判斷微乳的類(lèi)型，若紅色擴(kuò)散快速于藍(lán)色則為W/0型微乳；反之為0/W型。折光率按文獻(xiàn)規(guī)定方法恒溫20°C測(cè)定粒徑取少量靜置1周的微乳樣品，用去離子水稀釋至樣品含水量約為98%，用旋渦混合器混合均勻，再經(jīng)過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，過(guò)膜后的樣品注入納米粒度分布儀的樣品池中，設(shè)定溫度為25°C和各種油相的折光率，進(jìn)行粒徑測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。1. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.3. 1肽聚糖外觀檢查所得乳桿菌肽聚糖為乳白色外觀呈棉絮狀分布，在水中分布均勻易發(fā)生沉降。 顯微鏡鏡檢圖如圖1所示，透視電鏡圖如圖2所示，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取工藝的摸索，對(duì)比 Sekine提取肽聚糖方法，確定了最佳提取約氏乳桿菌肽聚糖的改良法，由于條件溫和，且整個(gè)純化過(guò)程中不使用任何物理與化學(xué)方法破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，因此分離得到了細(xì)胞骨架完整的肽聚糖，通過(guò)透射電鏡觀察所提取到的細(xì)胞骨架呈現(xiàn)袋狀結(jié)構(gòu)，如圖3所示。1. 3. 2約氏乳桿菌肽聚糖的主要成分本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)行摸索的改良法提取約氏乳桿菌肽聚糖，其主要成分為蛋白質(zhì)和中性糖，含量分別為和40%，其次為脂肪、氨基己糖、核酸。傳統(tǒng)％1^1^法提取約氏乳桿菌肽聚糖，其主要成分為蛋白質(zhì)和中性糖，含量分別為58%和42%，其次為脂肪、氨基己糖、核酸。所測(cè)改良法提取約氏乳桿菌肽聚糖各項(xiàng)成分與傳統(tǒng)kkine法提取相比較，其品質(zhì)沒(méi)有降低。1. 3. 3約氏乳桿菌肽聚糖的提取得率通過(guò)溶菌酶溶解試驗(yàn)證實(shí)分離純化步驟所得的提取物的主要成分確系肽聚糖。通過(guò)用三批不同批次工業(yè)化生產(chǎn)的約氏乳桿菌菌粉提取肽聚糖，采用質(zhì)量比(終WPG質(zhì)量/ 起始菌粉質(zhì)量)比較改良法法提取完整肽聚糖得率。結(jié)果表明改良法的得率為 18%，而傳統(tǒng)kkine法僅能獲得3%的提取率。1. 3. 4肽聚糖微乳制備及其類(lèi)型的鑒別選擇食品級(jí)吐溫-80為表面活性劑，選擇正丁酸乙酯和維生素E的混合物為油相。 采用乙醇為助表面活性劑。由相圖考察所得結(jié)果，按比例秤取一定量的肽聚糖、表面活性劑、助表面活性劑和油相混合均勻，滴加蒸餾水，攪拌混勻即得液滴直徑在30 45nm的半透明狀乳液產(chǎn)品。獲得肽聚糖微乳經(jīng)離心后，溶液均無(wú)分層。外觀澄黃、透明、可見(jiàn)乳光、具有一定流動(dòng)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示亞甲基蘭在微乳中的擴(kuò)散速度明顯快于蘇丹IV，可以判定肽聚糖微乳為Ο/w型微乳。將3批配制的肽聚糖微乳于37°C烘箱中放置3個(gè)月，觀察性狀、分層、含量測(cè)定等指標(biāo)表明各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化，該制劑的穩(wěn)定性良好。透射電鏡下呈圓球形，分布均勻，平均粒徑為(39. 6 士 3. 3) nm。實(shí)施例2 口服完整肽聚糖微乳對(duì)致敏模型動(dòng)物過(guò)敏反應(yīng)的干預(yù)作用將實(shí)施例1制備得到的完整肽聚糖微乳及肽聚糖用于以下實(shí)驗(yàn)研究2. 1實(shí)驗(yàn)材料2. 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性清潔級(jí)BALB/c小鼠，6 8周齡，購(gòu)自哈爾濱腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23 士 2) °C，濕度50 % 75 %，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)。2. 1.2主要試劑實(shí)施例1制備得到的肽聚糖提取物、實(shí)施例1制備得到的肽聚糖微乳、IL-12、 IFN- y、IL-4ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)、總IgE試劑盒(美國(guó)bethyl公司)、羊抗鼠IgE酶標(biāo)二抗(英國(guó)AbD Serotec公司)、羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗(中國(guó)中杉金橋公司)、 RPMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)、淋巴細(xì)胞分離液(Salarbio公司)、牛乳β -乳球蛋白標(biāo)品和弗氏完全佐劑(Sigma公司)等。2. 1.3儀器設(shè)備
HF90型CO2培養(yǎng)箱 Model 680型酶標(biāo)儀 EL104/00型電子天平 2~1 OOOpL可調(diào)定量移液器 96孔培養(yǎng)板 AE-30倒置生物顯微鏡 VD-1320型潔凈工作臺(tái)
LD4-2型低速離心機(jī)2. 2實(shí)驗(yàn)方法2. 2. 1灌服用的完整肽聚糖及其微乳的制備灌服用的完整肽聚糖的制備稱(chēng)取實(shí)施例1中1. 2. 1制備得到的完整肽聚糖4g， 加入20g無(wú)菌生理鹽水(含0.9% (W/V)的氯化鈉水溶液)溶解，即稀釋6倍使用，制得混懸液。灌服用的完整肽聚糖微乳的制備取實(shí)施例1中1. 2. 3的制備得到的完整肽聚糖微乳灌服使用。灌服用空白微乳的制備稱(chēng)取吐溫-802. 348g，無(wú)水乙醇9. 392g，分散于82g水中成水相，稱(chēng)取4. 382g正丁酸乙酯，維生素E 1. 878g混合成溶液做為油相，兩相分別預(yù)熱至 70°C，將油相和水相混合后經(jīng)高速剪切乳化機(jī)在6000rpm下剪切5min制得粗乳100g，加入 5倍體積的生理鹽水稀釋6倍，再采用高壓均質(zhì)機(jī)在70MPa的壓力下均質(zhì)6次，調(diào)節(jié)pH至
香港力康公司美國(guó) Beckman 梅特勒公司德國(guó)Eppendorf公司美國(guó) Corning Incorporated costar 公司麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min,即得空白微乳制劑。2. 2. 2動(dòng)物模型建立小鼠購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)4天，隨機(jī)分組(每組8只)，即空白組、致敏組、肽聚糖組以及肽聚糖微乳組。自第1天起，肽聚糖組以及肽聚糖微乳組小鼠分別灌服完整肽聚糖及其微乳0. ImL/只，每周3次，共4周，空白組同時(shí)以等量空白微乳灌服。致敏組、肽聚糖組以及肽聚糖微乳組小鼠在第7、21、觀天給予腹腔注射0. ImL 0. 5mg/mL的過(guò)敏原(ImL弗氏佐劑+ImL lmg/mL BLG)，空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)的第30天，即末次腹腔注射4 后檢測(cè)指標(biāo)。2. 2. 3ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子無(wú)菌取各組小鼠脾臟，用玻璃針芯在200目篩網(wǎng)上研磨后，加入到RPMI1640培養(yǎng)液中制成單細(xì)胞懸液。加入淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行離心，分離出淋巴細(xì)胞，再用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌GOOOr/min) 2次。調(diào)細(xì)胞密度為2 X 106個(gè)/mL。將細(xì)胞與含有100mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基及BLG (終濃度lg/L)加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積200 μ L，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)(n =幻。在37°C，50mL/LC02培養(yǎng)箱飽和濕度條件下培養(yǎng)4 后，離心收集上清。嚴(yán)格按照各ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在波長(zhǎng)450nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(A)值，從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得各樣品的IL-12、IFN-y、IL-4濃度。2. 2. 4ELISA法檢測(cè)抗體水平各組小鼠摘除眼球放血，離心后吸取血清，嚴(yán)格按照各抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清中總IgE, BLG特異性IgE和總IgG濃度。2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 3. 1完整肽聚糖微乳對(duì)致敏小鼠Thl/Th2細(xì)胞平衡的影響由于Thl、Th2細(xì)胞的比例同IFN- γ和IL_4的分泌水平密切相關(guān)，益生菌肽聚糖通過(guò)糾正Thl/Th2細(xì)胞失衡來(lái)緩解過(guò)敏所致的炎癥反應(yīng)，故本實(shí)驗(yàn)以IFN- y /IL-4比值為代表研究乳酸菌肽聚糖微乳對(duì)淋巴細(xì)胞Thl/Th2平衡的影響。如表1所示，與致敏組相比， 肽聚糖微乳組小鼠的IL-4質(zhì)量濃度顯著下降(P < 0.05)，而IFN-Y分泌值明顯增高(P < 0. 05)，其IFN- y /IL-4比值顯著高于空白微乳組和致敏組(P < 0. 05)。表1肽聚糖微乳對(duì)BLG致敏小鼠Thl/Th2細(xì)胞分泌的影響pg/mL，n = 3)
權(quán)利要求
1.乳桿菌完整肽聚糖在制備抗乳球蛋白過(guò)敏免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于是將所述的乳桿菌完整肽聚糖應(yīng)用于制備抗 IgE介導(dǎo)的乳球蛋白過(guò)敏的免疫增強(qiáng)劑中。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的完整肽聚糖是從約氏乳桿菌 KLDS1. 7032中提取的，所述的約氏乳桿菌KLDS1. 7032，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5050。
4.一種制備權(quán)利要求3所述的完整肽聚糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)菌體的清洗與收集將約氏乳桿菌KLDS1.7032菌種活化傳代后，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)18h，培養(yǎng)完畢后迅速降溫至4°C ；在5000g、4°C離心20min，收集菌體沉淀；4°C蒸餾水反復(fù)洗滌至菌體白色，收集菌體，置于100°C沸水水浴箱中滅活30min， 得到熱致死菌泥；所述的約氏乳桿菌KLDS1. 7032，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5050 ；(2)去磷壁酸將步驟(1)所述的熱致死菌泥懸浮于預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，5000g、4°C離心15min，收集沉淀；(3)脫脂濃度為0.02mol/L, pH值為4. 6的乙酸鈉溶液，與氯仿、甲醇，三者按體積比 4:5: 10混合；用混合液溶解步驟( 得到的沉淀，所述混合液的體積與沉淀體積比為 15 1 ；室溫?cái)嚢?8h，8000g、4°C離心20min，收集沉淀；(4)去蛋白上述步驟(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀體積的含有:3mg/mL胰蛋白酶和:3mg/mL堿性蛋白酶的pH 8. 0的0. lmol/L磷酸緩沖液，37°C水浴振蕩12h，以5000g、4°C 離心5min，沉淀用去離子水洗2次；(5)提純步驟(4)得到的沉淀經(jīng)0.Olmol -L"1硫酸溶液85 95°C處理5min，冰水浴中立即冷卻，12000g、4°C離心30min后棄上清，沉淀用去離子水在4°C條件下連續(xù)透析7天， 冷凍干燥后置4°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.按照權(quán)利要求4所述的制備方法制備得到的乳桿菌完整肽聚糖。
6.一種抗乳球蛋白過(guò)敏的微乳制劑，其特征在于包括有效劑量的權(quán)利要求3或5 所述的完整肽聚糖作為活性成分、還包括油相、表面活性劑、助表面活性劑和水。
7.如權(quán)利要求6所述的微乳制劑，其特征在于所述的表面活性劑為吐溫-80，所述的助表面活性劑為無(wú)水乙醇，所述的油相為正丁酸乙酯和維生素E的混合物。
8.如權(quán)利要求7所述的微乳制劑，其特征在于微乳制劑包括以下重量分?jǐn)?shù)的各物質(zhì) 權(quán)利要求3或5所述的完整肽聚糖3. 00%，質(zhì)量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E組成的混合物1. 07% 13. 59%，質(zhì)量比為2 8的吐溫-80和無(wú)水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%及水 58. 00% 89. OOV0o
9.如權(quán)利要求8所述的微乳制劑，其特征在于是由以下方法制備得到的將質(zhì)量比為 2 8的吐溫-80和無(wú)水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%分散于58. 00% 89. 00%水中成水相，質(zhì)量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E的混合物1.07% 13. 59%為油相，權(quán)利要求3或5所述的完整肽聚糖3. 00%加入油相中，兩相分別預(yù)熱至70°C，將油相和水相混合后經(jīng)高速剪切乳化機(jī)在6000rpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍體積的生理鹽水稀釋 6倍，再采用高壓均質(zhì)機(jī)在70MPa的壓力下均質(zhì)6次，調(diào)節(jié)pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min，即得微乳制劑。
10.權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的微乳制劑在制備抗乳球蛋白過(guò)敏免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具抗β-乳球蛋白過(guò)敏效果的乳桿菌完整肽聚糖的制備方法、產(chǎn)品及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明所得到的乳桿菌完整肽聚糖制備成的微乳制劑，其中乳桿菌完整肽聚糖作為主要功效成分，將完整肽聚糖、油相、表面活性劑、助表面活性劑、水在70℃邊加熱邊攪拌使完整肽聚糖完全溶解，混勻即得液滴直徑在30～45nm的半透明狀乳液產(chǎn)品。本發(fā)明的乳桿菌完整肽聚糖微乳制劑經(jīng)口服到達(dá)體內(nèi)后，能有效刺激淋巴細(xì)胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，逆轉(zhuǎn)Th2細(xì)胞過(guò)度亢進(jìn)，在抑制IgE介導(dǎo)的β-乳球蛋白過(guò)敏炎癥中發(fā)揮了重要作用。在開(kāi)發(fā)具有抗過(guò)敏性能的免疫增強(qiáng)劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102335413SQ201110236429
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者孟祥晨, 李艾黎, 杜鵬, 馬冬雪 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)