專利名稱：一種治療自體自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)t細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞治療領(lǐng)域，特別涉及一種治療自身免疫性疾病或預(yù)防器官移植排斥的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞及其制備方法。
背景技術(shù)：
調(diào)節(jié)T 細(xì)胞(regulatory T cells)或者抑制性 T 細(xì)胞(suppressor T cells)是體內(nèi)重要的一群細(xì)胞，在調(diào)節(jié)正常人免疫性自我穩(wěn)定性方面起了重要的作用。主要抑制針對自身組織的抗原產(chǎn)生的自身免疫反應(yīng)。這群細(xì)胞的缺乏，減少和功能下降均與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。這群細(xì)胞表達(dá)一個(gè)調(diào)節(jié)T細(xì)胞特征性的蛋白質(zhì)FoXp3。 這群細(xì)胞目前至少有二群，一群產(chǎn)生于胸腺中，為自然發(fā)生的，稱為自然的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，或稱“nTregs”。另外一群是從胸腺外通過轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，稱誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞， 或稱 “iTregs，，。雖然nTregs在免疫穩(wěn)定性中起了重要的作用，并且，注射這些細(xì)胞到多種自身免疫性疾病中能夠很好的預(yù)防疾病的發(fā)生和發(fā)展，但是，使用這群細(xì)胞到已經(jīng)發(fā)病的系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠中，它們的治療效果不甚理想甚至缺乏。幾個(gè)因素限制了自然調(diào)節(jié)T細(xì)胞的對自身免疫性疾病的治療效果。一是缺乏充分的數(shù)量，二是它們在炎癥狀態(tài)下缺乏免疫抑制能力，三是它們在炎癥狀態(tài)下的不穩(wěn)定性，它們可以轉(zhuǎn)化成為T 輔助細(xì)胞或者效應(yīng)細(xì)胞，這個(gè)時(shí)候它們不僅不能夠抑制異常的免疫反應(yīng)，反而加重異常的免疫反應(yīng)并且可能惡化疾病。體外誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞是指通過某種/某些細(xì)胞因子，使常規(guī)的非調(diào)節(jié)T細(xì)胞變化稱為調(diào)節(jié)τ細(xì)胞。使用IL-10能夠誘導(dǎo)Trl調(diào)節(jié)T細(xì)胞，這群細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-10， 但是不表達(dá)Foxp3，通過IL-10來抑制免疫反應(yīng)。Trl因?yàn)楫a(chǎn)生高水平的IL-10，明顯不適合于某些自身免疫性疾病的治療。比如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病人，其血清中含有高水平的 IL-IO0 IL-10可能刺激B細(xì)胞，產(chǎn)生大量的自身免疫性反應(yīng)的自身抗體。因此，產(chǎn)生高水平的IL-10對這些疾病的治療不合適。另外一群是TGF-β轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，這群細(xì)胞可能通過釋放活性TGF-β來抑制免疫反應(yīng)，它們表達(dá)Foxp3。TGF-β轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞是另外的治療自身免疫性疾病的選擇，但是，TGF-β卻不能夠誘導(dǎo)人的CD4+細(xì)胞變化成為調(diào)節(jié) T 細(xì)胞(Tran DQ et al. Blood. 2007 ;110 :2983_90)。另外，TGF-β 更不能夠誘導(dǎo)自身免疫性疾病狀態(tài)下的細(xì)胞變化成為調(diào)節(jié)T細(xì)胞(見本發(fā)明的結(jié)果，下文)。因此，為治療自身免疫性疾病和另外的炎癥性疾病考慮，提供一個(gè)新的能夠誘導(dǎo)自身免疫性疾病患者的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法，會(huì)為治療這些疾病提供新的治療手段。6%的人群患有自身免疫性疾病。目前這類疾病缺乏治愈手段。目前的藥物治療均是對癥治療，長期使用，有嚴(yán)重的毒副作用。50%的病人在首次診斷后的二十二年內(nèi)死亡。 如果病人產(chǎn)生了腎臟的并發(fā)癥，必須使用免疫抑制劑。但是，使用免疫抑制劑之后，10%的病人會(huì)在二年內(nèi)死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對目前缺乏治療自身免疫性疾病的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的缺陷，提供一種誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療自身免疫性疾病細(xì)胞的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法及所得到的調(diào)節(jié)T細(xì)胞。該方法能夠誘導(dǎo)自身免疫性疾病的動(dòng)物或人的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為調(diào)節(jié)T細(xì)胞，該調(diào)節(jié)T細(xì)胞能夠治療自身免疫性疾病并且保護(hù)器官移植的免疫排斥。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種體外誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)τ細(xì)胞的方法，包括如下步驟將分離的原始T細(xì)胞給予抗CD3/CD28 抗體刺激，同時(shí)給予由以下(1) (4)成分組成的復(fù)合配方進(jìn)行刺激(1) IL-2，IL-1，IL-7，TNF-α 和 IL-15 中的任何一種或多種，優(yōu)選 IL-2 ；(2) TGF- β，優(yōu)選 TGF- β 1，TGF- β 2 和 TGF- β 3 中的任何一種或多種；(3)維甲酸，棕櫚酸鹽，視黃醛，合成的類視黃醇，異維A酸，依曲替酯和曲古菌素A 中的任何一種或多種，優(yōu)選維甲酸；和(4)氮胞啶和/或Ι-b-d-呋喃核糖-2 (Ih)-嘧啶，優(yōu)選氮胞啶。本發(fā)明中，“原始T細(xì)胞”是指未曾暴露于特異抗原的T細(xì)胞，也稱NaiVe T細(xì)胞。 本發(fā)明可以以NaiVe T細(xì)胞為開始細(xì)胞群，也可以以NaiVe⑶8+細(xì)胞和/或Na'ive⑶4+ 細(xì)胞為開始細(xì)胞群，優(yōu)選狼瘡病小鼠的NaiVe CD4+細(xì)胞，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(ClA)小鼠的 NaiVe⑶4+細(xì)胞，或活動(dòng)期系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人(SLE)靜脈血中的分離的na’ive⑶4+細(xì)胞。調(diào)節(jié)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)需要使T細(xì)胞得以激活。本發(fā)明使用抗CD3/CD28抗體進(jìn)行刺激激活，所述的“抗CD3/CD28抗體”是指抗CD3抗體和抗CD28抗體兩種抗體同時(shí)進(jìn)行刺激。本發(fā)明可以使用抗⑶3/⑶28抗體包埋的磁珠，通常可選用現(xiàn)有用于T細(xì)胞激活、 擴(kuò)增的商業(yè)化磁珠產(chǎn)品；也可以采用可溶性抗CD3/CD28抗體，或者培養(yǎng)皿內(nèi)壁包被的抗 ⑶3/⑶28抗體進(jìn)行刺激激活。除此之外，本發(fā)明也包括采取抗⑶2抗體，⑶2配體，LFA-3，刀豆素 A (Concanavalin A, Con A)禾口金黃葡萄球菌內(nèi)毒素 B (staphylococcus enterotoxin, BSEB)中的任何一種或者多種進(jìn)行刺激，該方法同樣能夠激活T細(xì)胞。這些激活T細(xì)胞的刺激因子的的總濃度在0. 1到5.0 μ g/ml的范圍內(nèi)效果較佳。磁珠的濃度是1 1到1 20(1 個(gè)磁珠對20個(gè)細(xì)胞)，優(yōu)選1 5 (—個(gè)磁珠對5個(gè)細(xì)胞)。本發(fā)明中，同時(shí)還給予所述的四種成分組成的復(fù)合配方進(jìn)行刺激。該復(fù)合配方比任何單獨(dú)成分使⑶4+細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著增高的Foxp3的表達(dá)水平。Foxp3是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表型標(biāo)志。標(biāo)志著它們能夠抑制體外T細(xì)胞的增生和細(xì)胞因子的分泌。另外，注射這些細(xì)胞到體內(nèi)，它們能夠抑制免疫反應(yīng)引起的疾病，是確定調(diào)節(jié)T細(xì)胞的最好功能標(biāo)志。該復(fù)合配方的使用而不是任何單獨(dú)成分的使用能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細(xì)胞，這些誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)T 細(xì)胞能夠顯著的抑制體外T細(xì)胞的反應(yīng)能力。這些誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)T細(xì)胞在注射之后能夠顯著的 減輕自身免疫性疾病的癥狀。該復(fù)合配方比任何單獨(dú)成分誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)T細(xì)胞， 產(chǎn)生顯著延長疾病動(dòng)物的存活。本發(fā)明所述的該復(fù)合配方中包括但不限制細(xì)胞因子IL-2。包括另外一些細(xì)胞因子IL-I，IL-7，TNF-α和IL-15也可以單獨(dú)或者結(jié)合使用，因?yàn)檫@些細(xì)胞因子與IL-2有相同的作用原理。IL-2可以是任何形式的活性的IL-2。在人的細(xì)胞，重組的人的IL-2是優(yōu)先建議使用的。重組的人的IL_2(符合GMP標(biāo)準(zhǔn))可以從R&D Systems (Minneapolis,MN) 購買。總的說來，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞時(shí)，IL-2的濃度范圍是lUnit/ml到300Units 以上/ml。本發(fā)明中所述的 “ Transforming growth factor- β ” or “ TGF- β ” 是指任何 TGF- β s家族的活性成員，包括3個(gè)同分異構(gòu)體的TGF- β 1，TGF- β 2和TGF- β 3 ；參見 Massague,J. (1980),J. Ann. Rev. Cell Biol 6 597. Lymphocytes and monocytes produce the β 1 isoform of this cytokine (Kehrl, J. H. et al. (1991), Int J Cell Cloning 9: 438-450)。在人的細(xì)胞，重組的IFG-β被優(yōu)先考慮使用?？偟恼f來，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)調(diào)節(jié) T細(xì)胞時(shí)，TGF-β的濃度范圍從大約2pg/ml到大約50ng/ml。本發(fā)明中所述的維甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)是維生素A的代謝衍生物。相似的，另外一些維生素A的衍生物，比如棕櫚酸鹽(palmitate)，視黃醛 (retinal)，合成的類視黃醇(synthetic retinoids)如 AM80 (Tamibarotine)，異維 A 酸 (isotretinoin)和依曲替酯(etretinate)也被建議使用和保護(hù)。通常，atRA的濃度范圍是大約0. 1到大約2. 0 μ M。因?yàn)閍tRA主要通過促進(jìn)Foxp3基因的組蛋白的乙?；瘉泶龠M(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表型和功能的，因此，另外一些成分，比如曲古菌素AUrichostatin A)等有抑制Foxp3去乙?；缸饔玫某煞忠脖话ㄔ诒景l(fā)明中。本發(fā)明的復(fù)合配方中所用的氮胞啶(azacytidine，azaC)是甲基化轉(zhuǎn)移酶的抑制齊U，抑制Foxp3基因位點(diǎn)的甲基化，促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的穩(wěn)定性和功能性。除azaC之外，另外甲基化轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，比如Ι-b-d-呋喃核糖-2 (Ih)-嘧啶(l-b-D-ribofuranosyl-2 (IH) -py rimidinone)也同時(shí)包含在本發(fā)明中。azaC的濃度范圍是大約0. 1到大約2. OMm。本發(fā)明將分離的原始T細(xì)胞，置于含有所述的抗⑶3/⑶28抗體和(1) (4)四種成分的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中，培養(yǎng)3 7天，即得到調(diào)節(jié)T細(xì)胞。所用的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)是常規(guī)的 T細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選AIM-V或者EX-VIVO 15培養(yǎng)液。培養(yǎng)的條件也是常規(guī)的T細(xì)胞培養(yǎng)條件，本發(fā)明優(yōu)選37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)密度優(yōu)選3xl06個(gè)細(xì)胞/cm2。培養(yǎng)介質(zhì)優(yōu)選每48 小時(shí)換液一次，每三天或者根據(jù)細(xì)胞密度(超過1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/cm2)進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，每隔 2 3天分瓶培養(yǎng)一次。因此，本發(fā)明的誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法的一較佳實(shí)施例包括如下步驟，將分離的原始τ細(xì)胞給予抗CD3/CD28抗體刺激，抗CD3/CD28 抗體的濃度范圍是0. 1到5.0yg/ml，同時(shí)給予由以下(1) (4)成分組成的復(fù)合配方進(jìn)行刺激(l)IL-2, IL-1，L_7，TNF-α和IL-15中的任何一種或多種，它們的濃度范圍是 lUnit/ml 到 300Units/ml ；(2) TGF- β，其濃度范圍是 2pg/ml 到 50ng/ml ；(3)維甲酸，棕櫚酸鹽，視黃醛，合成的類視黃醇，異維A酸，依曲替酯和曲古菌素A 中的任何一種或多種，它們的濃度范圍是0. 1到2. 0 μ M ；和(4)氮胞啶和/或Ι-b-d-呋喃核糖-2(lh)_嘧啶，它們的濃度范圍是0.1到 2· ΟμΜ。本發(fā)明的誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法的另一較佳實(shí)施例包括如下步驟，將分離的原始CD4+細(xì)胞給予抗CD3/CD28抗體包裹的微小磁珠進(jìn)行刺激，同時(shí)給予IL-2，TGF-β，atRA和azaC刺激，刺激濃度是抗CD3/CD28抗體0. 1 到S.Oyg/ml，磁珠濃度1 1到1 20 (1個(gè)磁珠對20個(gè)細(xì)胞)，IL-2是lUnit/ml至Ij 300Units/ml，TGF- β 是 2pg/ml 到 50ng/ml ；atRA 是 0. 1 到 2. 0 μ M, azaC 是 0. 1 到 2· 0 μ M ； 刺激時(shí)間為3-7天。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用全新的技術(shù)方法，結(jié)合使用細(xì)胞因子IL-2，TGF-β，atRA and AzaC能夠誘導(dǎo)各種自身免疫性疾病患者的原始CD4+和 CD8+細(xì)胞或者整個(gè)T細(xì)胞，在抗CD3/CD28刺激下，分化成為具有免疫抑制活性的“調(diào)節(jié)T 細(xì)胞”。注射這些細(xì)胞(從動(dòng)物疾病中誘導(dǎo))到自身免疫性疾病動(dòng)物模型和這些細(xì)胞(從人的SLE患者誘導(dǎo))到動(dòng)物人性化的模型均顯著抑制疾病的進(jìn)展。使用這些細(xì)胞可能為未來治療免疫性疾病的治療提供一個(gè)新的技術(shù)方法和手段。使用病人自己的細(xì)胞可能為個(gè)體化治療自身免疫性疾病奠定重要的基礎(chǔ)。另外，這些細(xì)胞也對器官移植的免疫排斥有重要的保護(hù)價(jià)值。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1顯示復(fù)合配方誘導(dǎo)狼瘡小鼠⑶4+細(xì)胞表達(dá)高水平的Foxp3。圖1A.狼瘡小鼠的Na'ive⑶4+細(xì)胞被抗⑶3/⑶28抗體包埋的磁珠(1 5，即一個(gè)磁珠對5個(gè)細(xì)胞)刺激 4天之后，F(xiàn)oxp3在⑶4+⑶25+細(xì)胞群中的表達(dá)情況。對照細(xì)胞1 這些細(xì)胞加了 IL-2，對照細(xì)胞 2 加 IL-2 和 TGF-β ；對照細(xì)胞 3 加 IL_2，TGF_3 和 atRA。CD4+iTregs 加 IL-2, TGF-β，atRA和AzaC。注iTreg細(xì)胞而不是對照細(xì)胞表達(dá)高水平的Foxp3。圖IB.數(shù)據(jù)是4個(gè)分開試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)合，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較了⑶4+iTregs和對照細(xì)胞。圖1C. Foxp3在這些細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)(第二天，第四天和第七天)。提示復(fù)合配方不僅增加，而且也維持高水平的Foxp3表達(dá)水平。圖2顯示復(fù)合配方誘導(dǎo)的狼瘡小鼠⑶4+細(xì)胞顯著地抑制體外T細(xì)胞的增生。圖 2A.狼瘡小鼠的T細(xì)胞被綠色熒光素(CFSE)標(biāo)記。這些細(xì)胞被抗⑶3抗體進(jìn)行刺激，20% 的對照細(xì)胞或⑶4+iTregs細(xì)胞被加到另外一些培養(yǎng)孔中。三天之后，檢測CFSE的稀釋情況(即T細(xì)胞增生情況)(以百分比顯示)。圖2A中的細(xì)胞為⑶8+細(xì)胞門，排除了 CFSE稀釋的細(xì)胞中混有對照⑶4+細(xì)胞或⑶4+iTregs細(xì)胞的可能性。圖2A為4個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)的代表數(shù)據(jù)。2B.各種細(xì)胞對狼瘡小鼠的T細(xì)胞增生的抑制情況轉(zhuǎn)化成為抑制百分比。圖2B 是4個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合數(shù)據(jù)。注對照細(xì)胞1沒有任何免疫抑制活性，對照細(xì)胞2和3有一點(diǎn)免疫抑制活性。由復(fù)合配方誘導(dǎo)的CD4+細(xì)胞變成了最理想的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，因?yàn)樗麄冇袕?qiáng)的抑制T細(xì)胞的增生能力。圖3顯示復(fù)合配方誘導(dǎo)的狼瘡小鼠CD4+細(xì)胞顯著地抑制狼瘡小鼠的蛋白尿水平和腎小球的抗原抗體復(fù)合物的沉淀。圖3A.對照細(xì)胞和CD4+iTregS用圖1相似的方法誘導(dǎo)。5xl06細(xì)胞個(gè)對照細(xì)胞1，2，3或⑶4+iTreg細(xì)胞被靜脈注射到24周齡的BWFl小鼠中。 這些小鼠在24周時(shí)已經(jīng)有了顯著的蛋白尿。32周時(shí)，我們進(jìn)一步檢測各個(gè)組別的小鼠的蛋白尿水平。圖是每組5個(gè)小鼠的綜合數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)被重復(fù)一次并且有相似的結(jié)果。圖3B.3A實(shí)驗(yàn)的小鼠在32周時(shí)候被處死，腎臟組織制成冰凍切片，免疫熒光染色，確定IgGl的表達(dá)情況。顯示在接受CD4+iTreg細(xì)胞的小鼠，腎臟腎小球的抗原抗體復(fù)合物的沉淀水平最小。 圖4顯示復(fù)合配方誘導(dǎo)的狼瘡小鼠的CD4+細(xì)胞治療狼瘡小鼠之后，能夠顯著延長疾病小鼠的存活。實(shí)驗(yàn)如圖3所示。動(dòng)物的存活被統(tǒng)計(jì)了。注僅僅注射CD4+iTreg細(xì)胞能夠顯著延長狼瘡小鼠的存活。圖5顯示復(fù)合配方誘導(dǎo)的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠的CD4+細(xì)胞能夠控制關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展。對照細(xì)胞和⑶4+iTreg細(xì)胞按照圖3的方法相似地從已經(jīng)患病的CIA小鼠中進(jìn)行誘導(dǎo)。5xl06細(xì)胞個(gè)對照細(xì)胞1，2，3或⑶4+iTreg細(xì)胞被靜脈注射到14天前已經(jīng)被II型膠原和佐劑免疫的DBA/1小鼠中，小鼠的關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性被標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)分方法所記錄。結(jié)果顯著，僅僅CD4+iTreg細(xì)胞顯著地抑制了關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。圖6顯示復(fù)合配方也能夠誘導(dǎo)活動(dòng)期的SLE病人的⑶4+細(xì)胞成為⑶4+iTreg細(xì)胞。首先從活動(dòng)期SLE病人身上獲得靜脈血并且制備成為na'ive⑶4+細(xì)胞。這些細(xì)胞用抗⑶3/⑶28包埋的磁珠進(jìn)行刺激，結(jié)合IL-2 (對照細(xì)胞1)，IL-2+TGF- β (對照細(xì)胞2)， IL-2+TGF- β +atRA (對照細(xì)胞 3)和 IL-2+TGF- β +atRA+Azac (CD4+iTreg 細(xì)胞)進(jìn)行誘導(dǎo)。 從該SLE病人中制備20xl06PBMC并且注射到SCID common gamma chain KO小鼠中，這些小鼠會(huì)發(fā)展成為xeno-GVHD，這些小鼠在接受細(xì)胞注射之后的22天全部死亡。同時(shí)注射對照細(xì)胞1幾乎沒有保護(hù)效果。同時(shí)注射對照細(xì)胞2和3，適當(dāng)?shù)难娱L了小鼠的存活。但是， 同時(shí)注射⑶4+iTreg細(xì)胞顯著地延長了小鼠的存活。各個(gè)試驗(yàn)組至少包括6個(gè)小鼠，試驗(yàn)被重復(fù)了一次并且有相似的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以原始T細(xì)胞為開始細(xì)胞群，給予抗⑶3/⑶28抗體刺激，同時(shí)給予IL-2， TGF- β，atRA和azaC刺激，從而使之轉(zhuǎn)化成為調(diào)節(jié)T細(xì)胞，這些調(diào)節(jié)T細(xì)胞對自身免疫性疾病的治療有療效。下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1首先制備狼瘡小鼠的Naiive⑶4+細(xì)胞。取24周齡以上的自發(fā)性狼瘡小鼠 BWFl (美國Jackson Laboraotry公司)數(shù)只。用蛋白尿試紙檢測小鼠的蛋白尿水平。待水平達(dá)到或者超過500mg/dL，表示小鼠已經(jīng)患有典型的狼瘡疾病。將小鼠常規(guī)處死之后，無菌狀態(tài)下分離脾臟。研碎脾臟，獲得脾臟單細(xì)胞懸液。通過一個(gè)尼龍毛的柱子，把脾臟單細(xì)胞分成尼龍膜粘附的細(xì)胞和尼龍膜非粘附細(xì)胞。這些尼龍膜非粘附細(xì)胞懸液被加抗PE熒光染料標(biāo)記的CDllb,⑶220，CD44抗體(每IxlO6個(gè)細(xì)胞，加1 μ g抗體)。如果制備CD4+ 細(xì)胞，則另外加抗PE熒光染料標(biāo)記的CD8+抗體，如果制備CD8+細(xì)胞，則另外加抗PE熒光染料標(biāo)記的CD4+抗體。4°C冰箱中孵育20分鐘。然后加抗PE抗體結(jié)合的磁珠孵育20分鐘(4°C)，之后把細(xì)胞轉(zhuǎn)到MACS(德國公司)的分離柱子中。與柱子分離的細(xì)胞部分就是 Na'lve⑶4+或者⑶8+細(xì)胞。這些細(xì)胞制成之后，用抗體標(biāo)記(⑶62L和⑶4+)，這些細(xì)胞通常表達(dá)99%的⑶4和⑶62L(L-選擇素)，表示為純化的未接觸抗原的原始T細(xì)胞。這些細(xì)胞用AIM-V和EX-VIVO 15培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)之后，在12孔培養(yǎng)皿中，每孔加入3xl06細(xì)胞，然后加入下面列出的多種成分。保證總體積在2ML。在 37°C培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，優(yōu)選4天。在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入6xl05個(gè)抗⑶3/⑶28抗體包被的磁珠(美國Invitrogen 公司)。加 IL-2(終濃度為 40Units/ml)，TGF-β (終濃度為 2ng/ml)，atRA(0. 5μΜ)和 AzaC (0. 5 μ Μ)進(jìn)行培養(yǎng)。 本發(fā)明(⑶4+iTregs)抗⑶3/⑶28抗體包埋的磁珠(1 5，一個(gè)磁珠對5個(gè)細(xì)胞)，加了 IL-2, TGF-β，atRA 和 AzaC，濃度見上。對照細(xì)胞1 抗⑶3/⑶28抗體包埋的磁珠(1 5，一個(gè)磁珠對5個(gè)細(xì)胞)，加了 IL-2(40units/ml).對照細(xì)胞2 抗⑶3/⑶28抗體包埋的磁珠(1 5，一個(gè)磁珠對5個(gè)細(xì)胞)，加 IL-2(40units/ml)禾口 TGF-β (2ng/ml)；對照細(xì)胞3 抗⑶3/⑶28抗體包埋的磁珠(1 5，一個(gè)磁珠對5個(gè)細(xì)胞)，加 IL-2(40units/ml)，TGF- β (2ng/ml)和 atRA(0. 5 μ Μ)。這些細(xì)胞37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)介質(zhì)每48小時(shí)換液一次，細(xì)胞密度超過3xl06個(gè)細(xì)胞/ cm2分瓶培養(yǎng)一次。培養(yǎng)4天后，收獲細(xì)胞，離心，去除上清液。然后在2xl05個(gè)細(xì)胞中加 20 μ 1 PBS，2y 1抗⑶25和2μ 1抗⑶4抗體。表面染色之后，才對細(xì)胞進(jìn)行固定和穿透。 之后，加抗Foxp3抗體，2 μ 1，在冰上20分鐘之后，用PBS洗滌去掉多余的未結(jié)合的抗體，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。結(jié)果見圖1。從圖IA可見，本發(fā)明細(xì)胞而不是對照細(xì)胞1 3表達(dá)高水平的Foxp3。從圖IC可見，本發(fā)明復(fù)合配方不僅增加，而且也維持高水平的Foxp3表達(dá)水平。實(shí)施例2對照細(xì)胞和本發(fā)明的調(diào)節(jié)T細(xì)胞按照實(shí)施例1的方法制備。然后從狼瘡小鼠中制備T細(xì)胞。具體方法是小鼠常規(guī)處死之后，無菌狀態(tài)下分離脾臟。研碎脾臟，獲得脾臟單細(xì)胞懸液。通過一個(gè)尼龍毛的柱子，把脾臟單細(xì)胞分成尼龍膜粘附的細(xì)胞和尼龍膜非粘附細(xì)胞。這些尼龍膜非粘附細(xì)胞懸液被加抗PE熒光染料標(biāo)記的 CDllb，CD220，CD44抗體(每IxlO6個(gè)細(xì)胞，加Iyg抗體)。4°C冰箱中孵育20分鐘。然后加抗PE抗體結(jié)合的磁珠孵育20分鐘(4°C )，之后把細(xì)胞轉(zhuǎn)到MACS (德國公司)的分離柱子中。與柱子分離的細(xì)胞部分就是Na_ive T細(xì)胞。這些細(xì)胞制成之后，用抗體標(biāo)記(⑶62L 和⑶3+)，這些細(xì)胞通常表達(dá)99 %的⑶3和⑶62L (L-選擇素)，表示為純化的未接觸抗原的原始T細(xì)胞。這些細(xì)胞然后與一種綠色熒光 Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 羧基熒光素琥珀酰亞胺酯進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記。標(biāo)記的時(shí)候使用CFSE終濃度為1 μ M。37°C，10 分鐘，避光。之后，用PBS洗滌細(xì)胞3次。這些細(xì)胞用抗⑶3抗體(0. 25 μ g/ml)進(jìn)行刺激， 20%的對照細(xì)胞或⑶4+iTregs細(xì)胞被加到另外一些培養(yǎng)孔中。三天之后，檢測CFSE的稀釋情況(即T細(xì)胞增生情況)(以百分比顯示)。圖2A中的細(xì)胞為CD8+細(xì)胞門(可以在流式細(xì)胞儀上設(shè)定)，排除了 CFSE稀釋的細(xì)胞中混有對照⑶4+細(xì)胞或⑶4+iTregs細(xì)胞的可能性。圖2A為4個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)的代表數(shù)據(jù)。在圖2B中，各種細(xì)胞對狼瘡小鼠的T細(xì)胞增生的抑制情況轉(zhuǎn)化成為抑制百分比。圖2B是4個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合數(shù)據(jù)。實(shí)施例3
用實(shí)施例1的方法獲得調(diào)節(jié)T細(xì)胞。這些細(xì)胞收集之后，用PBS洗滌三次。之后， 將5xl06細(xì)胞個(gè)對照細(xì)胞1，2，3或⑶4+iTreg細(xì)胞，溶于200 μ 1的PBS中，通過尾靜脈注射到24周齡的BWFl小鼠(美國Jackson Laboratory公司)中。這些小鼠在24周時(shí)已經(jīng)有了顯著的蛋白尿，表示這些注射的小鼠已經(jīng)發(fā)病。32周時(shí)(即注射這些細(xì)胞治療之后的 8周)，我們進(jìn)一步檢測各個(gè)組別的小鼠的蛋白尿水平。圖3A是每組5個(gè)小鼠在32周時(shí)蛋白尿水平檢測的綜合數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)被重復(fù)了一次并且有相似的結(jié)果。在注射細(xì)胞治療的8周(即小鼠32周齡)時(shí)候?qū)⑿∈筇幩?，取腎臟組織制成冰凍切片，免疫熒光染色，確定IgGl的表達(dá)情況。結(jié)果見圖3B，可見在接受CD4+iTreg細(xì)胞的小鼠，腎臟腎小球的抗原抗體復(fù)合物的沉淀水平最小。實(shí)施例4統(tǒng)計(jì)實(shí)施例3的小鼠的存活率，結(jié)果見圖4。圖4顯示復(fù)合配方誘導(dǎo)的狼瘡小鼠的 CD4+細(xì)胞治療狼瘡小鼠之后，能夠顯著延長疾病小鼠的存活。僅僅注射CD4+iTreg細(xì)胞能夠顯著延長狼瘡小鼠的存活。實(shí)施例5對照細(xì)胞和⑶4+iTreg細(xì)胞按照實(shí)施例3的方法相似地從已經(jīng)患病的CIA小鼠中的NaiVe CD4+細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型的制備用II型膠原和佐劑免疫DBA/1小鼠 (美國Jackson Laboratory公司)，并且用標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)分方法記錄小鼠的關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性 (Brand DD, Latham ΚΑ, Rosloniec EF. Collagen-induced arthritis. Nat Protoc. 2007 ； 2(5) 1269-75)。按照實(shí)施例3的方法，將5xl06細(xì)胞個(gè)對照細(xì)胞1，2，3或⑶4+iTreg細(xì)胞靜脈注射到14天前已經(jīng)被II型膠原和佐劑免疫的DBA/1小鼠中。每天記錄小鼠的關(guān)節(jié)炎情況， 計(jì)算總關(guān)節(jié)炎炎癥分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖5。圖5顯示本發(fā)明復(fù)合配方誘導(dǎo)的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎 (CIA)小鼠的⑶4+細(xì)胞能夠控制關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展。并且效果顯著，僅僅⑶4+iTreg細(xì)胞顯著地抑制了關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。實(shí)施例6從活動(dòng)期系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人(SLE)病人身上獲得靜脈血。采用密度梯度離心法用淋巴細(xì)胞分離液(Cellgro，Manassas，USA)分離肝素抗凝的病人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)。采用花環(huán)沉降法用綿羊紅細(xì)胞分離PBMC中的E+細(xì)胞。在E+細(xì)胞中加入用小鼠雜交瘤細(xì)胞0KT8 (anti-human CD8)、L243 (anti-human HLA-DR) ,OKMI (anti-human CDl lb)、 3G8 (anti-human CD 16)、UCHL-1 (anti-human CD45R0)制備的抗體(美國加州 BD 公司)，4°C 孵育 20 分鐘，加入 Dynabeads Goat anti-Mouse IgG(美國加州 Invitrogen 公司)，4°C震蕩15分鐘，靜置于磁場中，讓結(jié)合了磁珠的陽性細(xì)胞充分吸附于靠磁場的管壁，輕輕吸取細(xì)胞懸液，即可獲得NaiVe⑶4+T細(xì)胞懸液。可將該過程重復(fù)一次，以提高純度。這些細(xì)胞用抗⑶3/⑶28包埋的磁珠進(jìn)行刺激，結(jié)合IL_2(對照 細(xì)胞 1)，IL-2+TGF-^ (對照細(xì)胞 2)，IL-2+TGF-^+atRA(對照細(xì)胞 3)和 IL-2+TGF-0+atRA+Azac(CD4+iTreg細(xì)胞)進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)的方法同實(shí)施例1。從該SLE病人中制備20 X IO6PBMC,溶解在200 μ 1的PBS中，然后通過尾靜脈注射至Ij SCID common gamma chain KO 小鼠(美國 Jackson Laboratory 公司)中。這些小鼠會(huì)發(fā)展成為xeno-GVHD (異種供體抗宿主的免疫反應(yīng))，這些小鼠在接受細(xì)胞注射之后的22天全部死亡。同時(shí)注射對照細(xì)胞1幾乎沒有保護(hù)效果。同時(shí)注射對照細(xì)胞2和3，適當(dāng)?shù)牡珶o顯著意義地延長了小鼠的存活。但是，同時(shí)注射CD4+iTreg細(xì)胞顯著地延長了小鼠的存活。 同時(shí)注射的時(shí)候，是把5xl06個(gè)對照細(xì)胞或者⑶4+iTreg細(xì)胞與20X IO6PBMC進(jìn)行混勻，溶解在300μ 1的PBS中，然后通過尾靜脈注射到SCID common gamma chain KO小鼠(美國 Jackson Laboratory公司)中。各個(gè)試驗(yàn)組至少包括6個(gè)小鼠，試驗(yàn)被重復(fù)了一次并且有相似的結(jié)果。結(jié)果見圖6，顯示本發(fā)明復(fù)合配方也能夠誘導(dǎo)活動(dòng)期的SLE病人的CD4+細(xì)胞成為CD4+iTreg細(xì)胞。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種在體外誘導(dǎo)自身免疫性疾病患者的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療該自體自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)τ細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟將分離的原始T細(xì)胞給予抗CD3/CD28 抗體刺激，同時(shí)給予由以下(1) (4)成分組成的復(fù)合配方進(jìn)行刺激(1)IL-2，IL-I，IL-T,TNF-α 和 IL-15 中的任何一種或多種；(2)TGF- β ；(3)維甲酸，棕櫚酸鹽，視黃醛，合成的類視黃醇，異維A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一種或多種；和⑷氮胞啶和/或Ι-b-d-呋喃核糖-2 (Ih)-嘧啶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原始T細(xì)胞是NaiveCD4+細(xì)胞和/ 或Naifve CD8+細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗CD3/CD28抗體用抗CD2抗體，CD2 配體，LFA-3，刀豆素A和金黃葡萄球菌內(nèi)毒素B中的任何一種或者多種替代。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟，將分離的原始T細(xì)胞給予抗⑶3/⑶28抗體刺激，抗⑶3/⑶28抗體的濃度范圍是0. 1到5. 0μ g/ml，同時(shí)給予由以下 (1) (4)成分組成的復(fù)合配方進(jìn)行刺激(1)IL-2,IL-l，L-7，TNF-a和IL-15中的任何一種或多種，它們的濃度范圍是IUnit/ ml 到 300Units/ml ；(2)TGF-β，其濃度范圍是 2pg/ml 到 50ng/ml ；(3)維甲酸，棕櫚酸鹽，視黃醛，合成的類視黃醇，異維A酸，依曲替酯和曲古菌素A的任何一種或多種，它們的濃度范圍是0. 1到2. 0 μ M ；和⑷氮胞啶和/或Ι-b-d-呋喃核糖-2(lh)_嘧啶，它們的濃度范圍是0. 1到2.0μΜ。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟，將分離的原始CD4+細(xì)胞給予抗⑶3/⑶28抗體包裹的微小磁珠進(jìn)行刺激，同時(shí)給予IL-2，TGF- β，維甲酸和氮胞啶刺激， 刺激濃度是抗⑶3/⑶28抗體0. 1到5. 0 μ g/ml，磁珠濃度1個(gè)磁珠對1個(gè)細(xì)胞到1個(gè)磁珠對 20 個(gè)細(xì)胞，IL-2 是 lUnit/ml 到 300Units/ml，TGF-β 是 2pg/ml 到 50ng/ml ；維甲酸是0. 1到2. 0 μ Μ，氮胞啶是0. 1到2. 0 μ M ；刺激時(shí)間為3-7天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的刺激時(shí)，所用的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)是 AIM-V或者EX-VIVO 15培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)3 7天，細(xì)胞培養(yǎng)密度是1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/cm2， 培養(yǎng)介質(zhì)每48小時(shí)換液一次，每三天或者根據(jù)細(xì)胞的密度超過1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/cm2進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，每隔2 3天分瓶培養(yǎng)一次。
7.如權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的方法制備的調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的調(diào)節(jié)T細(xì)胞在制備預(yù)防或治療自身免疫性疾病或保護(hù)器官移植免疫排斥的藥物中的應(yīng)用。
9.一種體外誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療自體自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的刺激組合物，其特征在于，包括以下組分(1)IL-2,IL-l，L-7，TNF-a和IL-15中的任何一種或多種，它們的濃度范圍是IUnit/ ml 到 300Units/ml ；(2)TGF-β，其濃度范圍是 2pg/ml 到 50ng/ml ；(3)維甲酸，棕櫚酸鹽，視黃醛，合成的類視黃醇，異維A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一種或多種，它們的濃度范圍是0. 1到2.0μΜ;和 ⑷氮胞啶和/或Ι-b-d-呋喃核糖-2 (Ih)-嘧啶，它們的濃度范圍是0. 1到2.0 μ Μ。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，還包括抗⑶3/⑶28抗體，或者抗⑶2抗體，CD2配體，LFA-3，刀豆素A和金黃葡萄球菌內(nèi)毒素B中的任何一種或者多種，它們的濃度范圍是0.1到5.0 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在體外誘導(dǎo)自身免疫性疾病患者T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為治療自體自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法及制得的調(diào)節(jié)T細(xì)胞。該方法包括如下步驟將分離的原始T細(xì)胞給予抗CD3/CD28抗體刺激，同時(shí)給予由以下(1)～(4)成分組成的復(fù)合配方進(jìn)行刺激(1)IL-2，IL-1，IL-7，TNF-α和IL-15中的任何一種或多種；(2)TGF-β；(3)維甲酸，棕櫚酸鹽，視黃醛，合成的類視黃醇，異維A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一種或多種；和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶。該調(diào)節(jié)T細(xì)胞可應(yīng)用于制備預(yù)防或治療自身免疫性疾病或保護(hù)器官移植免疫排斥的藥物。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102321580SQ20111024322
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者劉中民, 王菊華, 鄒和建, 鄭頌國 申請人:鄭頌國