專利名稱：一種復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙肝疫苗，具體是指一種復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗，同時(shí)本發(fā)明也涉及這種疫苗的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球已有20多億人經(jīng)歷HBV感染。疫苗接種是控制和預(yù)防乙型肝炎及其長(zhǎng)期嚴(yán)重后遺癥最有效的措施。自1997年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦實(shí)施乙肝疫苗計(jì)劃免疫以來(lái)，大范圍的疫苗接種有效降低了 HBV感染率，然而HBV持續(xù)感染者仍超過(guò)3. 7億，每年甚至有100多萬(wàn)患者死于急性或慢性HBV感染導(dǎo)致的肝硬化、肝功能衰竭和原發(fā)性肝細(xì) 胞癌。預(yù)防和治療HBV感染迫在眉睫。目前，治療乙型肝炎感染者兩個(gè)難以解決的難題①肝內(nèi)HBV長(zhǎng)期存在并有不同程度復(fù)制，現(xiàn)有的抗病毒藥物難以根除HBV ;②絕大部分病人對(duì)HBV及其抗原呈免疫耐受狀態(tài)，使肝內(nèi)HBV免受免疫殺傷，從而有利于病毒在肝內(nèi)持續(xù)存在并復(fù)制。治療性疫苗與傳統(tǒng)意義上的預(yù)防性疫苗顯著不同。預(yù)防性疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，而對(duì)病毒性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，體液免疫并不能徹底清除細(xì)胞內(nèi)感染病毒，只有細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)才能發(fā)揮最根本的作用。進(jìn)一步的研究表明細(xì)胞免疫所產(chǎn)生的CTL將在清除被感染細(xì)胞的過(guò)程中起到十分重要的作用。DNA疫苗作為20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的一種新型治療性疫苗，是一種含抗原基因的表達(dá)質(zhì)粒，能全面地誘導(dǎo)特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。HBV DNA疫苗更是能打破其對(duì)HBsAg的免疫耐受，激發(fā)特異性CTL反應(yīng)，有效地清除HBV，中止感染。Davis HL等研究證實(shí)，對(duì)小鼠和黑猩猩免疫接種PCMV_S2_S疫苗都能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-HBs、抗pre_S2抗體,還能產(chǎn)生對(duì)HBsAg的細(xì)胞免疫應(yīng)答。Masanori Isogawa等研究表明，用表達(dá)HBsAg抗原的質(zhì)粒DNA直接免疫小鼠，可有效誘導(dǎo)特異性血清抗體產(chǎn)生以及MHCI類限制性CTL應(yīng)答，且該CTL應(yīng)答在體內(nèi)是由⑶4+、⑶8+效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的。HBV DNA疫苗在注射部位被原位細(xì)胞攝取后，通過(guò)所含的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子系統(tǒng)調(diào)節(jié)相應(yīng)靶蛋白的合成。靶蛋白被分解為肽段，肽段表位與β2微球蛋白和主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子形成三聚體.遞呈并激活CD8+T效應(yīng)細(xì)胞；或靶蛋白通過(guò)血運(yùn)和(或)淋巴循環(huán)系統(tǒng)匯集于淋巴結(jié)或脾臟中，為“專業(yè)”抗原遞呈細(xì)胞(APC)所吞噬，經(jīng)與MHC II類分子結(jié)合.激活⑶4+和Th細(xì)胞，Th細(xì)胞激活B效應(yīng)細(xì)胞(Be)和B記憶細(xì)胞(Bm)，Be將在骨髓中形成生發(fā)中心，長(zhǎng)期生成特異性抗體，Bm可誘導(dǎo)T記憶細(xì)胞(Tm)的產(chǎn)生，而Tm則作為潛在的CTL，保存在循環(huán)庫(kù)中。由于DNA疫苗表達(dá)的蛋白質(zhì)可作為內(nèi)源性抗原被遞呈，故具有傳統(tǒng)疫苗所不具備的優(yōu)勢(shì)，即能夠有效地誘導(dǎo)機(jī)體CTL的細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究表明，DNA疫苗誘生的CTL可識(shí)別和溶解體內(nèi)感染HBV的細(xì)胞，特別是此種CTL可分泌IFN- Y，并可抑制感染細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制或清除病毒而不引發(fā)細(xì)胞損傷。此夕卜.HBV DNA疫苗因可啟動(dòng)有效的抗原提呈途徑.促進(jìn)機(jī)體合成內(nèi)源性抗原，提呈相關(guān)表位。大量產(chǎn)生CD8+CTL細(xì)胞,所以這類疫苗也可以作為治療慢性乙型肝炎患者的候選物。T-bet,也稱Tbx21，系2000年哈佛大學(xué)Szabo等發(fā)現(xiàn)的一種重要的Thl細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，為T-box家族的新成員，是IFN-Y基因強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄激活劑，又能誘導(dǎo)并保持IL-12Ri3 2的表達(dá)，且能將分化中的效應(yīng)性Th2和已完全分化的Th2逆轉(zhuǎn)為Thl，伴隨產(chǎn)生大量的IFN-Y，并抑制IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答?！?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可在PlRES中共表達(dá)乙肝表面抗原大蛋白HBV-L和免疫佐劑T-bet蛋白的基因疫苗及其構(gòu)建方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗，含有PlRES質(zhì)粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中Τ-bet基因和HBV-L基因分別位于pIRES質(zhì)粒上的IRES元件的兩側(cè)；其中，pIRES為商業(yè)性的質(zhì)粒，含有多克隆位點(diǎn)A(MCSA)，多克隆位點(diǎn)B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分別位于IRES元件的兩側(cè)，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上。所述復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗構(gòu)建方法包括以下步驟(I)RT-PCR 法克隆人 T-bet 基因，人 T-bet 基因與 pMD18-T Simple Vector 進(jìn)行連接，構(gòu)建一個(gè)亞克隆載體pMD18-T/T-bet，然后用Nhe I、EcoR I從pMD18-T/T_bet載體上切下T-bet目的片段基因，與載體pIRES連接構(gòu)建pIRES/T-bet。(2)以 pCDNA3. I (_)/HBV-L 為模板 PCR 擴(kuò)增出 HBV-L 基因，HBV-L 基因與 pMDl8-TSimple Vector進(jìn)行連接，構(gòu)建一個(gè)亞克隆載體pMD18-T/HBV-L，然后用Sal I、Not I從PMD18-T/HBV-L載體上切下HBV-L基因片段，與構(gòu)建完成的pIRES/T-bet連接，得到復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(I)采用pIRES雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體，兩段基因各自表達(dá)，不影響彼此空間結(jié)構(gòu)。(2)首次采用轉(zhuǎn)錄因子T-bet作為免疫佐劑，T-bet是Thl細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，促使ThO細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化，并且能逆轉(zhuǎn)Th2細(xì)胞向Thl細(xì)胞轉(zhuǎn)化，所產(chǎn)生的Thl型免疫應(yīng)答，能更好的清除胞內(nèi)病毒。(3)采用HBV-L作為抗原基因，由于乙肝病毒表面抗原基因的易突變性，采用傳統(tǒng)的乙肝疫苗即乙肝表面抗原小蛋白進(jìn)行免疫時(shí)，部分人群不能產(chǎn)生保護(hù)性的抗體。由于presl抗原、pres2抗原在HBV與肝細(xì)胞相應(yīng)受體的粘附中起重要作用,但是包含presl抗原、pres2抗原的乙肝表面抗原大蛋白免疫機(jī)體時(shí),就可以產(chǎn)生針對(duì)presl抗原、pres2抗原的特性抗體，這些抗體具有良好的中和病毒的作用，并且乙肝表面抗原大蛋白相比乙肝表面抗原小蛋白，具有更多抗原表位，降低了免疫后不產(chǎn)生保護(hù)性抗體的幾率。以下將結(jié)合附圖和實(shí)施詳例說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的進(jìn)一步說(shuō)明，但并不表明本發(fā)明僅限于這些實(shí)施例。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。圖I復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗pIRES-T-L構(gòu)建流程2T_bet、HBV-L基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳3亞克隆載體pMD18-T/T_bet、pMD18-T/HBV_L限制性酶譜分析圖4復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗限制性酶譜分析
具體實(shí)施例方式I. PCR引物設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別作為擴(kuò)增T-bet、HBV_L的引物序列，引物序列和酶切位點(diǎn)見(jiàn)表 I。擴(kuò)增的T-bet、HBV-L基因片段大小分別為1608bp，1203bp。引物均由invitrogen公司合成。目的基因擴(kuò)增引物序列
基因編號(hào)引物酶切位點(diǎn)
Pl(up) 5，-ATAGCTAGCATGGGCATCGTGGAGC-3，Nhe \
'6P2(down) 5’-CCGCCGTGAATTCTCAGTTGGGAAAATAG-3 ’EcoR I
HBVLP3(UP) 5，-GCGTCGACAGCATGGGAGGTTGGTCTT-3 ’Sal I
'P4(down) 5,-TTGCGGCCGCAAGATGAGCTCGGATTCTCAAATG-3’ Not I2.目的基因的PCR擴(kuò)增2. IRT-PCR 法克隆人 Τ-bet 基因2. I. I人外周血淋巴細(xì)胞總RNA提取(I)用采血管取健康人抗凝血5ml, 3000rpm離心5min,吸出血清。(2)取一 15ml 離心管加入 2ml Ficoll。(3)在采血管中加Iml PBS重懸細(xì)胞，45度貼壁加入裝有Ficoll的離心管中，3000rpm 離心 15min 分層。(4)另取一 15ml離心管加入5mlPBS,取霧層到PBS中，3000rpm離心5min,棄上清。(5)細(xì)胞加 Iml Trizol 室溫裂解 5min。(6)加O. 2ml氯仿，蓋緊EP管上下顛倒混勻15s，室溫靜置2 3min。(7) 4°C, 12000g 離心 15min。(8)EP管內(nèi)分三層，取上層液相于EP管內(nèi)。(9)加O. 5ml異丙醇,室溫靜置lOmin。(10)4°C,12000g 離心 lOmin。(11)棄上清，加Iml 75%乙醇清洗沉淀。(12) 4°C，7500g 離心 5min。(13)去上清，干燥RNA，DEPC水溶解。2. I. 2通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA(I)在O. 2ml PCR管內(nèi)加入下列組分后充分混勻
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗，其特征在于含有PlRES質(zhì)粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中T-bet基因和HBV-L基因分別位于pIRES質(zhì)粒上的IRES元件的兩側(cè)；其中，pIRES為商業(yè)性的質(zhì)粒，含有多克隆位點(diǎn)A (MCSA)，多克隆位點(diǎn)B (MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分別位于IRES元件 的兩側(cè)， T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上； 所述T-bet基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示； 所述HBV-L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.權(quán)利要求I所述復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 (1)RT-PCR法克隆人T-bet基因，人T-bet基因與pMD18-T Simple Vector進(jìn)行連接，構(gòu)建一個(gè)亞克隆載體pMD18-T/T-bet，然后用Nhe I.EcoR I從pMD18-T/T_bet載體上切下T-bet目的片段基因，與載體pIRES連接構(gòu)建pIRES/T-bet。
(2)以pCDNA3. I (-) /HBV-L 為模板 PCR 擴(kuò)增出 HBV-L 基因，HBV-L 基因與 pMD 18-TSimple Vector進(jìn)行連接，構(gòu)建一個(gè)亞克隆載體pMD18-T/HBV-L，然后用Sal I、Not I從PMD18-T/HBV-L載體上切下HBV-L基因片段，與構(gòu)建完成的pIRES/T-bet連接，得到復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗。
3.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 (1)提取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;將得到的cDNA為模板，通過(guò)引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1608bp的T-bet片段；所述的引物 PI : 5 ’ -ATA GCTAGC ATGGGCATCGTGGAGC-3 ’ ； 所述的引物 P2 :5’ -CCGCCGT GAATTC TCAGTTGGGA AAATAG-3’ ； 斜體下劃線所述的GCTAGC為Nhe I酶切位點(diǎn)； 斜體下劃線所述的GAATTC為EcoR I酶切位點(diǎn)； (2)以質(zhì)粒pCDNA3.l(-)/HBV-L (北京地壇醫(yī)院成軍教授惠贈(zèng))為模板，通過(guò)引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1203bp的HBV-L基因片段； 所述的引物 P3 :5’ -GC GTCGAC AGCATGGGAGGTTGGTCTT-3’ ； 所述的引物 P4:5’ -TT GCGGCCGC AAGATGAGCTCGGATTCTCAAATG-3 ； 斜體下劃線所述的GTCGAC為Sal I酶切位點(diǎn)； 斜體下劃線所述的GCGGCCGC為Not I酶切位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟⑴中所訴PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4min 30sec,94°C 45sec，51°C 30sec,72°C 2min，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸IOmin ;并且向反應(yīng)體系中加入5%體積的DMS0。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中所訴PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4min 30sec,94°C 30sec,62°C 30sec,72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸IOmin0
6.權(quán)利要求I所述復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗的用途，其特征在于用于預(yù)防和治療乙型病毒型肝炎或其它病毒性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合型治療性乙肝基因疫苗及其構(gòu)建方法。該DNA疫苗含有pIRES質(zhì)粒、T-bet基因和HBV-L基因，T-bet基因和HBV-L基因分別位于pIRES質(zhì)粒的IRES元件兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)上，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上，T-bet基因和HBV-L基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和No.2所示，該DNA疫苗可用于預(yù)防和治療乙型病毒性肝炎。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102949733SQ20111024443
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者林紹強(qiáng), 晏永波, 李曉霞, 劉乃華, 成軍 申請(qǐng)人:林紹強(qiáng), 晏永波, 李曉霞