專利名稱：一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及材料和生物醫(yī)藥領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤已經成為威脅人類健康的重大疾病之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計數據顯示21世紀惡性腫瘤是人類的“頭號殺手”，有效地醫(yī)治惡性腫瘤已是科學研究中的當務之急。目前，全身化學藥物療法(化療)是惡性腫瘤的重要診療手段。但是由于化學藥物在治療過程中分布于全身，化療在臨床使用中存在的許多副作用，致使眾多癌癥患者最終并非死于惡性腫瘤本身，而是死于化療引起的副作用。納米磁靶向給藥體系是通過物理或化學方法將抗腫瘤藥物固載于磁性納米載體中，在外加磁場作用下，將載有藥物的載體定位于靶區(qū)，使其所含藥物穩(wěn)定釋放，集中在病變部位發(fā)揮作用，從而有效降低毒副作用，提高藥物療效，同時還可能穿越傳統(tǒng)藥物難以通過的血腦屏障，提高腦內藥物濃度，發(fā)揮腦靶向作用，在惡性腫瘤局部靶向定位治療中展現出巨大的應用前景，成為當今醫(yī)藥研究領域白勺 ^^ ； ^^ O目前應用于腫瘤化療領域的納米磁靶向藥物載體的主要形式包括納米磁靶向給藥體系和配體_受體介導的雙或多重靶向納米磁給藥體系。納米磁靶向給藥體系通常是采用物理或化學方法將抗腫瘤藥物以及Fe3CV Y -Fe2O3或純鐵等磁性納米粒子包裹于脂質體、高分子材料或活性碳等骨架材料中制成，或者是將抗腫瘤藥物與磁性納米顆粒通過偶聯劑結合制備而成。納米磁靶向給藥體系因受載體比表面積等因素的影響而使其藥物負載量受到限制，采用一般化學偶聯劑其載藥量受到納米磁顆粒表面活性基團含量的限制而難以進一步提高。同時，單一納米磁靶向給藥體系因其宏觀靶向給藥特點及其基質選擇性的限制而并非那么盡如人意。近年來配體-受體介導的雙或多重靶向納米磁給藥體系備受關注。正常情況下，人體內存在于細胞膜或胞內蛋白上的受體可特異性地識別配體分子，由于配體無毒、無免疫原性、可生物降解，可利用這一途徑將藥物特異性地導入體內某一部位發(fā)揮藥效，同時減少對其它部位的損傷并將其導入到體內特定的位置。配體-受體介導的雙或多重靶向納米磁給藥體系的制備主要包括Fe3O4納米磁顆粒的制備、殼_核結構的Fe3O4OSiO2納米磁顆粒的制備、殼-核結構的Fe3O4OSiO2納米磁顆粒表面修飾、配體組裝、藥物組裝幾個步驟。胡艷，等人，“甲氨蝶呤葉酸受體_磁雙重靶向納米粒的制備及評價，中國新藥雜志，2009，18 (24)，2370 2373”，以APTES (3-氨基丙基三乙氧基硅烷)對單層殼_核結構的Fe3O4OSiO2表面進行氨基修飾，在EDC (1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)活化作用下，將配體葉酸偶聯在其表面，將甲氨蝶呤通過靜電力吸附固定在納米粒子表面，實現磁性納米粒子靶向分子偶聯和藥物負載，其載藥量為26. 71%，包封率為64. 76%。該方法所制得的抗腫瘤納米藥物雖然實現了受體-磁雙重靶向性，但是載藥量很低。Yufang Zhu,等"Folate-Conjugated Fe3O4QSiO2 Hollow Mesoporous Spheresfor Targeted Anticancer Drug Delive，J. Phys. Chem. C，2010，114(39)，16382 16388”， 以APTES對中空介孔單層殼-核結構的Fe3O4OSiO2表面進行氨基修飾，然后將經過DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)和NHS活化的配體葉酸通過氨基偶聯在Fe3O4OSiO2表面，并將帶正電荷的DOX (多柔比星)通過靜電力吸附固定在帶負電荷的Fe3O4OSiO2表面，制得一種雙重靶向性抗腫瘤藥物納米磁載藥體系，其載藥量為83. 1%。該體系通過中空介孔來增大載體表面積，以提高載藥量，制備過程較為復雜，成本較高。專利CN101923932A公開了一種多功能雙層殼-核結構的磁性納米粒子及其制備方法，該方法將納米磁性粒子經過表面活性劑處理后，通過催化劑催化二氧化硅前驅體水解在磁性納米粒子表面包覆一層SiO2，再在SiO2表面包覆一層含有一種或多種功能基團的水解化硅烷偶聯劑層，該硅烷偶聯劑層可以通過催化劑催化硅烷偶聯劑或配體修飾的硅烷偶聯劑水解而得，或者先通過催化劑催化硅烷偶聯劑水解在SiO2表面包覆一層水解化硅烷偶聯劑，再與配體偶聯制得，并可通過化學或物理方法將藥物、配體等生物活性分子連接于納米粒子殼層中或表面，可以戊二醛為偶聯劑通過Schiff反應將抗惡性腫瘤藥物多柔比星與納米磁性粒子偶聯。目前，如何以簡單的方法，較低的成本，將磁介導的宏觀靶向與配體-受體介導的微觀靶向作用相結合，制備載藥量高、靶向性好的納米磁性給藥體系不僅成為目前醫(yī)用納米材料領域研究的最新熱點，也待解決的急需問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)及其制備方法。該方法針對靶向治療腫瘤的需求，采用共沉淀法制備磁性納米粒子，并通過化學方法在磁性納米粒子核包覆一層多官能基團修飾的SiO2層。采用單臂、雙臂、多臂等新型多功能偶聯劑，利用該納米磁顆粒表面的一種功能基團將磁顆粒與抗腫瘤藥物實現高效連接，使其載藥量顯著提高。在提高載藥量的同時，進一步利用納米磁顆粒表面的另一種功能基團將納米磁顆粒與相關配體結合，建立安全有效的高載藥量受體-磁雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)。根據本發(fā)明的第一方面，提供了一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)，包括磁性納米粒子核；包覆于磁性納米粒子核外的多官能基團修飾的SiO2層；位于多官能基團修飾的SiO2層上的抗惡性腫瘤藥物和配體；其中，配體偶聯在多官能基團修飾的5102層上，抗惡性腫瘤藥物通過雙臂偶聯劑或者三臂偶聯劑或者雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑的結合連接在多官能基團修飾的SiO2層上。在一個實施例中，所述多官能基團修飾的SiO2層為受保護的氨基、羧基或氨基、醛基或氨基、羧基等兩個不同官能基團同時修飾于SiO2層表面，其厚度為2 50nm。在一個實施例中，所述配體為分子內含有氨基的配體化合物，包括唾液酸糖蛋白或轉鐵蛋白或氨基半乳糖或葉酸或單克隆抗體。在一個實施例中，所述抗腫瘤藥物為含氨基的藥物，包括多柔比星、柔紅霉素、依達比星、吡柔比星、絲裂霉素、平陽霉素、培洛霉素、伊力替康等。在一個實施例中，所述磁性納米粒子包括納米鐵、Fe3O4, γ -Fe3O4以及其他金屬鐵氧體、錳鋅鐵氧體、鎳銅鋅鐵氧體中的一種或幾種，其粒徑為5 lOnm。
根據本發(fā)明的第二方面，提供了一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)的制備方法，包括步驟A，制備磁性納米粒子；步驟B，在磁性納米粒子表面包覆一層SiO2層，制得殼_核結構的磁性納米粒子@ SiO2磁性納米顆粒；步驟C，對磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面進行多官能基團修飾，制得磁性納米粒子@多官能基團修飾的SiO2磁性納米顆粒；步驟D，在磁性納米粒子@多官能基團修飾的SiO2磁性納米顆粒表面進行配體組裝；步驟E，在磁性納米粒子@多官能基團修飾的SiO2磁性納米顆粒表面進行抗腫瘤藥物組裝；其特征在于步驟E包括利用磁性納米顆粒表面的氨基、羧基或者醛基，采用雙臂偶聯劑、三臂偶聯劑、多臂偶聯劑或者雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑的結合將抗腫瘤藥物連接在磁性納米顆粒的多官能基團修飾的SiO2表面。在一個實施例中，其特征在于步驟E中采用雙臂偶聯劑或三臂偶聯劑將抗腫瘤藥物連接在表面含有氨基和配體的磁性納米顆粒的表面，其中雙臂偶聯劑或者三臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的氨基偶聯，抗腫瘤藥物與雙臂偶聯劑或三臂偶聯劑偶聯。所述雙臂偶聯劑指含有兩個醛基、羧基、琥珀酰亞胺酯基、琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基的化合物。優(yōu)選所述雙臂偶聯劑為戊二醛、乙二醛、丙二醛、辛二酸二琥珀酰亞胺酯、N， N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯或3-琥珀酰亞胺-氨基三醋酸酯。所述三臂偶聯劑指含有三個琥珀酰亞胺酯基、醛基、琥珀酰亞胺磺酸鈉酯基的化合物。所述三臂偶聯劑優(yōu)選為3-琥珀亞酰胺乙酸酯。在一個實施例中，步驟E中采用雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑的結合將抗腫瘤藥物連接在表面含有氨基和配體的磁性納米顆粒的表面，包括水合胼脫氨基保護將雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑與磁性納米顆粒的表面的氨基發(fā)生偶聯反應，然后在存在活化劑的條件下將表面含有多臂偶聯劑的磁性納米顆粒與抗腫瘤藥物進行偶聯反應，其中，雙臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的氨基偶聯，多臂偶聯劑與雙臂偶聯劑偶聯，抗腫瘤藥物與多臂偶聯劑偶聯。在一個例子中，所述活化劑是1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和 N-羥基琥珀酰亞胺。所述多臂偶聯劑指含有一個氨基和多個羧基的化合物。所述多臂偶聯劑優(yōu)選為聚谷氨酸。在一個實施例中，步驟E中采用多臂偶聯劑將抗腫瘤藥物連接在表面含有羧基和配體的磁性納米顆粒的表面，包括表面含有羧基和配體的磁性納米顆粒用活化劑活化后與多臂偶聯劑偶聯，然后在活化劑存在的條件下，將含有多臂偶聯劑和配體的磁性納米粒子與抗腫瘤藥物進行偶聯反應，其中，多臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的羧基偶聯，抗腫瘤藥物與多臂偶聯劑偶聯。在一個例子中，所述活化劑是1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和 N-羥基琥珀酰亞胺。
所述多臂偶聯劑指含有一個氨基和多個羧基的化合物。所述多臂偶聯劑優(yōu)選為聚谷氨酸。在一個實施例中，步驟E中采用多臂偶聯劑將抗腫瘤藥物連接在表面含有醛基和配體的磁性納米顆粒的表面，包括表面含有醛基和配體的磁性納米顆粒與多臂偶聯劑偶聯，然后在活化劑存在的條件下，將含有多臂偶聯劑和配體的磁性納米粒子與抗腫瘤藥物進行偶聯反應，其中，多臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的醛基偶聯，抗腫瘤藥物與多臂偶聯劑偶聯。在一個例子中，所述活化劑是1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和 N-羥基琥珀酰亞胺。所述多臂偶聯劑指含有一個氨基和多個羧基的化合物。所述多臂偶聯劑優(yōu)選為聚谷氨酸。根據本發(fā)明方法，步驟E包括將表面含有羧基和配體或者醛基和配體的磁性納米顆粒與抗腫瘤藥物反應，制得表面含有抗腫瘤藥物和配體的磁性納米顆粒?？梢圆捎萌龡l途徑對磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面進行多官能基團修飾。根據本發(fā)明方法的一個實施例，步驟C包括利用磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑反應進行單氨基修飾，所制得的表面含有氨基的磁性納米顆粒與帶有受保護氨基的羧基修飾劑反應，制得表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。其中，所述帶有受保護氨基的羧基修飾劑為氨基被鄰苯二酸酐保護的谷氨酸酐。在一個具體的實施例中，將磁性納米粒子分散在水-乙醇混合溶液中，加入正硅酸乙酯(TEOS)，氨水和在20 40°C下反應12 48h，離心分離，洗滌，真空干燥。制得SiO2 包覆磁性納米粒子。利用SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑反應進行單氨基修飾，再與氨基被鄰苯二酸酐保護的谷氨酸酐反應，制得表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。根據本發(fā)明方法的一個實施例，步驟C包括利用磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑、環(huán)氧乙烷基硅烷偶聯劑共同反應，所制得的表面含有羥基和氨基的磁性納米顆粒在氧化催化劑存在下進行催化氧化反應，制備表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。其中，所述氧化催化劑包括NaIO4或 NaClO0在一個具體的實施例中，將磁性納米粒子分散在水_乙醇混合溶液中，加入TE0S， 氨水和在20 40°C下反應12 48h，離心分離，洗滌，真空干燥。制得SiO2包覆磁性納米粒子。利用SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑、環(huán)氧乙烷基硅烷偶聯劑共同反應，再通過與 NaIO4或NaClO催化氧化反應，制備表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。根據本發(fā)明方法的一個實施例，步驟C包括利用磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑反應進行單氨基修飾，所制得的表面含有氨基的磁性納米顆粒與帶有受保護氨基的羧基修飾劑反應，制得表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2，將表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2用水合胼氨基脫保護，制得表面同時具有羧基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。本發(fā)明方法中的配體組裝是利用磁性納米粒子@多官基能團SiO2表面的一個官能基團如羧基、氨基、醛基等進行。根據利用的不同官能基團采用不同反應途徑，主要包括四條途徑，在一個實施例中，步驟D包括將所述表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2通過活化劑進行活化處理，再與含氨基的配體反應，所制得表面含有受保護氨基及配體的磁性納米顆粒，再采用水合胼將表面含有受保護氨基及配體的磁性納米顆粒進行氨基脫保護處理，制得表面含有氨基及配體的磁性納米顆粒。其中，所述活化劑是1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺。在一個實施例中，步驟D包括將所述表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2與配體通過SchifT反應偶聯，制得表面含有氨基及配體的磁性納米顆粒。在一個實施例中，步驟D包括將表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@ 多官能基團SiO2與用活化劑處理的含羧基的配體反應，制得表面含有醛基及配體組裝的磁性納米粒子。其中，所述活化劑是1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺。在一個實施例中，步驟D包括將表面同時具有羧基和氨基修飾的磁性納米粒子@ 多官能基團SiO2與活化劑處理后的含羧基的配體反應，制得表面含有羧基及配體組裝的磁性納米粒子。其中，所述活化劑是1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺。在根據本發(fā)明方法的一個實施例中，所述方法還包括在步驟E后選擇性地進行配體的二次組裝，以加強配體偶聯量。不同于之前報道的磁性納米載藥體系，本發(fā)明所報道的高載藥量受體_磁雙重靶向抗惡性腫瘤納米給藥體系的載藥量高，載藥率最高可達83.8%，這個值比通常采用脂質體或表面活性劑膠束作為藥物載體(12. 4% )高出約6倍，并且載藥量可通過改變不同偶聯方法和實驗條件在200 μ g 5000 μ g范圍內可控調節(jié)。根據本發(fā)明方法制備的磁性納米載藥體系同時偶聯了相關配體，具有受體-靶向功能。此外，根據本發(fā)明方法制備的磁性納米載藥體系還具有超順磁性，具有磁-靶向功能。通過受體_磁雙重靶向，可完成對靶器官、 靶細胞到甚至細胞內靶結構的選擇性導入，實現針對腫瘤的嚴格靶向治療。通過本研究，可為解決目前納米磁性藥物載體普遍存在的載藥量低、靶向性不強等問題提供一條新途徑， 為靶向定位治療腫瘤的進一步臨床應用提供新的技術基礎。


下面結合附圖來對本發(fā)明作進一步詳細說明圖1為對磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面進行多官能基團修飾途徑示意圖。圖2為配體組裝過程示意圖。圖3為以聚谷氨酸(PLGA)為多臂偶聯劑，將抗腫瘤藥物連接在磁性納米顆粒的表面的反應途徑示意圖。圖4為葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物紅外圖譜。
圖5為不同濃度的樣品對細胞Hela的抑制率。其中，A 磁顆粒B 磁性多柔比星C 葉酸修飾磁性多柔比星。圖6為Hela細胞攝取磁性多柔比星㈧和葉酸修飾磁性多柔比星⑶后的熒光顯微照片。
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍。實施例實施例1 :PLGA間接偶聯法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)沉淀法制備納米四氧化三鐵納米粒子，再加入到經通氮除氧的表面活性劑溶液中，超聲分散30min后在60°C氮氣氛圍中攪拌12h。最后在體系冷卻至室溫后利用磁鐵將產物磁分離，丙酮洗滌后分散到乙醇/水溶液中得到穩(wěn)定的磁性納米粒子分散液。(2)取上述(1)制備的磁性納米粒子分散液超聲1 60min后加入氨水及正硅酸乙酯(體積比10 3)，40°C下機械攪拌12h，離心分離產物，產物用乙醇洗滌后分散在乙醇 /水中，制得SiO2包覆磁性納米粒的分散液。(3)取上述(2)制備的磁性納米粒子分散液超聲30min后加入氨水及氨基硅烷偶聯劑KH550(體積比1 1)，40°C下機械攪拌12h，磁分離或離心分離產物，產物分別用去離子水和乙醇洗滌三次，40°C真空干燥24h。(4)稱取約質量比1 1鄰苯二甲酸酐和谷氨酸放入硬質大試管，180°C油浴加熱至熔融。用適量乙醇-水溶液溶解反應產物，冷卻結晶后過濾洗滌抽干。取上步產物加入醋酐，回流，冷卻結晶。用適量乙醇-水溶液重結晶，過濾，抽干，制得產物A氨基保護的谷氨酸酐。(5)取步驟(3)所得氨基修飾磁性納米顆粒60mg，加入步驟(4)所得氨基保護的谷氨酸酐約0. 16 0. 20g,超聲分散在50mL蒸餾水中，常溫下攪拌lh，取出，離心分離。制得制得產物B，表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的Fe3O4O多官能基團Si02。步驟(3) (5)對磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面進行多官能基團修飾途徑示意圖見圖1。(6)取上述產物B200 μ g，加入2mgEDC和2mgNHS，超聲lOmin，洗滌后干燥過夜。得活化磁性納米顆粒。(7)在上述活化的磁性納米粒子中加入0. 20mL、2mg/mL葉酸溶液，1. 80mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲60min，上層清液待測，洗滌后離心分離。步驟(6)和(7)配體組裝過程示意圖見圖2。(8)加入6.0yL水合胼稀釋液以及1.60mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應 30min，洗滌后離心分離。然后入2mgPLGA (聚谷氨酸鈉)，1. 20mL磷酸鹽緩沖溶液，0. 20mL、 15%戊二醛，間隔超聲反應1. 5 2h，洗滌后離心分離，再加入2mgEDC和2mgNHS，加入 0. 40mL、4mg/mL多柔比星溶液，超聲1. Oh。磁分離產物。步驟(8)以聚谷氨酸(PLGA)為多臂偶聯劑，將抗腫瘤藥物連接在磁性納米顆粒的表面的反應途徑示意圖見圖3。
(9)最后加入0. 20mL活化的葉酸溶液超聲Ih結束反應，磁分離或離心分離，洗至幾近無色后40°C真空干燥24h。得最終產物。上述組裝過程制得的葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物的紅外圖譜見圖4。實施例2 =TSAT法制備高載藥量半乳糖修飾磁性納米多柔比星藥物(1)將上述實施例1步驟(6)中所得活化磁性納米顆粒中加入0. 20mL、2mg/mL氨基半乳糖溶液，1. SOmL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲60min，上層清液待測，洗滌后離心或磁分離產物。(2)加入6.0yL水合胼稀釋液以及1.60mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應 30min，洗滌后離心分離。然后加入2mg/mL的TSAT溶液200 μ L，0. 40mL、4mg/mL多柔比星溶液，磷酸鹽緩沖溶液溶液中間隔超聲反應1. 5 2h，洗滌后離心或磁分離產物。分別用去離子水及乙醇溶液洗至無色后40°C真空干燥24h。得最終產物。實施例3 戊二醛及NaIO4氧化法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)將上述實施例1步驟(2)中制得SiO2包覆磁性納米粒子分散液超聲30min 后加入氨水或硫酸溶液，再加入氨基硅烷偶聯劑KH550和KH560(體積比1 1)，40°C下機械攪拌12h，磁分離或離心分離產物，產物分別用去離子水和乙醇洗滌三次，40°C真空干燥 24h。(2)將上步產物超聲分散于經滅菌處理的二次水中，制得lmg/mL磁流體。取磁流體200 μ L，加入0. 80mL 二次水和1. 00mL10%高碘酸鈉溶液，間隔超聲反應60min。離心或磁分離產物，二次水和乙醇洗滌5次，離心后真空干燥。(3)將⑵產物加入1. 80mLPBS和0. 20mL2mg/mL的葉酸水溶液，間隔超聲反應 1. 5h，產物用二次水洗滌后離心或磁分離。(4)取上步(3)產物，洗滌后加入0.20mL、2mg/mL多柔比星溶液，1.20mLPBS， 0. 20mL15%戊二醛水溶液，間隔超聲反應lh，離心或磁分離產物，用水和乙醇洗滌至上層清液幾近無色，40°C真空干燥24h，得最終產物。實施例4 戊二醛及NaClO氧化法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)將上述實施例3步驟(1)中制得磁性納米粒子產物超聲分散于經滅菌處理的二次水中，制得lmg/mL磁流體。取磁流體200yL，加入400mL、2 1的碳酸氫鈉飽和溶液和5. 2% NaClO溶液，0. 20mL2, 2,6,6-四甲基哌啶氧化物醇溶液，0. 20mL、5mg/mL的KBr溶液，0. 20mL 二次水，在15°C以下間隔超聲反應0. 5h。離心或磁分離產物，二次水和乙醇洗滌 5次，40°C真空干燥24h(2)將上述(1)產物加入1. 80mL PBS和0. 20mL、2mg/mL的葉酸水溶液，間隔超聲反應1. 5h，產物用二次水洗滌后離心或磁分離。(3)取上步(2)產物，洗滌后加入0. 20mL、2mg/mL多柔比星溶液，1. 20mL PBS, 0. 20mL 15%戊二醛水溶液，間隔超聲反應lh，離心或磁分離產物，用水和乙醇洗滌至上層清液幾近無色，40°C真空干燥24h，得最終產物。實施例5 直接偶聯法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)取上述實施例1步驟(5)所制具有羧基和受保護氨基修飾的Fe3O4O多官能基團SiO2產品，加入6. 0 μ L水合胼稀釋液以及1. 60mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應30min， 洗滌后離心分離，制得具有氨基和羧基修飾的Fe3O4O多官能基團SiO2 ；
(2)在上述具有氨基和羧基修飾的Fe3O4O多官能基團SiO2中加入0. 20mL、2mg/mL 經活化劑活化后的葉酸溶液，1. SOmL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲60min，上層清液待測，洗滌后離心或磁分離產物。(3)將上述產物加入2mgEDC和2mgNHS，超聲lOmin，洗滌后干燥過夜。得活化磁性納米顆粒。(4)加入0. 40mL、2mg/mL多柔比星溶液，1. 60mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應 1. 5 2h，洗滌后離心或磁分離產物。分別用去離子水及乙醇溶液洗至無色后40°C真空干燥24h。得最終產物。實施例6 =PLGA直接偶聯法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)在實施例5中步驟(3)產物中加入2mgPLGA (聚谷氨酸鈉)，1. 40mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應1. 5 2h，洗滌后離心分離。(2)再加入2mgEDC和2mgNHS，加入0. 40mL、2mg/mL多柔比星溶液，間隔超聲反應 1. 5 2h，洗滌后離心或磁分離產物。分別用去離子水及乙醇溶液洗至無色后40°C真空干燥24h。得最終產物。實施例7 直接偶聯及NaIO4氧化法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)將上述實施例3中步驟⑵產物加入1. 80mLPBS和0. 20mL2mg/mL的經活化劑活化的葉酸水溶液，間隔超聲反應1. 5h，產物用二次水洗滌后離心或磁分離。(2)加入0. 40mL、2mg/mL多柔比星溶液，1. 60mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應 1. 5 2h，洗滌后離心或磁分離產物。分別用去離子水及乙醇溶液洗至無色后40°C真空干燥24h。得最終產物。實施例8 =PLGA直接偶聯及NaIO4氧化法制備葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物(1)將上述實施例7中步驟(1)產物加入2mgPLGA (聚谷氨酸鈉)，1. 40mL磷酸鹽緩沖溶液，間隔超聲反應1. 5 2h，洗滌后離心分離。(2)再加入2mgEDC和2mgNHS，加入0. 40mL、2mg/mL多柔比星溶液，間隔超聲反應 1. 5 2h，洗滌后離心或磁分離產物。分別用去離子水及乙醇溶液洗至無色后40°C真空干燥24h。得最終產物。實施例9 葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物的對宮頸腫瘤Hela細胞毒性及激光共聚焦顯微分析細胞毒性實驗采用MTT法體外藥物篩選，具體步驟如下(1)細胞消化、計數、制成濃度為1X105個/mL的細胞懸液，96孔板中每孔加入 100 μ L細胞懸液(每孔1 X 104個細胞)；(2)96孔板置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；(3)用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μ L相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組，溶媒對照組，陽性對照組，每組五個復孔；(4)96孔板置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ；(5)將96孔板進行MTT染色，λ = 490nm,測定OD值。1)每孔加入20 μ L MTT (5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h ；2)棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，搖床IOmin輕輕混勻；3) λ = 490nm,酶標儀讀出每孔的OD值，計算抑制率。
不同濃度的樣品對細胞Hela的抑制率見圖5，研究結果表明，與未修飾配體的磁性納米藥物相比，配體修飾后的多柔比星-磁性納米藥物(FDMP)顯示出更強的細胞毒性， 0. 375 μ g/mL時對腫瘤細胞的抑制率可以達到97%，同時IC5tl值也比未修飾配體的磁性納米藥物降低了 3. 3倍。實施例10 葉酸修飾納米磁性多柔比星藥物的對宮頸腫瘤Hela細胞熒光顯微分析ImL Hela細胞懸濁液(IX IO4個細胞)在24孔的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12h，然后再與4μ g樣品培養(yǎng)30min，用0. IM的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察，Hela 細胞攝取磁性多柔比星(A)和葉酸修飾磁性多柔比星(B)后的熒光顯微照片見圖6。研究結果表明，與未修飾配體的磁性納米藥物相比，配體修飾后的多柔比星-磁性納米藥物(FDMP)更容易被惡性宮頸腫瘤細胞Hela攝取。
權利要求
1.一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)，包括磁性納米粒子核；包覆于磁性納米粒子核外的多官能基團修飾的SiO2層；位于多官能基團修飾的5102層上的抗惡性腫瘤藥物和配體；其中，配體偶聯在多官能基團修飾的SiO2層上，抗惡性腫瘤藥物通過雙臂偶聯劑或者三臂偶聯劑或者雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑的結合連接在多官能基團修飾的SiO2層上。
2.一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)的制備方法，包括步驟A，制備磁性納米粒子；步驟B，在磁性納米粒子表面包覆一層SiO2層，制得殼-核結構的磁性納米粒子OSiO2 磁性納米顆粒；步驟C，對磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面進行多官能基團修飾，制得磁性納米粒子@多官能基團修飾的SiO2磁性納米顆粒；步驟D，在磁性納米粒子@多官能基團修飾的SiO2磁性納米顆粒表面進行配體組裝；步驟E，在磁性納米粒子@多官能基團修飾的SiO2磁性納米顆粒表面進行抗腫瘤藥物組裝；其特征在于步驟E包括利用磁性納米顆粒表面的氨基、羧基或者醛基，采用雙臂偶聯劑、三臂偶聯劑、多臂偶聯劑或者雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑的結合將抗腫瘤藥物連接在磁性納米顆粒的多官能基團修飾的SiO2表面。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟E中采用雙臂偶聯劑或三臂偶聯劑將抗腫瘤藥物連接在表面含有氨基和配體的磁性納米顆粒的表面，其中雙臂偶聯劑或者三臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的氨基偶聯，抗腫瘤藥物與雙臂偶聯劑或三臂偶聯劑偶聯；或者，步驟E中采用雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑的結合將抗腫瘤藥物連接在表面含有氨基和配體的磁性納米顆粒的表面，包括水合胼脫氨基保護將雙臂偶聯劑和多臂偶聯劑與磁性納米顆粒的表面的氨基發(fā)生偶聯反應，然后在存在活化劑的條件下將表面含有多臂偶聯劑的磁性納米顆粒與抗腫瘤藥物進行偶聯反應，其中，雙臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的氨基偶聯，多臂偶聯劑與雙臂偶聯劑偶聯，抗腫瘤藥物與多臂偶聯劑偶聯。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟E中采用多臂偶聯劑將抗腫瘤藥物連接在表面含有羧基和配體的磁性納米顆粒的表面，包括表面含有羧基和配體的磁性納米顆粒用活化劑活化后與多臂偶聯劑偶聯，然后在活化劑存在的條件下，將含有多臂偶聯劑和配體的磁性納米粒子與抗腫瘤藥物進行偶聯反應，其中，多臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的羧基偶聯，抗腫瘤藥物與多臂偶聯劑偶聯；或者，將表面含有羧基和配體的磁性納米顆粒與抗腫瘤藥物反應，制得表面含有抗腫瘤藥物和配體的磁性納米顆粒。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟E中采用多臂偶聯劑將抗腫瘤藥物連接在表面含有醛基和配體的磁性納米顆粒的表面，包括表面含有醛基和配體的磁性納米顆粒與多臂偶聯劑偶聯，然后在活化劑存在的條件下，將含有有多臂偶聯劑和配體的磁性納米粒子與抗腫瘤藥物進行偶聯反應，其中，多臂偶聯劑直接與磁性納米顆粒表面的醛基偶聯，抗腫瘤藥物與多臂偶聯劑偶聯；或者，將表面含有醛基和配體的磁性納米顆粒與抗腫瘤藥物反應，制得表面含有抗腫瘤藥物和配體的磁性納米顆粒。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟C包括利用磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑反應進行單氨基修飾，所制得的表面含有氨基的磁性納米顆粒與帶有受保護氨基的羧基修飾劑反應，制得表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2 ；或者，將表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2用水合胼氨基脫保護，制得表面同時具有羧基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟C包括利用磁性納米粒子OSiO2磁性納米顆粒表面SiO2層的羥基與氨基硅烷偶聯劑、環(huán)氧乙烷基硅烷偶聯劑共同反應，所制得的表面含有羥基和氨基的磁性納米顆粒在氧化催化劑存在下進行催化氧化反應，制備表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團Si02。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟D包括將所述表面同時具有羧基和受保護氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2通過活化劑進行活化處理，再與含氨基的配體反應，所制得表面含有受保護氨基及配體的磁性納米顆粒，再采用水合胼將表面含有受保護氨基及配體的磁性納米顆粒進行氨基脫保護處理，制得表面含有氨基及配體的磁性納米顆粒。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟D包括將表面同時具有羧基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2與活化劑處理后的含羧基的配體反應，制得表面含有羧基及配體組裝的磁性納米粒子。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟D包括將表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2與用活化劑處理的含羧基的配體反應，制得表面含有醛基及配體組裝的磁性納米粒子；或者，將所述表面同時具有醛基和氨基修飾的磁性納米粒子@多官能基團SiO2與配體通過SchifT反應偶聯，制得表面含有氨基及配體的磁性納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)及其制備方法。該方法針對靶向治療腫瘤的需求，采用共沉淀法制備磁性納米粒子，并通過化學方法在磁性納米粒子核包覆一層多官能基團修飾的SiO2層。采用單臂、雙臂、多臂等新型多功能偶聯劑，利用該納米磁顆粒表面的一種功能基團將磁顆粒與抗腫瘤藥物實現高效連接，使其載藥量顯著提高。在提高載藥量的同時，進一步利用納米磁顆粒表面的另一種功能基團將納米磁顆粒與相關配體結合，建立安全有效的高載藥量受體-磁雙重靶向抗惡性腫瘤納米載藥系統(tǒng)。
文檔編號A61K47/02GK102294035SQ20111024823
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權日2011年8月25日
發(fā)明者郭琳 申請人:南京大學