專利名稱：利用生物反應(yīng)器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，具體地說，涉及一種利用生物反應(yīng)器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
豬乙型腦炎又稱日本乙型腦炎，是一種由日本乙型腦炎病毒引起的蚊媒性人畜共患病毒性傳染病。主要通過吸血昆蟲(主要為蚊子)叮咬，以豬-蚊-豬循環(huán)擴(kuò)大病毒的傳播，使其成為乙型腦炎病毒的主要增殖宿主和傳染源。各種年齡、品種、性別的豬均易感染此病，患病種豬可垂直傳播傳給仔豬。該病夏秋季節(jié)流行，南方6 7月，東北8 9月達(dá)到高峰。在我國規(guī)模型養(yǎng)豬場中廣泛存在，呈地方性流行，北京、云南、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、山西、山東、吉林、甘肅、河北等省份均報(bào)道從豬體內(nèi)或蚊體內(nèi)分離到乙型腦炎病毒。豬乙型腦炎無特效治療藥，最主要的防治措施為免疫接種。目前乙腦疫苗主要有三種日本的鼠腦純化疫苗、中國的SA14-14-2株減毒活疫苗及滅活疫苗。乙腦組織滅活苗雖然安全可靠，但生產(chǎn)成本高，存在大量無關(guān)抗原成分，副作用明顯。弱毒疫苗雖然保護(hù)性好，但可能出現(xiàn)潛在的毒力返強(qiáng)、帶毒、排毒、垂直傳播等不安全因素，而利用原代地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)乙型腦炎滅活疫苗的工藝，很難提高抗原含量和控制疫苗質(zhì)量，因此，尋找一種安全、有效的乙腦滅活疫苗的生產(chǎn)方法成為亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服已有的豬乙腦滅活疫苗制備方法中存在的不足，提供一種新型的、安全、有效的豬乙腦滅活疫苗的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用生物反應(yīng)器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，其是利用生物反應(yīng)器和Cytodex-I微載體系統(tǒng)，用乙腦病毒P3株對密度可達(dá)I 7 X 106/ml的乙腦病毒P3株適應(yīng)的Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒感染，培養(yǎng)條件為34 ± 2°C，pH值7 8，待細(xì)胞病變達(dá)到75%以上時，收獲含有乙腦病毒的培養(yǎng)液，然后對收獲的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行滅活。其中，乙腦病毒P3株對Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒感染的接種比例為O. 005 O. 5M. O. I。優(yōu)選地，使用β_丙內(nèi)酯滅活病毒，使用量為β_丙內(nèi)酯病毒液(V : V)=O. 1-2 4000，更優(yōu)選地，β-丙內(nèi)酯病毒液(V : V) = I : 4000。前述的方法，其還包括最后向病毒滅活液中加入氫氧化鋁膠和硫柳汞的步驟。優(yōu)選地，氫氧化招膠和硫柳萊的終濃度分別為O. 6-1. 2mg/ml和O. lmg/ml。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明利用生物反應(yīng)器和Cytodex-I微載體系統(tǒng)，用抗原性好的P3株乙腦病毒，對乙腦病毒P3株適應(yīng)的高密度Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒感染，根據(jù)乙腦病毒P3株在Vero細(xì)胞上的增殖情況，待細(xì)胞病變達(dá)一定程度后收獲病毒液，使傳統(tǒng)病毒含量從105_6PFU/ml提高到107_8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。將收獲的病毒液滅活后，加入佐劑定量分裝即可獲得高質(zhì)量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。另外，與傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明改進(jìn)了培養(yǎng)系統(tǒng)的氧傳遞方式，減少了剪切力，降低有害代謝廢物濃度。由于可模擬空間中的微重力環(huán)境，使培養(yǎng)物的重力向量在旋轉(zhuǎn)過程中產(chǎn)生隨機(jī)化，導(dǎo)致一定程度的重力降低，使細(xì)胞處于一種模擬自由落體狀態(tài)，以此模擬微重力環(huán)境。由于沒有攪拌剪切力影響，細(xì)胞可以在相對溫和的環(huán)境中進(jìn)行三維生長，同時在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。通過控制葡萄糖和谷氨酰胺濃度可控制乳酸和氨等有害代謝物的產(chǎn)生濃度，可有效控制細(xì)胞生長狀況。大規(guī)模連續(xù)灌流培養(yǎng)高密度宿主細(xì)胞，細(xì)胞密度可達(dá)7X106/ml，這種成本低、易于操作的細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)移研究方法，為實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)率的細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化工藝提供了廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明方法制得的豬乙型腦炎滅活疫苗的動物學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)購自ATCC, Cytodex-I微載體系統(tǒng)購自Amersham公司，乙腦病毒P3株購自中國藥品生物制品檢定所。實(shí)施例I乙腦病毒P3株適應(yīng)的VeiO細(xì)胞傳代擴(kuò)增培養(yǎng)將乙腦病毒M53代P3株乙型腦炎病毒種子用標(biāo)準(zhǔn)MEM培養(yǎng)基稀釋后，腦內(nèi)接種乳鼠，采集死亡小鼠腦組織，研磨制成腦組織懸液，離心，取上清制成乙型腦炎鼠腦病毒。將制備成的乙型腦炎病毒鼠腦懸液用細(xì)胞維持液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，接種長成單層的Vero細(xì)胞，在34. 0±2. (TC進(jìn)行病毒培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)75%左右時收獲病毒上清液，按照上述方法，將P3株乙型腦炎病毒在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代，測定病毒含量在107 0PFU/ml以上。表明乙腦病毒P3株對Vero細(xì)胞敏感，可以用于疫苗的生產(chǎn)。實(shí)施例2利用生物反應(yīng)器和Cytodex-I微載體系統(tǒng)進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器工作體積IOL 500L，Cytodex-I微載體系統(tǒng)使用10g/L，細(xì)胞密度由5 X IO5 遞增至Ij 5 7 X IO6。實(shí)施例3接種乙腦病毒P3株對Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒感染當(dāng)細(xì)胞長成單層時，按照接種O. 005 O. 5M. O. I進(jìn)行P3株乙腦病毒感染，根據(jù)測定培養(yǎng)基(含有5-10%牛血清的標(biāo)準(zhǔn)MEM培養(yǎng)基)中葡萄糖濃度、乳酸鹽濃度、谷氨酰胺、耗氧速率以及PH值指標(biāo)來控制；病毒培養(yǎng)溫度控制在34. O±2. 0°C，pH值為7 8，20 60轉(zhuǎn)/分，溶氧10 100%。實(shí)施例4病毒液的超濾濃縮、滅活及疫苗成品的制備接種病毒后，待細(xì)胞病變達(dá)到75%以上時收獲含有乙腦病毒的培養(yǎng)液，按
O.l-2ml/4000ml病毒液的量加入β -丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活。然后，向病毒滅活液中加入終濃度為O. 6-1. 2mg/ml氫氧化鋁膠和O. lmg/ml硫柳汞，充分搖勻，經(jīng)灌裝后即為豬乙型腦炎滅活疫苗成品。實(shí)施例5豬乙型腦炎滅活疫苗的制備
I病毒與細(xì)胞用于制備豬乙型腦炎滅活疫苗的病毒株為具有良好抗原性的乙腦病毒P3株，以對該病毒株具有良好敏感性的細(xì)胞系Vero細(xì)胞，作為制苗用細(xì)胞系，以感染并大量繁殖乙腦病毒。2毒種制備將制備疫苗用的細(xì)胞系Vero細(xì)胞接種到含5_10%新生牛血清的標(biāo)準(zhǔn)MEM培養(yǎng)基中，Cytodex I微載體濃度為10g/L，在溫度:37. 0 + 2. 0°C，pH值7-8，攪拌速度20-60轉(zhuǎn)/分條件下培養(yǎng)。待微載體上的Veix)細(xì)胞長成單層，棄去生長液，按O. 1%的比例接種基礎(chǔ)毒種，在34. 0±2. (TC條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)到75%以上收獲上清液。按照上述方法，病毒在細(xì)胞上連續(xù)傳代，測定病毒含量在107_°PFU/ml以上，表明病毒適應(yīng)Vero細(xì)胞，即完成乙腦病毒適應(yīng)Veix)細(xì)胞的傳代，可用于建立病毒基礎(chǔ)毒種和生產(chǎn)毒種。3連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)Vero細(xì)胞接種到裝有濃度為10g/L的Cytodex I微載體的IOL生物反應(yīng)器中，采用含有10%牛血清的標(biāo)準(zhǔn)MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度37. O±2. 0°C，pH值7_8，溶氧40-70%，攪拌速度20-60轉(zhuǎn)/分。連接程序控制軟件，通過計(jì)算機(jī)在線監(jiān)控。根據(jù)細(xì)胞生長情況使用含10%牛血清的標(biāo)準(zhǔn)MEM培養(yǎng)基進(jìn)行灌流培養(yǎng)。4收獲感染病毒待微載體上的VeiO細(xì)胞長成單層，棄去生長液，接種O. 5M. O. I (感染復(fù)數(shù))的生產(chǎn)用毒種，采用含有2-5%牛血清的標(biāo)準(zhǔn)MEM培養(yǎng)基，于34. O±2. (TC，pH為7_8，溶氧50-70%，攪拌速度20-60轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，連接程序控制軟件，通過計(jì)算機(jī)在線監(jiān)控。待細(xì)胞病變達(dá)到75%以上收獲病毒液。收獲液病毒含量可達(dá)107PFU/ml以上。5病毒滅活每批收獲病毒液按lml/4000ml病毒液的量加入β -丙內(nèi)酯，在4°C下滅活病毒48小時，將滅活后的病毒置于37°C水解，徹底降解β-丙內(nèi)酯。6成品配置分裝濃縮滅活后的乙腦病毒液，加入終濃度為O. 6-1. 2mg/ml氫氧化鋁膠和O. lmg/ml硫柳汞，制備成液體疫苗成品。實(shí)施例6本發(fā)明豬乙型腦炎滅活疫苗的安全性評價I.疫苗接種小鼠的安全性實(shí)驗(yàn)用體重12 14g清潔級小鼠10只，每只小鼠肌肉注射疫苗O. 5ml (含O. 5頭份)，觀察14日，接種后3日內(nèi)非特異性死亡應(yīng)不超過2只，且應(yīng)全部健活；否則，應(yīng)使用同等數(shù)量小鼠重檢I次。結(jié)果表明，上述6批疫苗接種小鼠后，小鼠未發(fā)生死亡，說明疫苗安全性良好。2.疫苗超劑量接種試驗(yàn)豬的安全性試驗(yàn)用豬乙型腦炎滅活疫苗(P3株)，對仔豬分別經(jīng)肌肉注射2倍(即2ml，含2頭份疫苗)和5倍(即5ml，含5頭份疫苗)使用劑量，觀察14日并記錄。結(jié)果表明，肌肉注射2倍和5倍劑量豬乙型腦炎滅活疫苗(P3株)，采食、體溫等無異常反應(yīng)，與空白對照組豬采食與健康狀況無明顯差異。說明此疫苗超劑量注射試驗(yàn)豬安全。實(shí)施例7本發(fā)明豬乙型腦炎滅活疫苗的動物學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)
3批疫苗豬乙型腦炎滅活疫苗按照免疫程序免疫仔豬，Iml/頭份(lml/只)后，14日開始產(chǎn)生抗體，28日抗體達(dá)到高峰，隨后下降，接種后6個月仍保持在保護(hù)性抗體水平以上。(圖I)豬乙型腦炎滅活疫苗使用丙內(nèi)酯滅活，可降低滅活劑殘留。使用鋁膠作為佐劑，可降低副反應(yīng)發(fā)生率，同時便于免疫時注射操作。該疫苗安全、有效，是目前豬用疫苗中的高端疫苗，能夠有效預(yù)防豬乙型腦炎病毒的感染。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用生物反應(yīng)器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，其特征在于，其是利用生物反應(yīng)器和Cytodex-I微載體系統(tǒng)，用乙腦病毒P3株對連續(xù)灌流式培養(yǎng)的密度為I 7 X IO6/ml的乙腦病毒P3株適應(yīng)的VeiO細(xì)胞進(jìn)行病毒感染，培養(yǎng)條件為34±2°C，pH值7 8，待細(xì)胞病變達(dá)到75%以上時，收獲含有乙腦病毒的培養(yǎng)液，然后對收獲的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行病毒滅活。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，乙腦病毒P3株對Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒感染的接種比例為O. 005 O. 5M. O. I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，病毒滅活使用的是β_丙內(nèi)酯，使用量為β-丙內(nèi)酯病毒液(V : V) = O. 1-2 4000。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，β-丙內(nèi)酯病毒液(V: V) = I : 4000。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，其還包括向病毒滅活液中加入氫氧化鋁膠和硫柳汞。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，氫氧化鋁膠和硫柳汞的終濃度分別為.O. 6-1. 2mg/ml 和 O. lmg/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用生物反應(yīng)器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，其是利用生物反應(yīng)器和Cytodex-1微載體系統(tǒng)，用抗原性好的P3株乙腦病毒，對乙腦病毒P3株適應(yīng)的高密度Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒感染，根據(jù)乙腦病毒P3株在Vero細(xì)胞上的增殖情況，待細(xì)胞病變達(dá)一定程度后收獲病毒液，使傳統(tǒng)病毒滴度從105-6PFU/ml提高到107-8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。將收獲的病毒液滅活后，加入佐劑定量分裝即可獲得高質(zhì)量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。
文檔編號A61P31/14GK102949715SQ20111024951
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者岳雷, 郭鑫, 陳靜, 李淑芬, 韓中山, 張振山 申請人:唐山怡安生物工程有限公司