專利名稱：一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法及用途，具體涉及從懷菊花全形花中提取總黃酮有效部位的方法及其有效部位在制備治療或預防過敏性鼻炎、皮炎及哮喘等過敏性疾病的藥物中的應用。
背景技術：
現在生活節(jié)奏加快、工作壓力和精神壓力的增加使人們易疲勞、體質下降、易患多種季節(jié)性流行疾病。由于全球氣候變暖，使得空氣中花粉數有所增加。這些都使人們容易受到過敏原的困擾，導致支氣管炎、過敏性鼻炎、花粉癥等過敏性疾病的發(fā)病率逐年上升，對人們的健康造成了威脅，也影響人們的工作和生活。在美國，每一百人當中就有兩個以上的人患花粉癥，而日本有超過10%的人在每年4-6月深受花粉癥困擾，我國發(fā)病率為0. 5-1%， 并表現出逐年上升的趨勢。同時，隨著工業(yè)化生產的加劇和汽車數量的增加，使大氣污染更加嚴重，空氣中粉塵和有害物質增多也加重了過敏反應的誘因，如汽車尾氣中汽油燃燒的氣體粒子能刺激機體分泌IgE增加，會增強機體再受刺激時的過敏反應。由于有機物燃燒釋放的硫氧化物、氮氧化物和亞硫酸等氣體能損傷呼吸道粘膜，加重過敏癥狀。室內裝修使用材料釋放的揮發(fā)性有機污染物可引起化學污染，空氣不流通所蓄積的懸浮顆粒、塵螨、霉菌、細菌、孢子等都是可刺激機體的變應原。研究人員對1996-2003年在廣州醫(yī)院就診的過敏性疾病患者血清中特異性IgE進行研究，結果表明嬰幼兒以牛奶、雞蛋白為主要致敏原，塵螨的陽性反應率僅次。隨著年齡的增長，過敏性疾病主要致敏原是吸入性抗原，以屋塵螨、粉塵滿、屋塵等為主，中老年患者對飛蛾過敏或寄生蟲更加敏感。鐘南山等對兒童哮喘及其他過敏性疾病進行國際間對比研究，結果表明廣州市13-14歲青少年哮喘及過敏性鼻炎，濕疹患病率均較7 年前高，且以男性上升明顯。另外，吸煙和高水平的IgE都可能增加花粉過敏的誘導幾率， 建筑群的分布、人群活動密集度等因素在客觀上也會影響過敏反應發(fā)病率。根據世界衛(wèi)生組織(WHO)的數據，目前全球有2. 5億人患過敏性疾病，且該發(fā)病率迅猛上升。我國衛(wèi)生專家指出我國小兒過敏發(fā)病率有上升的趨勢，過敏性鼻炎發(fā)病率也呈上升趨勢。菊花以“鞠華”之名始載于《神農本草經》，為疏風散熱、解毒消腫、利咽明目之上品。《本草綱目》所述菊花性甘、味寒?！侗静萁浭琛贩Q其“苦可瀉熱，甘能益血，甘可解毒，平則兼辛，故也散結，苦入心，小腸，甘入脾胃，平辛走肝膽，兼入肺與大腸，苦以瀉熱，甘以宜血脈，辛平以散虛熱也”。2005年版《中國藥典》規(guī)定了中藥菊花為菊科植物菊Chiysanthemum morifolium Ramat的干燥頭狀花序。古典本草中有應用菊花治療過敏癥狀的記載，臨床研究指出菊花對眼睛紅腫和瘙癢等過敏癥的治療和防治具有一定效果。對菊花同屬植物西伯利亞菊花抗過敏活性的研究表明，其乙醇提取物對RBL-2H3肥大細胞脫顆粒反應有明顯抑制作用，對二硝基苯基化牛血清白蛋白(DNP-BSA)和compound 48/80誘導的RBL-2H3肥大細胞脫顆粒有抑制作用，還能夠抑制腫瘤壞死因子及細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK1/2的活化。菊花中多種黃酮類化合物也顯示了很強的抗過敏活性，如芹菜素、木犀草素、香葉木素、漆樹黃素和槲皮素對免疫球蛋白E介導RBL-2H3細胞產生腫瘤壞死因子a (TNF_a)和白細胞介素4 (IL-4)有抑制作用。由此可見，菊花中有抗過敏活性的成分可能是黃酮類成分。本研究室的研究表明，作為藥用菊花代表的懷菊花具有顯著地抗過敏活性，并且也對懷菊花有機酸成分群和總黃酮有效部位抗過敏活性進行了研究，結果表明，總黃酮有效部位在抗過敏活性方面表型突出。但目前未見以菊花全形花總黃酮含量大于50%的總黃酮有效部位為主要原料治療或預防異位性皮炎、過敏性鼻炎等過敏性疾病的口服制劑上市。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供了一種從懷菊花全形花中提取總黃酮有效部位的方法，此方法易行，操作簡便，成本低廉，有效部位中黃酮成分提取率較高。在有效部位中總黃酮的含量為 50-70%。本發(fā)明的另一個目的在于提供提取的總黃酮有效部位在制備治療或預防異位性皮炎、過敏性鼻炎等過敏性疾病的藥物中的應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的
一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其提取步驟如下
a.在懷菊花中加入醇濃度為20%含水醇溶液，經熱回流、超聲提取，含水醇溶液用量為懷菊花重量的8-20倍，濾過，合并濾液，減壓回收至無醇味，得到懷菊花濃縮提取液；
b.在懷菊花濃縮提取液中加入懷菊花重量4-10倍的水或醇溶液，溶液中醇濃度為 10-30%，濾過，得濾液；
c.濾液經填充有吸附材料的吸附柱，選用的吸附材料為大孔吸附樹脂中的任一種或兩種并用；
d.洗脫前，選用體積為吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液為無色；
e.用含40%-80%的醇溶液洗脫，洗脫液用量為吸附材料的4 10倍，收集洗脫液；
f.減壓回收溶劑，至無醇味，得到洗脫液濃縮液；
g.洗脫液濃縮液經填充有吸附材料的吸附柱，選用的吸附材料為大孔吸附樹脂中的任一種或兩種并用；
h.洗脫前，選用體積為吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液為無色；
i.用含40-80%的醇溶液洗脫，洗脫液用量為吸附材料的4 10倍，收集洗脫液；
j.減壓回收溶劑，得稠膏，稠膏經干燥后得懷菊花總黃酮有效部位?？傸S酮含量為 50%-70%。經所得總黃酮有效部位的干膏采用常規(guī)粉碎或固體分散技術或超微粉碎，得不同粒徑粉末。本發(fā)明中的懷菊花優(yōu)選其全形花。 所述的醇溶液中所用的醇優(yōu)選為乙醇或甲醇中的一種。所述大孔樹脂的型號為 AB-8、SP-70、DlOl、DM-130, S_8、D3520、D4020、HP-20 其中的一種。
本發(fā)明中所制備的懷菊花全形花總黃酮有效部位，加入適量的輔料或基質(如淀粉、糊精、微晶纖維素、乳糖、低取代羥丙纖維素、辛基十二烷醇、甘露醇等)，制備成用于治療或預防異位性皮炎、過敏性鼻炎等過敏性疾病的口服制劑，包括片劑(素片、糖衣片、薄膜衣片、分散片)、膠囊劑(硬膠囊、軟膠囊)、顆粒劑和滴丸。本發(fā)明所制備的總黃酮有效部位的藥效學研究
1、懷菊花提取物及各濃度大孔樹脂洗脫部分對RBL-2H3細胞脫顆粒的抑制作用大鼠嗜堿粒細胞性白血病2H3細胞(RBL-2H3)細胞是NIDR于1978年從Wistar大鼠嗜堿性粒細胞瘤中分離和克隆出來的嗜堿性白血病細胞。這些細胞具有高親和力的IgE受體。通過聚集這些受體或與鈣離子載體作用下可以激活他們分泌組胺及其他遞質。這株細胞廣泛應用于研究Fc ε RI和肥大細胞分泌的生化途徑。RBL-2H3細胞具有可繼代培養(yǎng)，生長快速等特點，是研究速發(fā)型過敏反應的主要細胞系。a、RBL-2H3細胞的培養(yǎng)
RBL-2H3細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，用含質量分數10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(含青霉素1000 KU · L—1和鏈霉素100 mg · L—1)混勻，在37°C、體積分數為5% CO2的條件下傳代培養(yǎng)，2-3天換一次液。取處于對數生長期狀態(tài)良好的RBL-2H3細胞，棄去上清液，用PBS 輕輕洗去殘余細胞上清液后，加入適量的0. 02% EDTA和0. 25%胰酶消化2-3 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻。1000 rpm離心5 min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，計數。b、懷菊提取物及不同洗脫流份抑制RBL-2H3細胞脫顆粒反應活性部位篩選取生長狀態(tài)良好的RBL-2H3細胞，以2X IO8化―1密度接種在M孔板上，每孔400 μ L，
分成6組正常細胞組、模型對照組、供試樣品不同劑量組和全部釋放組，每組設4個平行孔。在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)1 h后，加經MEM培養(yǎng)基稀釋的IgE抗體40 μ L(終濃度 0.45 mg/L)，培養(yǎng)M h，使細胞致敏。然后用Siraganian細胞培養(yǎng)液(在約900 mL超純水中溶解如下試劑119 mM NaCl，5 mM KCl, 0. 4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 5. 6 mM glucose, 1 mM CaCl2,0. 1% BSA，40 mM NaOH，最后用1 M NaOH溶液調節(jié)pH為7. 2，加超純水至1 L，過濾)清洗細胞2次，洗液全部吸凈后，加入Siraganian培養(yǎng)液160 yL，37°C培養(yǎng)10 min后， 再加供試樣品溶液20 μ L (DMS0終濃度均小于0. 1%)，正常細胞組、模型對照組和全部釋放組中加等體積1% DMSO/Siraganian細胞培養(yǎng)液(v/v)，37°C培養(yǎng)10 min，最后向模型對照組和樣品組中加溶解DNP-BSA抗原的Siraganian細胞培養(yǎng)液20 μ L (終濃度為10 mg/ L),正常細胞組和全部釋放組加等體積的Siraganian細胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)10 min后，將M孔板置于冰浴中10 min終止反應。平行吸取各孔上清液(全部釋放組使用前經超聲破碎)兩份，各50 μ L，轉移至96 孔板中，一份加入溶解1 mM PNAG的枸櫞酸緩沖液50 μ L (0. 1 Μ,ρΗ 4. 5)，另一份加等體積枸櫞酸溶液作空白對照，37°C培養(yǎng)1 h后，加碳酸鈉緩沖液200 μ L (0.1 Μ, pH 10.0)， 室溫放置10 min，于酶聯(lián)免疫檢測儀405 nm下測定各孔光密度。計算對A -己糖胺酶活性抑制率，結果見表一。結果懷菊花75%乙醇提取物對抗原刺激RBL-2H3細胞脫顆粒反應具有一定抑制作用，IC5tl值為63 yg/mL。大孔樹脂60%和95%乙醇洗脫流分中主要成分為黃酮類，它們的IC5tl值分別為6. 8 μ g/mL和16 μ g/mL,與75%乙醇提取物比較，力價分別提高了約10倍和4倍，60%乙醇洗脫流分活性較強。30%乙醇洗脫流分中主要成分為有機酸，其在終濃度100 μ g/mL時仍未表現出抑制作用。因此，富含黃酮類成分的大孔樹脂60%和95%乙醇洗脫流分是懷菊提取物抗過敏活性部位。 表一懷菊花不同洗脫部分對RBL-2H3細胞釋放β ~己糖胺酶的抑制作用
權利要求
1. 一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其特征是其提取步驟如下a.在懷菊花中加入醇濃度為20%含水醇溶液，經熱回流、超聲提取，含水醇溶液用量為懷菊花重量的8-20倍，濾過，合并濾液，減壓回收至無醇味，得到懷菊花濃縮提取液；b.在懷菊花濃縮提取液中加入懷菊花重量4-10倍的水或醇溶液，溶液中醇濃度為 10-30%，濾過，得濾液；c.濾液經填充有吸附材料的吸附柱，選用的吸附材料為大孔吸附樹脂中的任一種或兩種并用；d.洗脫前，選用體積為吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液為無色；e.用含40%-80%的醇溶液洗脫，洗脫液用量為吸附材料的4 10倍，收集洗脫液；f.減壓回收溶劑，至無醇味，得到洗脫液濃縮液；g.洗脫液濃縮液經填充有吸附材料的吸附柱，選用的吸附材料為大孔吸附樹脂中的任一種或兩種并用；h.洗脫前，選用體積為吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液為無色；i.用含40-80%的醇溶液洗脫，洗脫液用量為吸附材料的4 10倍，收集洗脫液；j.減壓回收溶劑，得稠膏，稠膏經干燥后得懷菊花總黃酮有效部位。
2.根據權利要求1所述的一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其特征在于， 所述的懷菊花為其全形花。
3.根據權利要求1所述的一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其特征是所述的醇溶液中所用的醇為乙醇或甲醇中的一種。
4.根據權利要求1所述的一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其特征是所述大孔樹脂的型號為 SP-70、D101、AB-8、DM-130、S-8、D3520、D4020、HP-20 中的一種。
5.根據權利要求1所述的一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其特征是所制備的總黃酮有效部位中總黃酮含量為50 70%。
6.根據權利要求1所述的一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法，其特征是提取的總黃酮有效部位可以與藥學上可接受的載體或賦形劑結合制成片劑、膠囊、滴丸或顆粒劑。
7.權利要求1所述的懷菊花總黃酮有效部位在制備治療或預防過敏性鼻炎、異位性皮炎及哮喘等過敏性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及一種從懷菊花中提取總黃酮有效部位的方法及用途。本發(fā)明通過提取、過濾、吸附、濃縮、再吸附等步驟制備有效部位，該方法不用有毒的有機溶劑，不污染環(huán)境，是在常規(guī)含水溶媒提取方法的基礎上，采用了吸附材料的吸附分離技術，耗時少，效率高，提取工藝簡單，成本低廉，可進行產業(yè)化生產，并達到了環(huán)保的要求。本發(fā)明提取的總黃酮有效部位在制備治療或預防異位性皮炎、過敏性鼻炎等過敏性疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61K36/287GK102293806SQ20111025800
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權日2011年9月2日
發(fā)明者張琳, 王巖, 王瑞杰, 袁丹, 謝媛媛 申請人:沈陽藥科大學