專利名稱：狗肝菜多糖的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種狗肝菜多糖的制備方法及其在制備治療肝損傷藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝損傷是肝臟受到外界因素的入侵，從而引起的肝臟受損。肝炎病毒會導(dǎo)致肝臟的損傷，但不是所有的肝損傷就一定是肝炎。肝損傷主要有暴力性肝損傷、病理性肝損傷、 化學(xué)性肝損傷等原因所致。暴力性肝損傷表現(xiàn)病癥明顯快速嚴(yán)重；病理性肝損傷和化學(xué)性肝損傷比較常見，但病理性和化學(xué)性肝損傷發(fā)展較為緩慢。因病原體、化學(xué)藥物或過量飲酒等因素導(dǎo)致的肝損傷患者越來越多，在我國目前所屬肝損傷患者已逾千萬，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在干預(yù)肝損傷的治療方面并無特異性藥物。肝損傷的臨床治療中，一般采用綜合治療法，即保肝藥物、抗病毒藥及免疫增強(qiáng)劑通常配合治療，保肝藥物著重于肝臟的恢復(fù)，抗病毒藥、免疫增強(qiáng)劑著重于清除體內(nèi)的病毒。目前真正有效的抗病毒藥寥寥無幾，象拉米呋啶、泛昔洛韋等世界上剛剛上市的抗乙肝病毒藥物，也無法完全抑制病毒。目前公認(rèn)的抗乙肝病毒有效的免疫增強(qiáng)劑為干擾素，但也無法克服病毒的反跳問題。因此在病毒性肝炎的治療技術(shù)領(lǐng)域中，抗病毒藥、免疫增強(qiáng)劑及保肝藥的研究都十分重要，在甲肝或毒物損傷性肝炎的治療中尤其需要保肝藥物，保肝藥物市場巨大。狗肝菜，爵床科(Acanthaceae)植物狗肝菜Dicliptera chinensis (L.) Juss.，具有清熱解毒、涼血、生津、利尿作用的功效，用于肝損傷、熱病斑疹、便血、溺血、小便不利、腫毒疔瘡等，主要含有機(jī)酸、糖類、氨基酸成分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，狗肝菜多糖具有保肝作用，但現(xiàn)有技術(shù)研究報道基本集中在狗肝菜粗多糖的研究，由于狗肝菜粗多糖成分復(fù)雜，含量較低，而且多糖結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系尚不清楚，多糖的體內(nèi)過程、作用機(jī)制未知，質(zhì)量難以控制， 造成藥效重復(fù)性差，難以進(jìn)入國際市場。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有狗肝菜應(yīng)用的技術(shù)不足，提供一種狗肝菜不同分子量多糖的應(yīng)用。提供一種狗肝菜多糖的制備方法，包括以下步驟(1)將狗肝菜全草脫脂、除雜后用水提取得水提取物；水提取物去除蛋白質(zhì)后經(jīng)醇沉獲得狗肝菜總多糖；所述脫脂的方法和工藝條件是采用有機(jī)溶劑回流提取脫脂的方法；其中有機(jī)溶劑可以是石油醚、乙醚等，優(yōu)選石油醚，用量按照藥材體積來確定(能浸泡藥材即可)。所述除雜是采用無水乙醇或體積比濃度為95%的乙醇，乙醇用量優(yōu)選按照與藥材體積比為11確定；
3
脫脂除雜后用水提取，水的用量按照脫脂、除雜后的狗肝菜全草質(zhì)量水(體積) 為 Ig 5 20mL ；所述水提取物去除蛋白質(zhì)的方法和工藝條件參照本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)。所述醇沉是采用體積比濃度為95%的乙醇，乙醇用量參照本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)。(2)取步驟(1)制備得到的狗肝菜總多糖，用水溶解，采用截流不同分子量透析袋，獲得狗肝菜不同分子量多糖組。步驟⑵采用狗肝菜總多糖lg 1 4mL的比例加水溶解狗肝菜總多糖，具體地，本發(fā)明將狗肝菜植物全草或任意部位，粉碎，脫脂，無水乙醇或體積比為 95%的乙醇回流提取1 2h進(jìn)行除雜；將經(jīng)除雜后的狗肝菜藥渣揮發(fā)盡乙醇后用適量沸水提取2次，每次1 2h，合并提取液，常規(guī)方法減壓濃縮至稠膏狀，得濃縮物；采用氯仿-正丁醇(4 1，體積比)多次萃取(參照Sevage法)將上述濃縮物除去蛋白質(zhì)，加體積比濃度為95%的乙醇使萃取液的醇含量達(dá)到80% (體積比含量)，將含醇萃取液置于4°C冰箱中醇沉8 12h ；抽濾，濾渣用無水乙醇洗滌，將洗滌后的濾渣40 60°C干燥4 6h，即得狗肝菜總多糖；取狗肝菜總多糖用水溶解，將截流分子量為6000半透膜制成透析袋，將狗肝菜總多糖水溶解液裝入透析袋中加水適量，25°C進(jìn)行透析，每次3 6h，透析3次，然后將3次透析液合并濃縮，往濃縮物中加入體積比濃度為95%乙醇使?jié)饪s物的醇含量達(dá)到80%，將含醇濃縮物置于4°C冰箱中醇沉8 12h ；抽濾，濾渣40 60°C干燥4 6h，即得分子量低于 6000狗肝菜多糖；將上述截流分子量為6000的透析袋內(nèi)剩余溶解液轉(zhuǎn)移至采用截流分子量為 10000的半透膜制成透析袋，加水適量，于25°C進(jìn)行透析，每次3 6h，透析3次，然后將3 次透析液合并濃縮，加體積比濃度為95%乙醇使?jié)饪s物的醇含量達(dá)到80%，置于4°C冰箱中醇沉8 12h ；抽濾，濾渣40 60°C干燥4 6h，即得分子量大于6000小于10000的狗肝菜多糖；將上述截流分子量為10000的透析袋內(nèi)剩余溶解液轉(zhuǎn)移至截流分子量為10000 半透膜制成透析袋，加水適量，于25°c進(jìn)行透析，每次3 6h，透析3次，將截流分子量為 10000的透析袋內(nèi)剩余的溶解液加體積比濃度為95%的乙醇使醇含量達(dá)到80%，置于4°C 冰箱中醇沉8 12h ；抽濾，濾渣40 60°C干燥4 6h，即得分子量高于10000狗肝菜多糖。本發(fā)明上述技術(shù)方案分別制備得到不同分子量的狗肝菜多糖。本發(fā)明提供了狗肝菜不同分子量多糖組在制備治療肝損傷藥物方面具有良好地應(yīng)用。本發(fā)明制備得到的狗肝菜多糖分子量小于6000多糖組、分子量6000 10000多
糖組、大于10000多糖組具有抗氧化活性，可以應(yīng)用于制備預(yù)防或減輕活性氧相關(guān)性疾病的藥物方面；各多糖給藥組大鼠血清ALT、AST活性與模型對照組比較有顯著性差異(P
<0. 01)，其中分子量小于6000組、分子量大于10000組效果顯著；分子量小于6000多糖組與總多糖組可顯著減少由于肝損傷造成的TP升高(P
<0. 05)；總多糖組與分子量小于6000多糖組可顯著增強(qiáng)由于肝損傷造成的SOD酶活性降低(P < 0. 05)；總多糖組與分子量6000 10000多糖組顯著增強(qiáng)由于肝損傷造成的GSH-Px酶活性降低(P <0.01)；各多糖給藥組大鼠肝組織MDA含量與模型對照組比較明顯降低(P < 0. 01)，其中總多糖組、分子量小于6000組與分子量大于10000組效果顯著。本發(fā)明研究總結(jié)得到，狗肝菜多糖可減少CCl4所致急性肝損傷，其中，對于肝臟指數(shù)，分子量大于10000組效果最優(yōu)(P <0.05)；對于脾臟指數(shù)，總多糖組效果最優(yōu)，但無顯著性差異；對于腎臟指數(shù)，各給藥組均無顯著差異。狗肝菜不同分子量多糖組可應(yīng)用于制備治療肝損傷的藥物方面。本發(fā)明狗肝菜不同分子量多糖組配制成目的組合物的方法是本領(lǐng)域已知的。根據(jù)不同的需要，本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)書人員可以選擇適當(dāng)?shù)奶砑游?、配制方法、劑型、單位?br> 旦雄里寺。本發(fā)明組合物是藥物組合物時，可以含有適當(dāng)?shù)乃幱觅x形劑、載體或者稀釋劑等。 可以采用制藥領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行制劑。本發(fā)明藥物組合物可以采用多種劑型，這往往取決于給藥途徑。例如，本發(fā)明不同分子量狗肝菜多糖可用于制備治療肝損傷的藥品，包括口服藥和腸胃外給藥用的制劑，如注射劑。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明克服本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有研究的思維慣性和技術(shù)局限性，經(jīng)過長期大量的實驗總結(jié)和分析，采用簡單的方法，突破性地采用按不同分子量多糖組份作為研究對象，與粗多糖相比，改善了粗多糖成分復(fù)雜、含量較低的現(xiàn)象，總結(jié)出了多糖分子量組成與功能之間的關(guān)系，有利于進(jìn)一步研究多糖的體內(nèi)過程、作用機(jī)制，便于對多糖質(zhì)量加以控制，提高狗肝菜多糖藥物的藥效重復(fù)性和質(zhì)量穩(wěn)定性。本發(fā)明所得產(chǎn)品易于溶解，同時保留了狗肝菜多糖的保肝生理活性，可以更為廣泛地應(yīng)用于藥物、保健品、或者飲料等的生產(chǎn)。本發(fā)明采用膜分離技術(shù)，顯著簡化制備工藝，步驟簡單，原料易得，降低制備成本。


圖1分子量小于6000多糖組實驗肝臟病理變化，H. E.染色，X 400圖2分子量大于10000多糖組實驗肝臟病理變化，H. E.染色，X 400圖3聯(lián)苯雙脂組實驗肝臟病理變化，H. E.染色，X 400圖4空白組實驗肝臟病理變化，H. E.染色，X 400圖5狗肝菜總多糖透析操作示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明實施例采用的試劑和材料均為常規(guī)市購，采用的方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法。實施例1稱取干燥的狗肝菜全草粗粉1kg，加入適量石油醚脫脂，無水乙醇除雜，各回流提取2小時。藥渣揮盡乙醇后沸水提取2次，每次2小時，合并提取液，濃縮至800mL，氯仿-正丁醇(4 1，體積比)多次萃取(參照Sevage法)，除去蛋白質(zhì)，加體積比濃度為95%的乙醇使醇含量達(dá)到80% (體積比濃度)，于4°C冰箱中醇沉12小時。抽濾，濾渣用無水乙醇洗滌，并經(jīng)50°C真空干燥4小時，即得狗肝菜總多糖，得率9%左右。取狗肝菜總多糖70g，用150mL純化水溶解，將截流分子量為6000半透膜制成透析袋，將溶解液裝入透析袋中加IOOOmL純化水25°C進(jìn)行透析，每次3小時，透析3次，然后將三次透析液合并濃縮至300mL，加95% (體積比濃度，下同)乙醇使醇含量達(dá)到80%，于 4°C冰箱中醇沉12h。抽濾，濾渣經(jīng)50°C真空干燥4h，即得分子量低于6000狗肝菜多糖，得率為總多糖質(zhì)量的48%。將透析袋內(nèi)剩余溶解液轉(zhuǎn)移至截流分子量為10000半透膜制成透析袋，加IOOOmL 純化水25°C進(jìn)行透析，每次3h，透析3次，然后將三次透析液合并濃縮至300mL，加95%乙醇使醇含量達(dá)到80%，于4°C冰箱中醇沉12h。抽濾，濾渣經(jīng)50°C真空干燥4h，即得分子量高于6000低于10000的狗肝菜多糖，得率為總多糖質(zhì)量的15%。將截流分子量為10000的透析袋內(nèi)剩余的溶解液加95%乙醇使醇含量達(dá)到80%， 于4°C冰箱中醇沉12h。抽濾，濾渣經(jīng)50°C真空干燥4h，即得分子量高于10000狗肝菜多糖， 得率為總多糖質(zhì)量的34%。實施例2本發(fā)明狗肝菜不同分子量多糖組的應(yīng)用實驗雄性SD大鼠(220士20g)，由廣東省實驗動物中心提供(合格證號SCXK粵 2008-0002)。大鼠隨機(jī)分為7組(每組10只)，保持12小時晝夜節(jié)律，控制濕度和空氣流通，自由飲水?dāng)z食，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7d。取70只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成7組，每組10只，分別為正常對照組、肝損傷模型組、聯(lián)苯雙酯組、狗肝菜總多糖組、分子量小于6000狗肝菜多糖組、分子量6000 10000狗肝菜多糖組和分子量大于10000狗肝菜多糖組。正常對照組和模型組每天灌胃給予注射用水，受試藥和陽性對照組的動物每天根據(jù)劑量灌胃給藥，劑量聯(lián)苯三酯150mg/kg ；分子量< 6000 組:500mg/kg ；分子量 6000 10000 組:150mg/kg ；分子量> 10000 組:300mg/ kg。在給藥的第7天，除正常對照組外，其余各組動物均灌胃0.1% CCl4花生油(O.OlmL/ g)，禁食不禁水16h，全部大鼠麻醉后腹主動脈取血，3000轉(zhuǎn)離心15min，分離出血清，-20°C 保存至分析ALT、AST、TP生化指標(biāo)。采血后迅速取出肝臟、腎臟、脾臟，用冰冷的鹽水立即刪除盡可能多的血，稱重，計算絕對和相對臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器重量/體重(mg/g))，并在同一肝小葉上取1. OOg肝組織勻漿，離心，取上清液，-20°C保存至分析。同時取同一肝小葉上取一小塊做病理組織檢查。實驗結(jié)果見表1所示表1狗肝菜多糖對血清ALT、AST及TP水平的影響(η = 10)分組
空白組
模型組
陽性組(聯(lián)苯雙酯滴丸) 總多糖組分子量<6000組分子量 6000-10000 組
分子量>10000組
ALT (μ/L) 25.39±3.41 244.43±21.89a 52.31±8.01 c
85.02±9.78 ce 78.84±9.14ce 201.36±26.17ce
146.63±16.99ce
AST (μ/L) 72.21±8.67 393.72±52.28 a 183.18±25.64c
192.43±24.01 c 178.14±24.04c 243.73±37.54ce
216.35±30.30cf
TP(g/L) 89.13±10.93 101.01±10.34 90.84±10.48 d
91.45±10.69d 85.55±11.46c 94.47±7.37
92.36±9.62
bρ值a ρ < 0.01，模型組與空白組比較；b ρ < 0. 05，模型組與空白組比較；c ρ < 0. 01，模型組與陽性藥及給藥組比較；d ρ < 0. 05，模型組與陽性藥及給藥組比較；e ρ < 0. 01，各組多糖組與陽性藥組比較；f ρ < 0. 05各組多糖組與陽性藥組比較表1所示的實驗結(jié)果表明，肝損傷模型組與空白對照組比較差異顯著，說明本實驗?zāi)Ｐ统晒?。與模型組相比較，陽性對照組能非常明顯的抑制ALT、AST活性(P < 0. 01)， 顯著減少由于肝損傷造成的TP升高(P < 0. 05)。各多糖給藥組大鼠血清ALT、AST活性與模型對照組比較明顯降低，相比較均有顯著性差異(P < 0. 01)，說明狗肝菜多糖各部位均可抑制四氯化碳所致急性肝損傷大鼠血清中ALT、AST活性的升高，其中分子量< 6000多糖組效果最顯著，其效果接近陽性藥物聯(lián)苯雙酯滴丸，比總多糖效果好。各組對于肝損傷大鼠血清總蛋白TP的影響不盡相同。其中分子量< 6000多糖組與總多糖組可顯著減少由于肝損傷造成的TP升高，且分子量< 6000多糖組效果(P < 0. 01)優(yōu)于總多糖組(P < 0. 05)及陽性藥物組(P < 0. 05)。雖然效果不顯著，分子量 6000 10000多糖組與分子量> 10000多糖組也可減少由于肝損傷造成的TP升高。實施例3本發(fā)明狗肝菜不同分子量多糖組的應(yīng)用實驗實驗方法同實施例2。實驗結(jié)果見表2所示表2狗肝菜多糖各部位對肝組織酶的影響(η = 10)
權(quán)利要求
1.狗肝菜多糖在制備治療保肝藥物方面的應(yīng)用，其特征在于是將分子量小于6000多糖組與總多糖組應(yīng)用于制備肝損傷造成的TP升高和/或SOD酶活性降低癥的藥物或保健品方面。
2.狗肝菜多糖在制備保肝藥物方面的應(yīng)用，其特征在于是將分子量6000 10000多糖組與總多糖組應(yīng)用于制備肝損傷造成的GSH-Px酶活性降低癥的藥物或保健品方面。
3.狗肝菜多糖在制備保肝藥物方面的應(yīng)用，其特征在于是將總多糖組、分子量小于 6000組與分子量大于10000組分子量6000 10000多糖組應(yīng)用于制備抑制MDA活性的藥物或保健品方面。
4.狗肝菜多糖在制備保肝藥物方面的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備治療014所致急性肝損傷藥物方面。
5.狗肝菜多糖在預(yù)防或減輕活性氧相關(guān)性疾病的藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種狗肝菜多糖的應(yīng)用。本發(fā)明研究總結(jié)了不同分子量多糖的保肝降酶活性，具體包括將分子量小于6000多糖組與總多糖組應(yīng)用于制備肝損傷造成的TP升高和/或SOD酶活性降低癥的藥物或保健品方面；將分子量6000～10000多糖組與總多糖組應(yīng)用于制備肝損傷造成的GSH-Px酶活性降低癥的藥物或保健品方面，等等。本發(fā)明改善了粗多糖成分復(fù)雜、含量較低的現(xiàn)象，總結(jié)出了多糖分子量組成與功能之間的關(guān)系，狗肝菜多糖可應(yīng)用于制備保肝降酶藥物方面。本發(fā)明所得產(chǎn)品易于溶解，同時保留了狗肝菜多糖的保肝生理活性，且得率高、含量高，制備成本低。
文檔編號A61K31/715GK102283859SQ20111026420
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者尹永芹, 崔紅花, 張鑫, 沈志濱, 陳艷芬 申請人:廣東藥學(xué)院