專(zhuān)利名稱(chēng)：小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地涉及小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發(fā)明還涉及所述疫苗的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用我國(guó)自行培育并得到廣泛應(yīng)用的GPV弱毒株，分別構(gòu)建了表達(dá)PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，分別命名為 GPV-PPRV-F (CGMCC No. 2621)和GPV-PPRV-H(CGMCC No.洸19)，并對(duì)其免疫效力進(jìn)行了初步評(píng)估。
背景技術(shù)：
小反當(dāng)獸疫(Peste des petits of ruminants, PPR)禾口山羊痕(Goat pox, GP) 為分別由小反當(dāng)獸疫病毒(peste des petits of ruminants virus, PPRV)禾口山羊痕病毒 (Goat pox virus，GPV)引起的危害山羊、綿羊等小反芻動(dòng)物的兩種重大疫病，均為OIE發(fā)布 A類(lèi)烈性傳染病。PI3R長(zhǎng)期以來(lái)一直在非洲、中東、中亞、南亞及東南亞地區(qū)危害流行，2007 年傳入我國(guó)西部邊境地區(qū)，導(dǎo)致局部疫情，對(duì)我國(guó)的畜牧養(yǎng)殖業(yè)形成嚴(yán)重威脅。GP多年來(lái)在我國(guó)局部地區(qū)表現(xiàn)為地方流行性，給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成一定危害。我國(guó)山羊和綿羊的飼養(yǎng)量數(shù)以億計(jì)，PI3R和GP這兩種烈性傳染病的防控意義重大。PPRV屬副粘病毒科麻疹病毒屬成員，與牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)同屬， 基因組進(jìn)化與抗原性關(guān)系密切，具有共同的中和抗體表位。病毒囊膜表面的融合蛋白(F) 和血凝素蛋白(H)為PPRV誘導(dǎo)中和抗體形成的主要免疫原。GPV為正痘病毒科GPTV屬成員。GPV弱毒疫苗預(yù)防GP安全有效。采用GP弱毒疫苗為載體構(gòu)建PPR-GP重組二聯(lián)活疫苗，可同時(shí)預(yù)防GP、綿羊痘和PPR，實(shí)現(xiàn)一種活毒疫苗預(yù)防多種烈性傳染病，具有極為突出的優(yōu)點(diǎn)。山羊痘病毒基因組龐大，遺傳穩(wěn)定，其胸苷激酶(TK)基因編碼區(qū)為復(fù)制非必需區(qū)，可允許大容量的外源基因插入和表達(dá)；GPV感染宿主譜狹窄，僅局限于牛羊等反芻獸； GP弱毒疫苗生產(chǎn)成本低廉，儲(chǔ)運(yùn)無(wú)需冷凍、使用方便；尤其重要的，利用重組表達(dá)除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白為抗原，小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗免疫反應(yīng)可以很方便地與PPRV野毒感染相區(qū)別，不干擾血清學(xué)監(jiān)測(cè)，克服了現(xiàn)有PI3R弱毒疫苗的重大缺陷，對(duì)我國(guó)廣大內(nèi)地非疫區(qū)極為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發(fā)明利用我國(guó)自行培育并得到廣泛應(yīng)用的GPV弱毒株，分別構(gòu)建了表達(dá)PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，分別命名為GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H，分別于2008年7月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)北京朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏登記號(hào)分別為CGMCC No. 2621和沈19，并對(duì)其免疫效力進(jìn)行了初步評(píng)估。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述疫苗的制備方法。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了本發(fā)明的小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗的制備方法，其包括下述步驟(1)采用適當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^(guò)常規(guī)RT-PCR從PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/l) 的基因組RNA分別擴(kuò)增基因PPRV血凝素蛋白H基因和PPRV融合蛋白F基因；(2)通過(guò)基因重組技術(shù)，分別構(gòu)建表達(dá)PPRV融合蛋白F的pTK-gig-PPRV-F重組載體和表達(dá)PPRV血凝素蛋白H的pTK-gig-PPRV-H重組載體；(3)將步驟( 中的重組載體分別轉(zhuǎn)染感染了 GPV病毒液的細(xì)胞，通過(guò)在熒光倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)綠色熒光而判斷轉(zhuǎn)染是否成功，轉(zhuǎn)染成功后，表達(dá)PPRV-F和H蛋白的重組病毒載體與GPV病毒基因組的同源基因發(fā)生了同源重組，然后利用gpt和eGFP純化篩選重組病毒克隆；和(4)鑒定已經(jīng)純化的重組山羊痘病毒DNA，分別命名為GPV-PPRV-F和 GPV-PPRV-H ；其中步驟(3)中所用的細(xì)胞是原代山羊睪丸細(xì)胞，即LT細(xì)胞。按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，利用本發(fā)明獲得的重組病毒GPV-PPRV-H和 GPV-PPRV-F,以及陰性對(duì)照GPV感染初代LT細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察到感染本發(fā)明的重組病毒的LT細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生綠色熒光(圖幻。進(jìn)一步以鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白高免血清為一抗，以紅色熒光素(TRITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果重組病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分別顯示特異的紅色免疫熒光(圖6B和6C)， 而野生型GPV則表現(xiàn)為紅色熒光陰性反應(yīng)(圖6A)。本發(fā)明的重組病毒的這種特異性免疫熒光反應(yīng)為重組病毒的克隆純化、傳代生產(chǎn)過(guò)程中遺傳穩(wěn)定性觀察等提供了極大的便利。按照本發(fā)明的其它實(shí)施方案，用本發(fā)明的重組病毒免疫山羊，免疫后每天觀察注射部位的反應(yīng)和精神狀態(tài)并測(cè)量體溫。首次免疫后觀天用相同劑量途徑進(jìn)行二次免疫。 分別于首次免疫前及免疫后第21天和第觀天，二次免疫后第7天、14天及觀天采集靜脈血，分離血清，56°C 30分鐘滅活，_20°C凍存，用于血清GPV及PPRV特異中和抗體滴度的檢測(cè)。由于中和抗體反應(yīng)能夠較為客觀地反映弱毒疫苗的免疫保護(hù)效果，我們研制的重組山羊痘病毒候選疫苗株能夠誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，從而能夠參照PPRV弱毒疫苗的辦法， 直接采用中和抗體檢測(cè)進(jìn)行重組痘病毒免疫效力評(píng)估，確保該重組疫苗在未來(lái)疫苗生產(chǎn)質(zhì)量控制及現(xiàn)地生產(chǎn)應(yīng)用評(píng)估中具有充分的技術(shù)可行性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗可以用于同時(shí)預(yù)防或治療GP、綿羊痘和PPR，可以同時(shí)使用表達(dá)H和F蛋白的重組痘病毒進(jìn)行聯(lián)合免疫。本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗主要用于小反芻獸類(lèi)動(dòng)物，包括牛、羊等。此外，本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗還可以用于制備用于預(yù)防或治療GP、 綿羊痘和PI3R的試劑盒。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防或治療GP、綿羊痘和Pra的試劑盒，其包括本發(fā)明所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，山羊痘病毒疫苗株(CVCC AV41)是由我國(guó)分離馴化的，符合中國(guó)的痘病毒流行情況，能夠提供針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的痘病毒更有效的免疫保護(hù)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)F蛋白的重組GPV和表達(dá)H蛋白的重組GPV均誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，特別地，單次免疫后2周均能誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)；并且，表達(dá)H和F蛋白的重組痘病毒聯(lián)合免疫，能誘導(dǎo)更加顯著的、同時(shí)針對(duì)H和F抗原表面多種中和表位的中和抗體，因而提高更加全面、持續(xù)的免疫保護(hù)，這一點(diǎn)在針對(duì)存在一定程度基因變異的流行野毒株時(shí)，更有意義。本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的免疫原基因H或F仍采用 P7. 5強(qiáng)啟動(dòng)子，但gpt則采用相對(duì)較弱的痘病毒晚期啟動(dòng)子pll，這樣雖然有可能增加重組病毒篩選的難度，但更加有利于目的抗原基因的表達(dá)，因而誘導(dǎo)更加顯著的中和抗體反應(yīng)， 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了我們這種構(gòu)建策略在免疫效果上的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)IRES序列串聯(lián)作用，pll啟動(dòng)子同時(shí)轉(zhuǎn)錄表達(dá)gpt 和綠色熒光報(bào)告基因eGFP (二者都是篩選基因)，重組病毒帶有綠色熒光標(biāo)簽，使得重組病毒的克隆純化、傳代生產(chǎn)過(guò)程中遺傳穩(wěn)定性觀察、毒價(jià)滴定等變得極為方便、快捷，從而克服了 GPV弱毒免疫株在LT細(xì)胞上本身病變出現(xiàn)較慢，重組病毒在TK缺失后細(xì)胞病變效應(yīng)進(jìn)一步較削弱，以及野生型病毒與重組型病毒難以分離純化的缺點(diǎn)。尤其重要的，利用重組表達(dá)除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白為抗原來(lái)檢測(cè) PPRV野毒感染動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體，小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗免疫反應(yīng)可以很方便地與PPRV野毒感染相區(qū)別，不干擾血清學(xué)監(jiān)測(cè)，克服了現(xiàn)有PI^R弱毒疫苗的重大缺陷， 對(duì)我國(guó)廣大內(nèi)地非疫區(qū)極為重要。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1.重組GPV的純化鑒定和重組GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F的H和F基因整合鑒定，其中，圖IA 重組GPV的純化鑒定，M. DL2000標(biāo)記；P. GPV ；F. GPV-F ；H. GPV-H ；圖IB 重組GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F的H和F基因整合鑒定，M. DL2000標(biāo)記；1. GPV+F基因的鑒定引物；2.GPV-PPRV-F+F基因的鑒定引物；3. GPV+H基因的鑒定引物；4. GPV-PPRV-H+H基因的鑒定引物。圖2.表達(dá)綠色熒光蛋白重組GPV構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒pTK-gpt-ireS-egfp。2A，質(zhì)粒圖譜；2B，質(zhì)粒序列(SEQ ID No. 1)，其中正常印刷體:psp72骨架；單直線下劃線:tk_L tk左同源壁；波浪下劃線tk-R tk右同源壁；陰影ires-egfp基因；方框gpt基因；陰影加虛線下劃線P7. 5啟動(dòng)子；陰影加單直線下劃線pll啟動(dòng)子；雙下劃線=PstI ；斜體加雙下劃線SalI ；斜體加方框JbaI ；斜體加單直線下劃線Ec0RI。圖3.用于表達(dá)PPRV H基因重組GPV構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒pTk-gig-PPRV_H。3A，質(zhì)粒圖譜；3B，質(zhì)粒序列(SEQ ID No. 2)，其中正常印刷體:psp72骨架；單直線下劃線:tk_L tk左同源壁；波浪下劃線tk-R tk右同源壁；陰影ires-egfp基因；方框gpt基因；陰影加虛線下劃線P7. 5啟動(dòng)子；陰影加單直線下劃線pll啟動(dòng)子；雙下劃線=PstI ；斜體加雙下劃線SalI ；斜體加方框JbaI ；斜體加單直線下劃線=EcoRI ；黑色粗體加下劃線PPRV 囊膜蛋白H基因ORF (SEQ ID No. 4)。
圖4.用于表達(dá)PPRV F基因重組GPV構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒pTk-gig-PPRV_F。4A，質(zhì)粒圖譜；4B，質(zhì)粒序列(SEQ ID No. 3)，其中正常印刷體:psp72骨架；單直線下劃線:tk_L tk左同源壁；波浪下劃線tk-R tk右同源壁；陰影ires-egfp基因；方框gpt基因；陰影加虛線下劃線P7. 5啟動(dòng)子；陰影加單直線下劃線pll啟動(dòng)子；雙下劃線=PstI ；斜體加雙下劃線SalI ；斜體加方框JbaI ；斜體加單直線下劃線=EcoRI ；黑色粗體加下劃線PPRV 囊膜蛋白F基因ORF (SEQ ID No. 5)。圖5.表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)的重組病毒感染LT細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下顯示自發(fā)綠色熒光。從左至右A.感染GPV的LT細(xì)胞(陰性對(duì)照)，B.感染表達(dá)PPRV H 基因及eGFP的重組GPV (GPV-PPRV-H)的LT細(xì)胞，C.感染表達(dá)PPRV F基因及eGFP的重組 GPV (GPV-PPRV-F)的 LT 細(xì)胞。 圖6.重組病毒感染LT細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。從左至右A.感染GPV的LT細(xì)胞(陰性對(duì)照)，B.表達(dá)PPRV H基因重組GPV (GPV-PPRV-H)的LT細(xì)胞，C.表達(dá)PPRV F基因重組 GPV (GPV-PPRV-F)的 LT 細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明的小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗 GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍和精神的前體下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改和改進(jìn)。1.材料與方法病毒與細(xì)胞GPV溫度敏感弱毒疫苗株(CVCC AV41)及PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/l) 均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)獸藥監(jiān)察所。原代山羊睪丸細(xì)胞(LT)采用1月齡公綿羊睪丸經(jīng)常規(guī)方法制備，與Vero細(xì)胞一樣均采用含5%胎牛血清(Hyclone)MEM(Invitrogen)培養(yǎng)或繼代；野生型或重組GPV及PPRV弱毒株的擴(kuò)增與滴定均采用含2 %胎牛血清(Hyclone) MEManvitrogen)，分別在LT細(xì)胞和Vero細(xì)胞進(jìn)行。基因擴(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建高保真pfu (Takara公司)擴(kuò)增質(zhì)粒pIRES2_egfp (質(zhì)粒來(lái)源Clontech)上 666bp 1973bp 的 ires-egfp 序列。上游弓| 物 ir-f 5 ‘ -aaactgcaggcccctctccctcc cccc-3 ‘,下游弓I 物 ir-r :5 ‘ -aaactgcagttacttgtacagctcgtc-3 ‘,均弓IAPst I 位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物克隆至pBluescript-II (質(zhì)粒來(lái)源Stratagene)的EcoRV位點(diǎn)，經(jīng)序列測(cè)定準(zhǔn)確無(wú)誤后命名為pBlue-ires-egfp。用Pst I從pBlue-ires-egfp上切下ires-egfp基因，插入pTK-gpt-gfp[1]上的I^st I位點(diǎn)，鑒定插入方向正確，命名為 pTK-gpt-ires-egfp-gfp。再用 I 切下 pTK-gpt-ires-egfp-gfp 上的一個(gè) GFP 后使其自連，構(gòu)建成 pTK-gpt-ires-egfp (圖 2)。用PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/l)接種Vero細(xì)胞上清，經(jīng) Trizol (Invitrogen)處理提取PPRV基因組RNA，采用上、下游引物PPRV-Hf 5 ‘ -GGTTTAAACGCCGCCACCATGTCCGCACAAAG-3 ‘ 禾口 PPRV-Hr 5 ‘ -TGCGTTTAAACTCAGA CTGGATTACATG-3 ‘(上下游分別引入Rne I酶切位點(diǎn))，經(jīng)過(guò)常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增約1. 85kb的PPRV血凝素蛋白(H)基因(SEQ ID No. 4)；采用上、下游引物PPRV-Ff 5 ‘ -AT CTCGAG GCCGCCACCATGACACGGGTCGCA-3 ‘和 PPRV-Fr 5 ‘ -TA CTCGAG CTACAGTGATCTCACGT-3 ‘(上、下游引物分別引入Xho I酶切位點(diǎn))，經(jīng)過(guò)常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增約1.651Λ的PPRV融合蛋白(F)基因(SEQ ID No. 5)。同時(shí)，擴(kuò)增的H和F基因閱讀框架(ORF)(即分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5)均在起始密碼ATG前引入kozak序列 (GCCGCCACC)。將擴(kuò)增的F和H基因PCR產(chǎn)物分別克隆到pBluescript_II (Strategene)的 EcoRV位點(diǎn)，分別為pB-PPRV-F和pB-PPRV-H，序列測(cè)定無(wú)誤后，用Xho I切下pB_PPRV_F 上F基因0RF，插入到上述的pTK-gpt-ires-egfp的Ml I位點(diǎn)，鑒定正反向，命名為 pTK-gig-PPRV-F (圖4)；用Pme I切下pB-PPRV-H上H基因0RF，插入到I酶切并末端補(bǔ)平的pTK-gpt-ires-eGFP中，鑒定正反向，命名為pTK-gig-PPRV-H (圖3)。構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒所用引物的序列總結(jié)在表1中。表1.構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒所用的引物
引物名稱(chēng)引物序列作用ir-f ir-r5 '-aaactgcaggcccctctccctcccccc-3 ‘ 5'-aaactgcagttacttgtacagctcgtc-3'擴(kuò)增質(zhì)粒 pIRES2-egfp 上 666bp 的 ires-egfp 序歹丨JPPRV-Hf PPRV-Hr5'-GGTTTAAACGCCGCCACCATGTCCGC ACAAAG-3' 5’-TGCGTTTAAACTCAGACTGGATTACAT G-3'RT - PCR擴(kuò)增約 1.85kb 的 PPRV血凝素蛋白(H)基因PPRV-Ff PPRV-Fr5'-ATClCGAGGCCGCCACCATGACACGG GTCGC A-3' 5’-TACTCGAGCTACAGTGATCTCACGT-3'RT - PCR擴(kuò)增約 1.65kb 的 PPRV融合蛋白(F)基因病毒重組及重組病毒純化、鑒定將初代次LT細(xì)胞生長(zhǎng)于在35mm孔培養(yǎng)板板(Nunc)中，至密度約80 %時(shí)，按 0. 05的感染復(fù)數(shù)(M.O. I.)值接種GPV病毒液100 μ 1，感作1小時(shí)后，再采用鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)按操作說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染pTK-gig-PPR-H和pTK-gig-PPR-F，12小時(shí)后用 10% DMSO(PBS溶解，ρΗ7· 2)休克2. 5分鐘，24小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡(ZEISS，型號(hào) Axio Observer Dl ；德國(guó))下觀察是否有綠色熒光出現(xiàn)。待90 %的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變 (cytopathic effect, CPE)并出現(xiàn)綠色熒光時(shí)，收取LT細(xì)胞及培養(yǎng)上清，反復(fù)凍融三次，超聲裂解3次，每次30秒，低速離心棄去細(xì)胞碎片，上清作10倍連續(xù)梯度稀釋?zhuān)臃N初代次培養(yǎng)與35mm孔培養(yǎng)板的LT細(xì)胞，培養(yǎng)液添加霉酚酸(MPA，購(gòu)自Sigma) 25 μ g/ml,，黃嘌呤 (Xanthine, _ 自:sigma) 250 μ g/ml,，(Hypoxanthine, _ 自:sigma) 15 μ g/ml,， 37°C培養(yǎng)10天后，收獲出現(xiàn)細(xì)胞病變高稀釋倍數(shù)細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次，超聲裂解3 次，每次30秒。離心棄去細(xì)胞碎片，上清作10倍連續(xù)梯度稀釋?zhuān)^續(xù)接種35mm培養(yǎng)孔內(nèi) LT細(xì)胞，每孔100μ 1，感作1小時(shí)后覆蓋含低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)液，進(jìn)行常規(guī)病毒蝕斑純化克隆。通過(guò)連續(xù)多代次克隆純化，挑取表達(dá)綠色熒光并形成面積較大蝕斑的重組病毒克隆，接種LT細(xì)胞上擴(kuò)增，待細(xì)胞病變或綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)90%以上時(shí)，收獲接種培養(yǎng)上清液，采用SDS-蛋白酶K消化方法提取重組病毒DNA，利用分別位于TK基因同源臂兩側(cè)的特異引物，通過(guò)PCR鑒定確認(rèn)克隆病毒不含野生型GPV，已經(jīng)為純化的重組病毒。PPRV的H 基因重組病毒命名為GPV-PPRV-H，F(xiàn)基因重組病毒命名為GPV-PPRV-F。免疫熒光以最后克隆獲得重組病毒按Μ010. 05感染培養(yǎng)于M孔板的初代LT細(xì)胞，待細(xì)胞病變陽(yáng)性或綠色免疫熒光陽(yáng)性LT細(xì)胞接近50%時(shí)，棄去上清，PBST洗滌3遍。3%多聚甲醛(購(gòu)自天津科密歐)室溫下固定20分鐘，吸去固定液，PBST洗滌3遍。選取1個(gè)野生型GPV感染細(xì)胞孔和1個(gè)未感染細(xì)胞孔為對(duì)照。分別加入用PBST(含0. 胎牛血清白蛋白(購(gòu)自sigma))稀釋50倍的鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白特異單因子高免血清(本實(shí)驗(yàn)室按本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備)100 μ 1，室溫下作用30分鐘后，PBST洗滌3遍。加入以PBST按200倍稀釋紅色熒光素(TRITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma) 100 μ 1，室溫作用30 分鐘，PBST洗滌3遍，熒光倒置顯微鏡((ZEISS，型號(hào)=Axio Observer D1，德國(guó))下觀察結(jié)^ ο免疫試驗(yàn)免疫試驗(yàn)動(dòng)物選用12只0. 5 2歲的山羊，隨機(jī)分為3組并編號(hào)。其中，第一組 (1 6號(hào))接種表達(dá)H蛋白免疫原的重組山羊痘病毒，第二組(7 9號(hào))接種表達(dá)F蛋白免疫原的重組山羊痘病毒，第三組(10-12號(hào))為接種親本野生型GPV疫苗株。免疫接種方法如下，每只羊接種劑量為無(wú)血清MEM稀釋病毒液0. 5ml，含2 X IO6PFU病毒量，左右腹股溝內(nèi)側(cè)皮內(nèi)途徑各一注射點(diǎn)，每點(diǎn)注射250μ 1。免疫后每天觀察注射部位的反應(yīng)和精神狀態(tài)并測(cè)量體溫。首次免疫后觀天用相同劑量途徑進(jìn)行二次免疫。分別于首次免疫前及免疫后第21天和觀天，二次免疫后7天、14天及觀天采集靜脈血，分離血清，560C 30分鐘滅活，-20°C凍存，用于血清GPV及PPRV特異中和抗體滴度的檢測(cè)。中和抗體檢測(cè)血清GPV及PPRV特異中和抗體滴度的檢測(cè)分別采用GPV疫苗株和PPRV疫苗株， 按固定病毒量，血清連續(xù)梯度稀釋方法在96孔微量培養(yǎng)板(購(gòu)自=Corning)進(jìn)行，具體操作術(shù)式及結(jié)果判斷，按0. I. E推薦方法進(jìn)行(World Organisation for Animal Health. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals,2004)。2.結(jié)果利用gpt和eGFP作為篩選基因，通過(guò)連續(xù)多代次蝕斑克隆，選取表達(dá)eGFP陽(yáng)性噬斑克隆病毒在LT細(xì)胞上擴(kuò)增，提取重組GPV核酸DNA，利用分別位于TK基因同源臂兩側(cè)的特異引物[1]進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定TK基因，用特異擴(kuò)增PPRV-H(上游引物PPRV-Hf 5' -AAT GGC ACA GGA ATA GGC-3‘，下游引物 PPRV-Hr‘ 5' -GAG CGA CCC GTG TCA TAG-3‘)和 PPRV-F (上游引物 PPRV-Ff 5 ‘ -AGC CAG AAT GCG TTG TAT-3 ‘，下游引物 PPRV-Fr ‘ 5' -AAG CTG CCA GTG CTA TGT-3')基因的引物鑒定目的基因的插入，用野生型GPV作為對(duì)照。結(jié)果，用TK基因特異引物鑒定，野生型GPV擴(kuò)增出740bp條帶，而重組毒未擴(kuò)增出相同條帶(圖1A)，而以PPRV-H和PPRV-F特異鑒定引物分別擴(kuò)增出46Ibp ^P 468bp條帶(圖 1B)。結(jié)果表明分別構(gòu)建并獲得了純化的H基因和F基因重組GPV，克隆病毒中不含野生型 GPV,已經(jīng)為純化的重組病毒。PPRV的H基因重組病毒命名為GPV-PPRV-H，F(xiàn)基因重組病毒命名為GPV-PPRV-F。其中鑒定目的基因插入所用的引物總結(jié)在表2中。表2.鑒定目的基因插入所用的引物
權(quán)利要求
1.重組山羊痘病毒活載體疫苗GPV-PPRV-HCGMCC No. 2619，其包括(1)山羊痘病毒弱毒疫苗，其作為載體；(2)小反芻獸醫(yī)病毒的血凝素蛋白H基因，其核苷酸序列為SEQ ID No. 4，其作為目的免疫基因；和(3)篩選基因，其包括gpt和報(bào)告基因eGFP。
2.權(quán)利要求1所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗，其中所述H基因閱讀框架ORF在起始密碼子ATG前加入kozak序列GCCGCCACC。
3.權(quán)利要求1所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗，其中所述免疫基因是插入到山羊痘病毒弱毒疫苗基因組的胸苷激酶TK基因編碼區(qū)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗，其中所述的篩選基因 gpt和綠色熒光報(bào)告基因eGFP同時(shí)受痘病毒晚期啟動(dòng)子pll控制，兩者之間以IRES相連接；目的免疫基因H受痘病毒早晚期強(qiáng)啟動(dòng)子p7. 5控制。
5.權(quán)利要求1所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗在制備用于預(yù)防或治療山羊痘、綿羊痘和小反芻獸疫的試劑盒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其同用于與表達(dá)F蛋白的重組痘病毒進(jìn)行聯(lián)合免疫。
7.權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其用于小反芻獸類(lèi)。
8.一種用于預(yù)防或治療山羊痘、綿羊痘和小反芻獸疫的試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗，其包括(1)GPV弱毒疫苗，其作為載體；(2)PPRV疫苗的病毒囊膜表面融合蛋白F基因或血凝素蛋白H基因，其作為目的免疫基因；和(3)篩選基因，其包括gpt，和報(bào)告基因eGFP。這兩種疫苗分別命名為GPV-PPRV-F(CGMCC No.2621)和GPV-PPRV-H(CGMCC No.2619)。本發(fā)明還提供所述疫苗的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗可以聯(lián)合使用，用于同時(shí)預(yù)防GP、綿羊痘和PPR。
文檔編號(hào)A61K39/275GK102302774SQ20111026544
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者步志高, 胡森, 陳偉業(yè) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所