專利名稱：利用葉綠體制備豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗原的制備方法，尤其涉及一種利用衣藻葉綠體制備豬圓環(huán)病毒 II型抗原的方法，屬于豬圓環(huán)病毒II型抗原的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒II型(Porcine circovirus type 2 (PCV2))是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome,PMWS)等相關(guān)疾病的主要病原，是一種無包膜的、二十四面體、單鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組全長為l，767bp或l，768bp，包含 11個(gè)閱讀框架。但是，基因組有明確的編碼產(chǎn)物的只有其中的兩個(gè)，即rep(復(fù)制相關(guān)蛋白)和cap (核衣殼蛋白)。PCV有兩種類型PCV1和PCV2 ；PCVl尚無明顯的致病證據(jù)，現(xiàn)在研究的主要還是PCV2。PCV2流行廣泛，能夠給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。目前，防治PCV2的疫苗主要有以下幾種(1)以PCVl為骨架，PCVl的0RF2部分用PCV2的0RF2置換，形成一個(gè)重組活的疫苗。(2)滅活的PCV2。(3)表達(dá)PCV2的0RF2的亞單位疫苗。實(shí)驗(yàn)證明，ORFl在PCVl和 PCV2之間具有交叉反應(yīng)性，而0RF2卻是特異的[Mah6D，etal. J Gen Virol. 2000，81 (Pt7) 1815-1824]，所以，亞單位疫苗一般都選擇0RF2。隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)動物疫苗，受到越來越多的青睞，尤其是利用葉綠體表達(dá)系統(tǒng)。植物葉綠體表達(dá)系統(tǒng)能夠高效表達(dá)目的基因、環(huán)境安全性高，已成為目前植物生物反應(yīng)器研究的執(zhí)占之一。1999年，張中林等(丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定點(diǎn)整合入衣藻葉綠體基因組的研究，遺傳，1999，21 (6) 1-6)將丙型肝炎病毒(HCV)兩段DNA片段，即HCV基因組非結(jié)構(gòu)NS 3區(qū)抗原基因(約0. 7kb)和核心抗原C區(qū)抗原基因(約0. 6kb)的cDNA片段，中間加入連接肽Ser-Pro-Gly-Ser的密碼子序列，構(gòu)建成融合抗原基因NS3-C，再將該表達(dá)盒與選擇標(biāo)記基因aadA表達(dá)盒和衣藻葉綠體基因組同源片段連接，構(gòu)建成衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體pSS6?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化衣藻葉綠體，經(jīng)PCR和Southern雜交分析表明，融合抗原基因NS3-C 已整合到衣藻葉綠體基因組中。2003年，Sun M等(Foot-and-mouth disease
virus VPl protein fused cholera toxin B subnit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast. Biotechnology Letters, 2003, 25 :1087-1092)人成功的在衣藻葉綠體中進(jìn)行了口蹄疫病毒(FMDV)VPl與霍亂毒素B亞基(CTB)融合基因的重組和表達(dá)。經(jīng)過Wfestern blot和ELISA免疫雜交分析表明CTBVPl融合蛋白表達(dá)量占可溶性總蛋白量的3-4% (Img可溶性總蛋白含有30-40 μ g 的重組蛋白)；Gm-ELISA結(jié)合分析證明衣藻葉綠體所表達(dá)的CTBVPl融合蛋白能夠正確地折疊形成寡聚體，從而具有一定的生物學(xué)活性。2008 年 3 月 Dong-Mei He 等人(Recombination and expression of classical swine fever virus (CSFV) structural protein E2 gene in Chlamydomonas reinhardtii chro lop last s, Colloids and Surfaces B :Biointerfaces，2007，55 :26-30)成功的在衣藻葉綠體中進(jìn)行了典型的豬瘟病毒(CSFV)的結(jié)構(gòu)蛋白E2的重組和表達(dá)。經(jīng)過Wfesternblot 和ELISA免疫雜交分析表明，CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白E2的表達(dá)量占衣藻細(xì)胞可溶性總蛋白的
2 % ο豬圓環(huán)病毒II型危害巨大，防治豬圓環(huán)病毒II型最有效的措施就是注射疫苗。 如何制備高效、低成本的疫苗十分迫切。德國勃林格殷格翰動物保健公司的PCV2疫苗 (CircoFlexB)、荷蘭英特威，先靈葆雅動物保健公司的PCV2疫苗(Circumvent B)等用桿狀病毒表達(dá)的PCV2的Capsid作為疫苗。但是，現(xiàn)有的這些疫苗均利用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞來生產(chǎn)， 其成本高，市場售價(jià)昂貴，在一定程度上限制了其應(yīng)用和推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的PCV2疫苗的制備方法所存在的產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)(有產(chǎn)生交叉反應(yīng)、產(chǎn)生非特異性免疫的可能性)等缺陷，提供一種新的PCV2疫苗的制備方法，該方法利用植物葉綠體作為生物反應(yīng)器表達(dá)豬圓環(huán)病毒II型抗原，具有產(chǎn)量高、成本低、安全性好等諸多優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種利用葉綠體制備豬圓環(huán)病毒II型抗原的方法，包括(1)構(gòu)建豬圓環(huán)病毒II 型抗原基因的衣藻葉綠體表達(dá)載體；( 將所構(gòu)建的衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻，篩選得到轉(zhuǎn)化有豬圓環(huán)病毒II型抗原基因的轉(zhuǎn)基因衣藻；C3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因衣藻，收集所表達(dá)的重組豬圓環(huán)病毒II型抗原蛋白，即得。上述方法中，步驟(1)中所述豬圓環(huán)病毒II型抗原基因優(yōu)選為豬圓環(huán)病毒II型抗原蛋白去核定位信號的0RF2基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示；步驟(1)中所述的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體可參考以下方法構(gòu)建得到將豬圓環(huán)病毒II型抗原基因置于衣藻葉綠體特異啟動子和終止子的調(diào)控之下， 組合得到豬圓環(huán)病毒II型抗原基因表達(dá)盒；將所組合的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因表達(dá)盒與衣藻葉綠體基因組中的同源片段進(jìn)行同源重組，構(gòu)建得到豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體。所述的葉綠體特異啟動子包括但不限于prrn、atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL等啟動子；優(yōu)選的，所述的啟動子為prrn啟動子(該啟動子進(jìn)行了優(yōu)化，加上了 SD序列以增強(qiáng)目的基因的轉(zhuǎn)錄)，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示。所述的終止子優(yōu)選為16SrRNA終止子，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示。所述的衣藻葉綠體基因組中的同源片段優(yōu)選為atpA-rbcL，其核苷酸序列為SEQID NO. 4所示。為了達(dá)到更好的效果，所述的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體特異表達(dá)載體還含有選擇標(biāo)記基因，該選擇標(biāo)記基因優(yōu)選為細(xì)菌來源的抗菌素抗性基因，更優(yōu)選為 aadA基因。為了更有利于葉綠體轉(zhuǎn)化，步驟⑵中所述的衣藻優(yōu)選為萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)，其品系為CW-15，其為無細(xì)胞壁的突變體；更優(yōu)選為處于生長對數(shù)期后期的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CW-15。
步驟O)中所述的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選為基因槍法。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的整體技術(shù)方案如下將豬圓環(huán)病毒II型抗原蛋白0RF2基因(其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示)克隆到 pSK-prrn-T-psbA5，-aadA-rbcl3，載體的 Mil 和 SphI 之間，使 PCV-0RF2 基因片段置于衣藻葉綠體基因特異啟動子ftTn和16SrRNA終止子調(diào)控之下得到質(zhì)粒pSK-prrn-pcv-T -psbA5，-aadA-rbcl3，；再將其克隆入含有同源重組片段atpA_rbcL的pAR質(zhì)粒BamH I位點(diǎn)，構(gòu)建得到豬圓環(huán)病毒II型衣藻葉綠體表達(dá)載體pAR-aadA-pcv。本發(fā)明將所構(gòu)建的豬圓環(huán)病毒II型衣藻葉綠體表達(dá)載體pAR-aadA-pcv提交到專利程序認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏， 其微生物保藏號是CGMCC No. 5170 ；分類命名是Chlamydomonas reinhardtii ；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明采用基因槍將pAR-aadA-pcv轉(zhuǎn)化萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，篩選得到轉(zhuǎn)化有豬圓環(huán)病毒II型抗原蛋白0RF2基因的轉(zhuǎn)基因衣藻。本發(fā)明采用基因同源重組技術(shù)將來源于豬圓環(huán)病毒II型的0RF2基因構(gòu)建到由衣藻葉綠體特異啟動子ftrn和16SrRNA終止子組合所驅(qū)動的表達(dá)盒，利用衣藻葉綠體基因組中的atpA-rbcL作為同源片段，發(fā)生同源重組，構(gòu)建得到豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體；通過基因槍轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入衣藻葉綠體中，通過PCR、ffesternblot, ELISA 等分子生物學(xué)手段檢測，最終獲得轉(zhuǎn)基因衣藻，使豬圓環(huán)病毒II型的抗原基因在衣藻葉綠體中得到成功表達(dá)，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，所表達(dá)的重組抗原蛋白具有良好的免疫效果，可用其制備得到預(yù)防或治療II型豬圓環(huán)病的疫苗。本發(fā)明方法利用衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬圓環(huán)病毒II型抗原，不僅彌補(bǔ)了其它生物反應(yīng)器的不足，而且還有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)第一，衣藻葉綠體能夠正確的折疊和組裝復(fù)雜的哺乳動物的蛋白；第二，在衣藻中，從最初的轉(zhuǎn)化到合成一定量的蛋白質(zhì)需要的時(shí)間相當(dāng)短。第三，外源基因能定點(diǎn)整合在衣藻葉綠體基因組上。第四，外源基因在后代中可穩(wěn)定表達(dá)。第五，衣藻葉綠體基因組具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、不結(jié)合組蛋白等特點(diǎn)有利于實(shí)現(xiàn)分子操作。第六，安全性高動物和低等植物的衣藻兩者之間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完全不同，作為抗原不會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，同樣也不會產(chǎn)生非特異性免疫，且衣藻作為飼料，表達(dá)的抗原可以直接加入飼料中。本發(fā)明方法所生產(chǎn)的重組蛋白不需純化，可直接作為動物添加飼料就可起到治療的效果，方便安全。本發(fā)明方法采用衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)在衣藻生物反應(yīng)器中安全、高效的生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒II型抗原，所表達(dá)的蛋白特異性較高，具有良好的免疫效果而且不會產(chǎn)生非目的性的免疫反應(yīng)。本發(fā)明抗原制備方法的成本顯著低于傳統(tǒng)的豬圓環(huán)病毒II型抗原制備方法 (例如通過昆蟲細(xì)胞繁殖病毒制備豬圓環(huán)病毒II型抗原)，無需投資建廠，無三廢，電力和水資源等能源消耗極少。由于衣藻是無毒的，可以食用，所以本發(fā)明方法所制備的抗原，安全性極高，可直接制作疫苗免疫動物?？傮w而言，本發(fā)明方法可以大幅度降低豬圓環(huán)病毒II型抗原的生產(chǎn)成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)材料I.E. coli TOPlO購自Promega公司；豬圓環(huán)病毒II型購自中國獸藥藥品監(jiān)察所；野生型萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtti)Cff-15自南開大學(xué)生命科學(xué)院引進(jìn)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存，具體培養(yǎng)方法和特性可以參考相關(guān)的文獻(xiàn)(Hyams， J. and D. R. Davies, The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 1972. 14(4) :p. 381-389)；檢測用的豬圓環(huán)病毒 II 型多克隆抗體(一抗)和大腸桿菌表達(dá)的PCV II型抗原可參考有關(guān)的文獻(xiàn)制備得到(韋永龍，張志芳，Bm-bacmid的構(gòu)建和II型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白的原核表達(dá)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生學(xué)位論文，2010，中國期刊網(wǎng))。2.酶與試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Klenow酶及其配套緩沖液購自 !Iomega公司；檢測所用的所有二抗抗體均購自Sigma公司；3.生化試劑IPTG、X_Gal為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Sunbiotech公司產(chǎn)品； Tris, dNIPs購自Sigma公司；蛋白胨、酵母抽提物、胰蛋白胨均購自0X0ID公司；溴化乙錠 (EB)購自Fluka公司；TEMED (N，N，N，，N，-四甲基乙二胺)購自瑞典LKB BROMMA公司；SDS 為BDH公司產(chǎn)品；β -巰基乙醇，Tris購自Sigma公司；考馬斯亮蘭R_250、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺購自瑞士Fluka Chemie AG公司；丙烯酰胺為Aldrich化學(xué)有限公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜Hybond-N和尼龍膜Hybond-C均為Amersham產(chǎn)品；4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl， pH7. 0)；衣藻培養(yǎng)基為TAP培養(yǎng)基；5.試驗(yàn)所用的健康小白鼠購自北京生物制品研究所，為6-8周齡雌性BALB/c小白鼠°實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒II型0RF2基因衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因衣藻的鑒定1.豬圓環(huán)病毒II型抗原蛋白0RF2基因的克隆1.1目的基因的獲得豬圓環(huán)病毒DNA的提取從典型的發(fā)病豬樣品中，按照用PCV2檢測試劑盒(世紀(jì)元亨公司)說明書，處理樣品，抽提出DNA，作為模版。根據(jù)已知的豬圓環(huán)病毒II型0RF2基因的序列，分別設(shè)計(jì)引物，并且分別引入MlI 位點(diǎn)和SphI位點(diǎn)，兩對引物如下PCVFP GGTCGACATGAATGGCATCTTCAACACCC Sal IPCVRP GGCATGCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC SphI在0. 5mL eppendorf管中加入以下組分
反應(yīng)程序
ddH204 OpLIOxPCR buffer5 μ LIOmM dNTP1 μ 上游引物pcvFPΙμΙ下游引物pcvRPΙμΙLA Taq DNA聚合酶ΙμΙ豬圓環(huán)病毒II型DNAΙμΙ總計(jì)5 OpL
95 "C
95 "C 56 "C 72 'C
5 min
72 °C10 min1.2產(chǎn)物的回收用普通凝膠進(jìn)行電泳，切下所需DNA條帶，稱重后放入Eppendorf管中，加入3倍體積(v/w)的6mol/L NaI溶液，37°C下使凝膠充分溶解，再加入10 μ L玻璃奶吸附DNA，室溫下放置5min，稍離心k，去上清，沉淀用New Wash洗液洗滌一次，重復(fù)離心、洗滌三次，晾干后用30yL 0. IXTE Buffer溶解DNA，離心后取上清，將DNA保存于_20°C備用。1. 3T載體的連接反應(yīng)回收的 PCR 產(chǎn)物 2. 5 μ L、pMD18_T 0. 5 μ L 禾口 soul I 3 μ L 混勻后，16°C反應(yīng) 2h。1.4質(zhì)粒DNA或連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取_70°C凍存的感受態(tài)細(xì)胞，用雙手搓至大部分融化后迅速置冰上。感受態(tài)細(xì)胞完全融化后加入質(zhì)粒DNA20 IOOng或連接混合物5 μ L，輕輕混勻，冰浴30min。42°C熱激 90sec，迅速置冰上1 2min。加入ImL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩(彡150rpm)培養(yǎng)lh。4，OOOg 離心5min，去部分上清后(留150 200 μ L)涂布于含適當(dāng)抗生素的LB平板上。37°C倒置培養(yǎng)過夜。1. 5堿裂解法提取質(zhì)粒DNA(1)用無菌牙簽從LB平板上挑取單菌落，接種于4mL含100 μ g/mL氨卡青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，37°C，230r/min，振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取1. 5mL過夜培養(yǎng)物于Eppendorf管內(nèi)，5，OOOrpm離心5min收集菌體，棄上清；(3)用 150 μ L Sol I 懸浮沉淀，冰浴 IOmin ；(4)加300 μ L Sol II和150 μ L氯仿，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻后冰浴5min ；(5)加 450 μ L Sol III，倒轉(zhuǎn)混勻后冰浴 IOmin ；(6) 12，OOOrpm離心lOmin，取上清，加0. 6倍體積異丙醇，混勻后于4 °C放置20min ；(7) 12，OOOrpm 離心 lOmin，棄上清，沉淀溶于 250 u L TER (含 20 ii g/mL RNaseA 的 IXTE)中，37°C消化 20min，加入 300 ii L PPt 沉淀 Buffer，混勻后置 4°C 20min ；(8) 12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，70 %乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用80 y L 0. 1XTE(PH8. 0)溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 6重組子的鑒定酶切鑒定首先小量抽提質(zhì)粒DNA，然后利用sail和sphl進(jìn)行酶切反應(yīng)，電泳后 出現(xiàn)約0. 6kb的DNA條帶的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒T-pcv，將重組質(zhì)粒T-pcv進(jìn)行測序，測序結(jié)果
與預(yù)期結(jié)果一致。衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建2.衣藻葉綠體同源載體pAR的構(gòu)建2. 1同源片段的獲得根據(jù)已知的衣藻葉綠體基因組序列分別設(shè)計(jì)引物如下引物設(shè)計(jì)RbcLFP CGTCGACTTAAAGTTTGTCAATAGTA Sal IRbcLRP CGGATCCCCGACAGGAATATACATGG BamH IAtpAFP CGGATCCGGATAAGCGAGGCCACTGT BamHIAtpARP GTCTAGAGATATAAGCAGATACGTCAC Xba I在0. 5mL印pendorf管中加入以下組分
ddH204 O^iL
IOxPCR buffer5 |a L
IOmM dNTP1 |a L
上游引物IpL
下游引物IpL
LA Taq DNA 聚合酶IpL
衣藻總DNAI^iL
總計(jì)5 OpL反應(yīng)程序95 °C5 min
95 °C1 min ，
55 °C1 min 3O cycles
72 °C90s
72 °C10 min回收大小正確的PCR擴(kuò)增片段，將上述兩個(gè)基因片段atpA，rbcL分別連接到T載 體進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果與預(yù)期完全一致。2. 2載體的構(gòu)建
用&!1 I和BamH I酶切克隆的rbcL基因片段的T載體，回收1.661Λ的片段，將該片段克隆到載體pBluescript SK的Ml I和BamH I位點(diǎn)之間，構(gòu)建載體pSK_rbcL，然后用 BamH I和)(ba I酶切克隆的aptA基因片段的T載體，回收1. 61Λ的DNA片段，將該片段克隆到載體pSK-rbcL的BamH I和)(baa I位點(diǎn)之間，獲得含有衣藻葉綠體同源片段atpA_rbcL 基因片段的載體PAR。2. 3衣藻葉綠體16srRNA啟動子和終止子的克隆 本實(shí)驗(yàn)將一段含有SD序列的堿基序列(GTACGGAGGGAATC)引入到16SrRNA啟動子的3’端，提高16SrRNA啟動子與核糖體的結(jié)合能力，從而提高下游基因的翻譯水平。根據(jù)衣藻葉綠體基因序列，設(shè)計(jì)引物如下PrrnFP GCTCGAGCGTCCTAATATAAATATTG xho IPrrnRP CGAATTCGTCGAC |GATTCCCTCCGTAC[ GGATACTCTTTAAAGTTTAAATEcoR I SailT16srRNAFP :CGAGCTCGGATCCCTAGGCAGTTGGCAGGACG Sac I BamH IT16srRNARP :GTCTAGAGCATGCATTTTTAACCCTTATGGGTATAT Xba Isph I在0. 5mL eppendorf管中加入以下組分
ddH2041μL
IOxPCR buffer5 μ L
IOmM dNTP1 μ L
上游引物0.5μ L
下游引物0. 5μ L
LA Taq DNA 聚合酶1 μ L
CtDNA1μ L
總計(jì)5 0μ L反應(yīng)程序
權(quán)利要求
1.一種利用葉綠體制備豬圓環(huán)病毒II型抗原的方法，包括(1)構(gòu)建豬圓環(huán)病毒II型抗原基因的衣藻葉綠體表達(dá)載體；(2)將所構(gòu)建的衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻，篩選得到轉(zhuǎn)基因衣藻；(3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因衣藻，收集所表達(dá)的重組蛋白，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述豬圓環(huán)病毒II型抗原基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體按照以下方法構(gòu)建得到(1)將豬圓環(huán)病毒II型抗原基因置于衣藻葉綠體特異啟動子和終止子的調(diào)控之下組合得到豬圓環(huán)病毒II型抗原基因表達(dá)盒；(2)將所組合的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因表達(dá)盒與衣藻葉綠體基因組中的同源片段進(jìn)行同源重組，構(gòu)建得到豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體的微生物保藏號是CGMCC No. 5170。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的葉綠體特異啟動子包括/7ΤΓ/7、 atpA、atpB、psbA、psbDirbcL ；優(yōu)選的，所述的/Trra啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2 所示；所述終止子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的衣藻葉綠體基因組中同源片段的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的豬圓環(huán)病毒II型抗原基因衣藻葉綠體特異表達(dá)載體還含有選擇標(biāo)記基因；優(yōu)選的，所述選擇標(biāo)記基因?yàn)榧?xì)菌來源的抗菌素抗性基因，更優(yōu)選為aadA基因。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的衣藻為萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii )；優(yōu)選為處于生長對數(shù)期后期的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) α-15 ；步驟(2)中所述的轉(zhuǎn)化方法為基因槍法。
9.由權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述方法制備得到的豬圓環(huán)病毒II型抗原產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求9所述的豬圓環(huán)病毒II型抗原產(chǎn)品在制備預(yù)防或治療豬圓環(huán)病毒II型藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用葉綠體制備豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原的方法及其產(chǎn)品，其制備方法包括(1)構(gòu)建豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原基因衣藻葉綠體表達(dá)載體；(2)將該衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻，篩選得到轉(zhuǎn)基因衣藻；(3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因衣藻，收集所表達(dá)的重組蛋白，即得。本發(fā)明方法采用衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)在衣藻生物反應(yīng)器中生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原，所表達(dá)的重組蛋白特異性高、具有良好的免疫效果且不會產(chǎn)生非目的性的免疫反應(yīng)。本發(fā)明制備方法可以大幅降低豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原的生產(chǎn)成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K39/12GK102311972SQ20111026679
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者倪丕沖, 張志芳, 李軼女, 沈桂芳, 王國增, 王金輝, 程奇 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所