專利名稱：Olmsted綜合征相關(guān)基因的鑒別以及與其相關(guān)的產(chǎn)品、方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域以及疾病診斷和治療領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明鑒定了與Olmsted綜合征相關(guān)的致病基因-TPRV3基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的TRPV3基因及其用途，包含突變的TRPV3基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療Olmsted綜合征的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
背景技術(shù)：
Olmsted綜合征(Olmsted syndrome, OS)是一種少見的先天性皮膚病，其最早由 Olmsted 于 1927 年手艮道(Olmsted HC. Keratodermia palmaris et plantariscongenitalis. 1927.33 :757-64)。該疾病主要表現(xiàn)為出生不久后出現(xiàn)的掌跖角化及腔口周圍角化，部分患者可伴有毛發(fā)缺失(Dogra D, Ravindraprasad JS, Khanna N,Pandhi RK. Olmsted syndrome with hypotrichosis.1ndian J Dermatol VenereolLeprol. 1997.63(2) :120-2) 0患者的掌跖角化可伴有劇烈瘙癢(Tao J，Huang CZ，Yu Nff, et al. Olmsted syndrome a case report and review of literature.1nt JDermatol. 2008. 47(5) :432-7)和典型的皮疹(其為特征性海星狀肥厚性角化，為殘毀性)，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)趾、指攣縮或者遠(yuǎn)端斷裂，嚴(yán)重影響患者的手、足活動功能，導(dǎo)致患者殘疾(Poulin Y, Perry HO, Muller SA. Olmsted syndrome-congenital palmoplantarand periorificial keratoderma. J Am Acad Dermatol. 1984. 10(4) :600-10)。腔口周圍角化可以累及患者的口腔外周、鼻前庭周圍、會陰及肛門周圍，表現(xiàn)為境界清楚的肥厚性角化性紅色斑塊，嚴(yán)重影響患者的外觀，給患者造成巨大心理負(fù)擔(dān)。除了診斷OS所必要的殘毀性掌跖角化及腔口周圍角化以外，部分患者可出現(xiàn)毛發(fā)稀疏或毛發(fā)缺失、毛周角化、口腔粘膜角化性白斑、甲營養(yǎng)不良、聽力減退及反復(fù)細(xì)菌或真菌感染等癥狀(Tao J，HuangCZ, Yu NW, et al. Olmsted syndrome a case report and review of literature.1nt JDermatol. 2008. 47(5) :432-7)。目前國內(nèi)外報道的總病例數(shù)僅有40余例，這可能與臨床醫(yī)生對于OS認(rèn)識不足，或者未能進(jìn)行全面體檢(如會陰及肛門周圍)，導(dǎo)致重要體征遺漏而誤診為殘毀性掌跖角化癥有關(guān)。OS的實際發(fā)病率可能遠(yuǎn)高于此。OS的病因尚不清楚。目前大多認(rèn)為該疾病為遺傳性疾病，但由于遺傳模式尚未清楚，發(fā)病率極低，且由于疾病表現(xiàn)嚴(yán)重導(dǎo)致家族性病例極罕見，因此對于該疾病的致病基因，研究較為困難。由于KRT1、GJB2、SLURPl和LOR基因突變也可以引起嚴(yán)重掌跖角化癥，曾有研究者針對這4個基因的突變情況對Olmsted患者進(jìn)行了研究，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)任何致病性突變(Mevorah B, Goldberg I, Sprecher E, et al. Olmsted syndrome mutilating palmoplantar keratoderma with periorificial keratotic plaques. J AmAcad Dermatol. 2005. 53(5 Suppl I) :S266_72)。此外，已報道，OS患者皮損部位的角蛋白1、角蛋白10、角蛋白5及角蛋白14表達(dá)異常(Fonseca E, Pena C, Del PJ, et al. Olmstedsyndrome. J Cutan Pathol. 2001. 28 (5) :271-5)。我們研究組也曾經(jīng)對一例 OS 患者的KRT1、KRT10、KRT5及KRT14基因進(jìn)行突變檢測，亦未能發(fā)現(xiàn)致病性突變。另外，由于報道的家族性O(shè)S病例的家系均較小，無法進(jìn)行有效的全基因組連鎖分析。最近,外顯子組測序(exome sequencing)已成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon綜合征的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合征的SETBPl基因，以及嚴(yán)重大腦畸形的 TOR62 基因等(Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al, Targetedcapture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature2009,461 (7261) :272-276 ；Hoischen A, van Bon Bff, Gilissen C, et al. De novo mutationsof SETBPl cause Schinzel-Giedion syndrome. Nat Genet 2010:42(6) :483-5 ;BilguvarK, Ozturk AK, Louvi A, et al, ffhole-exome sequencing identifies recessive WDR62mutations in severe brain malformations. Nature 2010,467 (7312) :207-210)。外顯子組測序技術(shù)已被證明為減少稀有單基因疾病的候選基因個數(shù)甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段。通過對很少的幾個個體(包括患者及正常對照)進(jìn)行外顯子組測序，以篩選與 疾病相關(guān)的變異，其成功率大為提升。本發(fā)明基于外顯子組測序技術(shù)鑒定了與Olmsted綜合征相關(guān)的致病基因-TPRV3基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的TRPV3基因及其用途，包含突變的TRPV3基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療Olmsted綜合征的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)術(shù)語和實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。如本文中所使用的，術(shù)語“TRPV3基因”是指編碼一過性受體陽離子通道蛋白V3亞型(transient receptor potential cation channel vanilloid 3, TRPV3)的基因。TRPV3基因含有18個外顯子，其示例性cDNA序列如SEQ ID NO 37所示。如本文中所使用的，TRPV3基因的第N個外顯子被簡稱為外顯子N (N為1-18的整數(shù))。如本文中所使用的，術(shù)語“突變”，當(dāng)用于描述基因或DNA時，是指基因序列或DNA序列中一個或多個(例如，幾個)堿基的添加、缺失和/或置換；當(dāng)用于描述蛋白質(zhì)時，是指蛋白質(zhì)氨基酸序列中一個或多個(例如，幾個)氨基酸殘基的添加、缺失和/或置換。如本文中所使用的，術(shù)語“沉默突變”是指這樣的基因突變，其引起mRNA中的密碼子發(fā)生改變，但由于密碼子的簡并性而未引起編碼的氨基酸發(fā)生改變。如本文中所使用的，術(shù)語“非沉默突變”是指除了沉默突變以外的基因突變，包括但不限于，錯義突變、無義突變和移碼突變等。如本文中所使用的，術(shù)語“雜合突變”是指這樣的突變，其僅存在于一對等位基因中的一個基因中。如本文中所使用的，術(shù)語“C. 1717”是指CDNA序列的第1717位堿基(以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基)，其中“c. ”表示cDNA，數(shù)字“1717”表示第1717位堿基。本文中所使用的其他類似的術(shù)語，例如C. 1703和C. 2074，具有類似的含義。如本文中所使用的，術(shù)語“c. 1717G —A”是指cDNA序列的第1717位堿基(以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基)由G突變?yōu)锳。本文中所使用的其他類似的術(shù)語，例如 c. 1717G —T，c. 1703G —T 和 c. 2074T — G，具有類似的含義。如本文中所使用的，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，術(shù)語“載體(vector) ”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時，載體稱為表達(dá)載體。此類載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。載體中可包含與目的基因可操作地連接的表達(dá)控制序列。如本文中所使用的，術(shù)語“可操作地連接”是指所連接的分子的連接方式使得能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的功能。例如，表達(dá)控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實現(xiàn)表達(dá)控制序列對基因編碼序列的表達(dá) 的控制作用。如本文中所使用的，術(shù)語“表達(dá)控制序列”是實現(xiàn)基因表達(dá)所需要的控制序列，其是本領(lǐng)域熟知的。表達(dá)控制序列通常必須包括啟動子，常常也包括轉(zhuǎn)錄終止序列，并且還可以包含其他序列，如增強子序列?；虮磉_(dá)對于siRNA、miRNA等而言是指轉(zhuǎn)錄，并且還可以包括轉(zhuǎn)錄后加工；對于蛋白質(zhì)編碼序列而言通常是指轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生蛋白質(zhì)。另外，載體中還可包含選擇標(biāo)記。此類選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的,例如但不限于抗生素抗性基因，例如青霉素抗性基因、紅霉素抗性基因等等。如本文中所使用的，“PCR引物”指用于在PCR反應(yīng)中擴增靶標(biāo)核酸的多核苷酸片段，其通常為寡核苷酸，例如含有至少5個堿基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個或者更多個堿基的多核苷酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，引物不必與待擴增的目的基因或其互補鏈完全互補，只要其能夠特異性擴增目的基因。如本文中所使用的，術(shù)語“特異性擴增”是指弓丨物能夠通過PCR反應(yīng)擴增目的基因，而不擴增其他基因。例如，特異性擴增TRPV3基因是指，在PCR反應(yīng)中引物只擴增TRPV3基因，而不擴增其他基因。此類引物的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，參見例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989);和 Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)。通常，引物與待擴增的目的基因或其互補鏈具有大體上的同一性，從而能夠特異性擴增目的基因。例如，引物與待擴增的目的基因或其互補鏈具有至少60%的序列同一性,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一丨I"生。如本文中所使用的，術(shù)語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目X100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進(jìn)行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如 Align 程序(DNAstar, Inc.)方便地進(jìn)行的 Needleman 等人(1970) J. Mol. Biol. 48 443-453的方法來實現(xiàn)。如本文中所使用的，術(shù)語“雜交”是指相互間具有互補序列的兩個單鏈核酸分子在一定條件下(適宜的溫度及離子強度等)按堿基互補配對原則退火形成雙鏈核酸的過程。核酸雜交可以在DNA-DNA之間，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之間進(jìn)行，只要它們之間存在互補序列，可以進(jìn)行堿基配對。一般而言，雜交的雙方是待測核酸分子和已知核酸分子。在雜交體系中已知的核酸分子稱作探針(probe)。核酸雜交包括固-液相雜交和液相雜交。液相雜交是在溶液中進(jìn)行的雜交反應(yīng)，其是指待測核酸分子與已知核酸分子(探針)在溶液
中退火形成雜交復(fù)合物。如本文中所使用的，術(shù)語“特異性檢測TRPV3基因突變”是指探針能夠區(qū)分出含有突變的TRPV3基因與不含有突變的TRPV3基因。一般而言，可以通過控制雜交條件的嚴(yán)緊性，使得探針能夠區(qū)分出含有突變的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴(yán)緊條件下，與TRPV3基因精確互補的探針可以與不含有突變的TRPV3基因雜交，而不與甚至只包含一個點突變的突變的TRPV3基因雜交，從而將二者區(qū)分開。同樣，還可以設(shè)計與突變的TRPV3基因精確互補的探針，從而其在高度嚴(yán)緊條件下與突變的TRPV3基因雜交，而不與不含有突變的TRPV3基因雜交。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，探針的設(shè)計和雜交技術(shù)是熟知的，參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)；和 Ausubel 等人，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。為了舉例說明的目的，雜交的條件可以是嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的DNA在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，之后在0.2XSSC/0. 1% SDS中于約50-65°C下進(jìn)行一次或多次洗滌；高度嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的核酸在6XSSC中約45°C下雜交，之后在0. 1XSSC/0. 2% SDS中于約68°C下進(jìn)行一次或多次洗滌；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)緊雜交條件。通常，探針是經(jīng)標(biāo)記的，從而在雜交反應(yīng)結(jié)束后，通過利用探針上的標(biāo)記物，可以分離和檢測雜交后的雙鏈。同樣，也可以對引物進(jìn)行標(biāo)記，從而在PCR后，通過利用引物上的標(biāo)記物，可以分離和檢測擴增產(chǎn)物?？捎糜跇?biāo)記探針和引物的標(biāo)記物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括但不限于，放射性同位素如1251、酶、酶的底物、發(fā)光物質(zhì)如異魯米諾和吖啶酯、熒光物質(zhì)如熒光素和羅丹明、生物素和有色物質(zhì)如乳膠顆粒和膠體金等。標(biāo)記用的酶可以是過氧化物酶(如辣根過氧化物酶HRP)、堿性磷酸酶、3半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對于這些反應(yīng)中合適的底物有2，2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、魯米諾-過氧化氫、鄰苯二胺-過氧化氫(針對過氧化物酶)、對硝基苯磷酸鹽、4-甲基磷酸傘型酮、3_(2' _螺旋金剛燒)-4-甲氧基-4-(3 " _憐酸基)苯基_1，2-二乙氧基燒(針對喊性磷酸酶)、對硝基苯-3-D-半乳糖和甲基傘形酮-3-D-半乳糖(針對3半乳糖苷酶)。其它的標(biāo)記包括量子點標(biāo)記、生色團標(biāo)記、酶標(biāo)記、親和配體標(biāo)記、電磁自旋標(biāo)記、重原子標(biāo)記、標(biāo)記有納米微粒光散射標(biāo)記或其它納米微粒的探針、異硫氰酸熒光素(FITC)、TRITC、羅丹明、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy_7、得克薩斯紅、Phar-Red、異藻紅蛋白(APC)、以及酶標(biāo)記如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶和半抗原偶聯(lián)物如洋地黃毒苷或二硝基苯酚、或能夠形成配合物的結(jié)合配對如鏈霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗體配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG ;突光基團如傘形三糖(umbelIiferone)、突光素、異硫氰酸突光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、綠熒光蛋白、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、二苯乙烯、突光黃、Cascade藍(lán)、二氯三嗪基突光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白、突光鑭系絡(luò)合物如包括銪和鋪、Cy3、Cy5、分子信標(biāo)(molecular beacons)和其突光衍生物、發(fā)光材料如魯米諾；光散射或細(xì)胞質(zhì)基因組共振材料如金或銀顆?；蛄孔影?quantum dot):或放射性材料如14C、1231、1241、1311、Tc99m、35S或3H ;或球珠(spherical shell)，以及標(biāo)記有本領(lǐng)域已知的任何其它信號產(chǎn)生標(biāo)記物的探針。例如，可檢測的分子包括但不限于熒光基團以及前面所述其它已知的，如在 Joseph R. Lakowicz (Editor)所編的 Principles of FluorescenceSpectroscopy, Plenum Pub Corp,第二版(July 1999)和 Richard P. Hoagland 的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些實施方式中，標(biāo)記物包括半導(dǎo)體納米微晶如量子斑(即 Qdots),參見 U. S. P 6,207,392。Qdots 可從 Quantum Dot Corporation 購得。用于本發(fā)明的半導(dǎo)體納米微晶包括Group I1-V半導(dǎo)體的納米微晶如MgS、MgSe、MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS、BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe、ZnTe, CdS, CdSe,CdTe, HgS, HgSe, HgTe和其混合物以及Group II1-V半導(dǎo)體的納米微晶如GaAs、InGaAs,InP、InAs和其混合物。Group IV半導(dǎo)體如鍺或硅的使用，或有機半導(dǎo)體的使用，在某些條件下可能是方便可行的。半導(dǎo)體納米微晶也可以包括合金，其含有兩種或多種選自于Group II1-V化合物、Group I1-VI化合物、Group IV元素和其組合物的半導(dǎo)體。根據(jù)使用的標(biāo)記物，相應(yīng)的核酸分離和檢測方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是已知的。參見例如，Henegariu0 等人，(1999). “Custom fluorescent-nucIeotide synthesis as an alternativemethod for nucleic acid labeling，，，Nature Biotechnology 18 :345-348 ；Ezaki T 等，1989.Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridizationin Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization inwhich Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among BacterialStrains.1nt. J. of Systemic Bacteriology 29(3) :224-229 ;和Herrington C等人，1998.PCR 3 PCR in situ hybridization a practical approach, Volume 3. Oxford OxfordUniversity Press。如本文中所使用的，表述“反義RNA特異于突變的TRPV3基因，且不作用于正常的TRPV3基因”是指反義RNA能夠通過基因沉默而使得突變的TRPV3基因不表達(dá)或表達(dá)降低，并且不影響正常的TRPV3基因的表達(dá)。此類反義RNA的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。如本文中所使用的，表述“抗體特異于突變的TRPV3基因所編碼的蛋白，且不作用于正常的TRPV3基因所編碼的蛋白”是指抗體能夠特異性識別突變的TRPV3基因所編碼的蛋白并阻抑其功能，而不識別正常的TRPV3基因所編碼的蛋白或影響其功能。此類抗體的產(chǎn)生方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，雜交瘤技術(shù)。本發(fā)明至少部分基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)TPRV3基因的突變可導(dǎo)致Olmsted綜合征。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的TRPV3基因及其用途，包含突變的TRPV3基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療Olmsted綜合征的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了突變的TRPV3基因，其與SEQ ID NO :37相比具有至少I個非沉默突變，并且所述突變的TRPV3基因?qū)е翺lmsted綜合征的發(fā)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變位于這樣的區(qū)域，所述區(qū)域選自TRPV3基因的外顯子1-18中的一個或多個。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變位于TRPV3基因的第13個和/或15個外顯子。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非 沉默突變位于選自下列位置中的一個或多個位置c. 1717, c. 1703和c. 2074。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變是選自下列突變中的一個或多個突變c. 1717G —A、c. 1717G —T、c. 1703G —T和 c. 2074T — G0在另一個方面，本發(fā)明提供了包含上述突變的TRPV3基因的載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體是商購可得的。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體包含與上述突變的TRPV3基因可操作地連接的表達(dá)控制序列，例如但不限于啟動子，增強子和終止子。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體任選地還包含選擇標(biāo)記。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含上述突變的TRPV3基因和/或載體的宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動物細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系，例如293T細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，可將致病基因用于產(chǎn)生疾病動物模型和/或用作藥物靶點，從而研究疾病的發(fā)病機制和開發(fā)有效治療疾病的藥物。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了上述突變的TRPV3基因的用途，其用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型，或用作藥物靶點，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型，或用作藥物靶點。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述動物包括但不限于，哺乳動物，例如小鼠，大鼠，兔和猴。在另一個方面，本發(fā)明提供了上述載體或宿主細(xì)胞的用途，其用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含上述突變的TRPV3基因和/或載體和/或宿主細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于診斷Olmsted綜合征的診斷劑，其包含能夠特異性擴增TRPV3基因的引物，或能夠特異性檢測TRPV3基因突變的探針。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述引物能夠特異性擴增TRPV3基因的外顯子，優(yōu)選第13個和/或15個外顯子。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述引物的序列選自SEQ ID NO 25、26、29和30。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述引物是如SEQ ID NO :25和26所示的引物，或如SEQ ID NO :29和30所示的引物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述突變位于TRPV3基因的外顯子，優(yōu)選第13個和/或15個外顯子，更優(yōu)選地位于選自下列的一個或多個位置c. 1717，c. 1703和c. 2074。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述突變是選自下列的一個或多個突變c. 1717G —A、c. 1717G — T、c. 1703G — T 和 c. 2074T — G。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療Olmsted綜合征的治療劑，其包含反義RNA,所述反義RNA特異于上文所述的突變的TRPV3基因，且不作用于正常的TRPV3基因。如本文中所使用的，術(shù)語“正常的TRPV3基因”是指編碼具有正常生物學(xué)功能的TRPV3蛋白的TRPV3基因，其例如但不限于，如SEQ ID NO :37所示的TRPV3基因。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療Olmsted綜合征的治療劑，其包含抗體，所述抗體特異于上文所述的突變的TRPV3基因所編碼的蛋白，且不作用于正常的TRPV3基因所編碼的蛋白。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含上文所述的診斷劑，或治療劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了診斷受試者是否患有Olmsted綜合征的方法，其包·括，檢測受試者的TRPV3基因是否存在非沉默突變，如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有Olmsted綜合征。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變位于這樣的區(qū)域，所述區(qū)域選自TRPV3基因的外顯子1-18中的一個或多個。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變位于TRPV3基因的第13個和/或15個外顯子。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變位于選自下列位置中的一個或多個位置c. 1717, c. 1703和c. 2074。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非沉默突變是選自下列突變中的一個或多個突變c. 1717G —A、c. 1717G — T、c. 1703G — T和 c. 2074T — G0在另一個方面，本發(fā)明提供了檢測TRPV3基因的突變的方法，其包括使用上文所述的診斷劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法不是診斷方法。例如，所述方法可以用于研究目的。在另一個方面，本發(fā)明提供了治療Olmsted綜合征的方法，其包括使用上文所述的治療劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了上文所述的診斷劑在制備用于檢測TRPV3基因的突變和/或用于診斷Olmsted綜合征的試劑盒中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了上文所述的治療劑在制備用于治療Olmsted綜合征的試劑盒中的用途。本發(fā)明的試劑、試劑組合物或試劑盒中可進(jìn)一步包含與活性成分相容的緩沖液、載體或媒介等，例如選自下列的一種或多種水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質(zhì)的組合。此類緩沖液、載體或媒介可進(jìn)一步包括微量輔助物質(zhì)，例如濕潤劑、乳化劑、表面活性劑、防腐劑或助懸劑等。發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過外顯子組測序技術(shù)確定了 OS的致病基因，這至少帶來了以下有益效果。一方面，本發(fā)明為OS的診斷和治療提供了新的方法和工具。特別地，本發(fā)明所提供的診斷方法以及用于該方法的引物和/或探針可用于快速、有效地診斷Olmsted綜合征，并且根據(jù)OS致病基因所設(shè)計的反義RNA和抗體可用于有效治療Olmsted綜合征，從而提供了新的治療選擇。
另一方面，本發(fā)明為OS的發(fā)病機制研究奠定了重要基礎(chǔ)，為OS患者的治療提供全新的理論依據(jù)。特別地，由于OS患者的殘毀性掌跖角化可以伴有劇烈的瘙癢，本發(fā)明所確定的致病基因可能在瘙癢的發(fā)作過程中起到一定的作用，這對于病理生理過程極為復(fù)雜的瘙癢癥狀的研究提供一個新的思考方向。此外，本發(fā)明所確定的基因很有可能參與表皮角化及毛發(fā)生長調(diào)控過程，這可能為重癥角化性皮膚病及毛發(fā)疾病的發(fā)病機制研究提供新的思路。最后，利用OS致病基因所獲得的疾病動物模型是研究OS的發(fā)病機制和治療方法的有力工具。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。


圖1為TRPV3基因的測序圖，其顯示了 OS患者的TRPV3基因中所發(fā)生的突變。其 中，圖1A顯示，TRPV3基因在c. 1717處(c. 1717是指cDNA編碼區(qū)的第1717位堿基，以起始密碼子ATG的堿基A為第I位堿基，下同)的堿基G突變?yōu)锳 ( S卩，c. 1717G —A)，其導(dǎo)致TRPV3蛋白的第573位氨基酸殘基由Gly突變?yōu)镾er (即，Gly573Ser);圖1B顯示，TRPV3基因在c. 1717處的堿基G突變?yōu)門 ( S卩，c. 1717G — T)，其導(dǎo)致TRPV3蛋白的第573位氨基酸殘基由Gly突變?yōu)镃ys (即，Gly573Cys);圖1C顯示，TRPV3基因在c. 1703處的堿基G突變?yōu)門( S卩，c. 1703G — T)，其導(dǎo)致TRPV3蛋白的第568位氨基酸殘基由Gly突變?yōu)閂al (即，Gly568Val);圖1D顯示，TRPV3基因在c. 2074處的堿基T突變?yōu)镚 (即，c. 2074T —G)，其導(dǎo)致TRPV3蛋白的第692位氨基酸殘基由Trp突變?yōu)镚ly ( S卩，Trp692Gly)。
具體實施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實施例來描述本發(fā)明。除非特別指明，否則基本上按照本領(lǐng)域內(nèi)熟知的以及在各種參考文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法進(jìn)行實施例中描述的實驗和方法(例如，分子生物學(xué)和核酸化學(xué)實驗方法)。參見，例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989);和 Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992),其全部通過引用合并入本文。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。本文中提及的全部公開案和其他參考資料以其全文通過引用合并入本文。實施例1:0S致病基因的鑒定我們在國內(nèi)收集到7例OS病例，其中I例為家族性病例，6例為散發(fā)病例，各個病例的詳細(xì)情況提供于表I中(所有病例均由北京大學(xué)第一醫(yī)院采集和提供)。在這些病例中，所有患者均表現(xiàn)為殘毀性掌跖角化伴腔口周圍角化，并且病例1-4伴有毛發(fā)缺失及頭部毛周角化。所收集的I例家族性病例即為表I中的病例3，該病例的女兒與其一樣患有OS，且癥狀如上所述，但因該病例的女兒出生后不久就去世而未取到樣本。之前的研究曾經(jīng)報道了 3個家族性O(shè)S病例(Yaghoobi R，Omidian M，Sina N，AbtahianSA, Panah1-Bazaz MR. Olmsted syndrome in an Iranian family report of two newcases. Arch Iran Med. 2007. 10(2) :246-9 ；Rivers JK, Duke EE, Justus DW. Etretinate management of keratoma hereditaria mutilans in four family members. J AmAcad Dermatol. 1985. 13(1) :43-9 ；和 Atherton DJ, Sutton C，Jones BM. Mutilatingpalmoplantar keratoderma with periorificial keratotic plaques (Olmsted ! ssyndrome). Br J Dermatol. 1990. 122(2) :245-52)，以及 I 個同卵雙胞胎病例(Cambiaghi S，Tadini G，Barbareschi M，Caputo R. Olmsted syndrome in twins. ArchDermatol. 1995. 131 (6) :738-9)。這些已報道的家族性病例，與我們所收集到的家族性病例一起，提示OS很可能是孟德爾遺傳性疾病，而且常染色體顯性遺傳的可能性較大。表1:所收集的7例OS病例的詳細(xì)情況
病例年齡性別家族史_來源 19女無山西
214女無山西
325女有湖北
412女無深圳
512男無河北
623男無江蘇
7_27_^^_責(zé)州基于上述分析，我們使用AgilentSureSelect Human All Exon Kit(Agilent)^J用Solexa高通量測序平臺(Illumina Hiseq 2000),根據(jù)廠商的說明書,對病例I及其父母的外顯子組序列進(jìn)行了測序。簡言之，外顯子組測序方法如下I)獲得受試者的基因組DNA，并將基因組DNA隨機打斷成150_200bp左右的片段；隨后在片段兩端分別連接上接頭以制備雜交文庫(參見例如，http://www.1llumina. com/support/documentation, ilmn 提供的 Illumina/Solexa 標(biāo)準(zhǔn)建庫說明書)。2)根據(jù)制造商提供的說明書,將按照Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫說明書建立的雜交文庫與 SureSelect Biotiny lated RNA Library (BAITS) (Agilent SureSelect HumanAll Exon Kit)進(jìn)行雜交富集，然后再次進(jìn)行LM-PCR線性擴增，最后進(jìn)行上機測序。測序平臺為Illumina Hiseq 2000，讀取長度為90bp，每個樣本的平均測序深度為至少20X。3)測序所獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Softwarel. 7進(jìn)行處理；經(jīng)過過濾去除污染后，使用 SOAPaligner 2. 20 (Li R, Li Y, Kristiansen K, et al, SOAP short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008,24(5) :713-714 ;和Li R,Yu C,Li Y,ea al,S0AP2 an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009,25(15) :1966-1967)將測序數(shù)據(jù)與參考基因組(hgl8/build36. 3)進(jìn)行比對，從而獲得比對到參考基因組上的Unique Mapped Reads。然后使用SOAPsnp (LiR, Li Y, Fang X, Yang H, et al, SNP detection for massively parallel whoIe-genomeresequencing. Genome Res 2009,19(6) :1124-1132)確定革巴區(qū)域(即，全基因組所有外顯子區(qū)域)的基因型。結(jié)果顯示，與參考基因組相比，在病例I的外顯子組中存在19593個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和 2757 處的插入 / 缺失。使用 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/pro jects/SNP/snp_summary. cgi)，千人基因組數(shù)據(jù)庫(www.1OOOgenomes. org/)和 HapMap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap. ncb1. nlm. nih. gov/)等公共數(shù)據(jù)庫對上述結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的過濾，去除所有已知的變異(SNP和插入/缺失)。進(jìn)一步，還利用通過上述方法獲得的病例I的父母的外顯子組測序結(jié)果進(jìn)行過濾(以去除也存在于父母外顯子組中的變異)，并利用SIFT軟件(http://sift. jcv1. org/)進(jìn)行SNP功能預(yù)測，最終獲得45個雜合的可能具有致病意義的de novo SNP位點?！び捎谕怙@子組測序存在一定程度的假陽性，因此我們進(jìn)一步利用Sanger測序法，對上述45個雜合的可能具有致病意義的de novo SNP位點進(jìn)行驗證。Sanger測序結(jié)果顯示，上述45個de novo SNP位點中有44個是假陽性的其中，2個位點的突變也存在于病例I的父母的外顯子組中(但是外顯子組測序法沒有將其檢測出來)，42個位點在病例I的外顯子組沒有發(fā)生突變(但是外顯子組測序法因為假陽性的問題而將其檢測為突變)。因此，最終的結(jié)果顯示，在使用外顯子組測序法所鑒定的45個位點中，僅有I個位點為真正的denovo SNP位點，該位點為TRPV3基因的c. 1717G — A雜合突變(參見圖1A)，其導(dǎo)致TRPV3蛋白發(fā)生錯義突變，即第573位氨基酸殘基由Gly突變?yōu)镾er(Gly573Ser)。TRPV3蛋白為一過性受體陽離子通道蛋白(transient receptor potentialcation channel)的V3亞型(vanilloid 3),主要介導(dǎo)以I丐離子為主的多種陽離子的通透。TRPV3基因(其cDNA序列如SEQ ID NO :37所示)含有18個外顯子，編碼一個TRPV3蛋白單體，該單體含有6個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)(S1-S6)、連接跨膜結(jié)構(gòu)氨基酸以及N端和C端亞區(qū)。每4個TRPV3蛋白單體聚合成一個具有完整功能的TRPV3通道。Gly573位于連接S4和S5跨膜區(qū)域的胞內(nèi)區(qū)，該位點在TRPV蛋白的不同亞型中以及在不同物種中高度保守。之前的研究表明，TRPV3通道可以被多種物理及化學(xué)刺激激活，特別是在33-39 °C的溫度下激活，因此，其被認(rèn)為可能具有介導(dǎo)溫度感受的功能；并且，TRPV3通道在皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞中高度表達(dá)(Smith GD, Gunthorpe MJ, Kelsell RE, et al. TRPV3 is a temperature-sensitivevanilloid receptor-like protein. Nature. 2002. 418 (6894) :186-90)。之前還已報道，攜帶TRPV3的Gly573Ser自發(fā)性突變的小鼠發(fā)生口周角化及無毛的臨床表型，該臨床表型與我們收集到的OS病例的臨床表現(xiàn)高度類似(Asakawa M, Yoshioka T, Matsutani T, etal. Association of a mutation in TRPV3 with defective hair growth in rodents. JInvest Dermatol. 2006. 126(12) :2664-72)。因此，我們將 TRPV3 基因初步鑒定為 OS 的致病基因。SEQ ID NO 37 TRPV3 基因的 cDNAI CCACAACTTCGATCTTGGCACCTGCGGCCTCCCCTGCCTTTTCTCCGGTGGGGATGAGGC6I TGCTGTGTGGGTGTGGGGGTGACTCACACGGGCCACGTGGGTGGGCGGGTGCTGCAGCTG
121 TGGCTGGTGGGCGTGGCCTGCCTGGCGCCGAGGGCAGGTGGCTCAGCCAGTTCTGCCTCT181 GACGCCTCATTCCAGCCATCCCTCTGCCTGCAATGAGAGCTTCCCGCCGCCTCAGCCACA241 GTCCCACCCGGGGGCCTTGGGCCCCAGACATGCGGTGATCTCAGGGCAAGGGTTGCCACG
權(quán)利要求
1.突變的TRPV3基因，其與SEQID NO :37相比具有至少I個非沉默突變，并且所述突變的TRPV3基因?qū)е翺lmsted綜合征的發(fā)生；優(yōu)選地，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種；優(yōu)選地，所述非沉默突變位于這樣的區(qū)域，所述區(qū)域選自TRPV3基因的外顯子1-18中的一個或多個；優(yōu)選地，所述非沉默突變位于TRPV3基因的第13個和/或15個外顯子；優(yōu)選地，所述非沉默突變位于選自下列位置中的一個或多個位置c. 1717，c. 1703和c. 2074 ；優(yōu)選地，所述非沉默突變是選自下列突變中的一個或多個突變c. 1717G — A、c. 1717G — T、c. 1703G — T 和 c. 2074T — G。
2.包含權(quán)利要求1的突變的TRPV3基因的載體。
3.包含權(quán)利要求1的突變的TRPV3基因和/或權(quán)利要求2的載體的宿主細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的突變的TRPV3基因的用途，其用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型，或用作藥物IE點，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型,或用作藥物靶點。
5.權(quán)利要求2的載體或權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞的用途，其用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生Olmsted綜合征動物模型。
6.試劑盒，其包含權(quán)利要求1的突變的TRPV3基因和/或權(quán)利要求2的載體和/或權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞。
7.用于診斷Olmsted綜合征的診斷劑，其包含能夠特異性擴增TRPV3基因的引物，或能夠特異性檢測TRPV3基因突變的探針；優(yōu)選地，所述引物能夠特異性擴增TRPV3基因的外顯子，優(yōu)選第13個和/或15個外顯子;優(yōu)選地，所述引物的序列選自SEQ ID NO :25、26、29和30 ；優(yōu)選地，所述引物是如SEQ ID NO :25和26所示的引物，或如SEQ ID N0:29和30所示的引物；優(yōu)選地，所述突變位于TRPV3基因的外顯子，優(yōu)選第13個和/或15個外顯子，更優(yōu)選地位于選自下列的一個或多個位置c. 1717，c. 1703和c. 2074 ；優(yōu)選地，所述突變是選自下列的一個或多個突變c. 1717G — A、c. 1717G — T、c. 1703G —T 和 c. 2074T —G。
8.用于治療Olmsted綜合征的治療劑，其包含反義RNA，所述反義RNA特異于權(quán)利要求1的突變的TRPV3基因，且不作用于正常的TRPV3基因。
9.用于治療Olmsted綜合征的治療劑，其包含抗體，所述抗體特異于權(quán)利要求1的突變的TRPV3基因所編碼的蛋白，且不作用于正常的TRPV3基因所編碼的蛋白。
10.試劑盒，其包含權(quán)利要求7的診斷劑，或權(quán)利要求8的治療劑，或權(quán)利要求9的治療劑。
11.診斷受試者是否患有Olmsted綜合征的方法,其包括,檢測受試者的TRPV3基因是否存在非沉默突變；優(yōu)選地，所述非沉默突變選自添加，缺失和置換中的一種或多種；優(yōu)選地，所述非沉默突變位于這樣的區(qū)域，所述區(qū)域選自TRPV3基因的外顯子1-18中的一個或多個；優(yōu)選地，所述非沉默突變位于TRPV3基因的第13個和/或15個外顯子；優(yōu)選地，所述非沉默突變位于選自下列位置中的一個或多個位置c. 1717，c. 1703和c. 2074 ；優(yōu)選地，所述非沉默突變是選自下列突變中的一個或多個突變c. 1717G — A、c. 1717G — T、c. 1703G — T 和 c. 2074T — G。如果存在所述非沉默突變，則判斷受試者患有Olmsted綜合征。
12.檢測TRPV3基因的突變的方法，其包括使用權(quán)利要求7的診斷劑。
13.治療Olmsted綜合征的方法，其包括使用權(quán)利要求8或9的治療劑。
14.權(quán)利要求7的診斷劑在制備用于檢測TRPV3基因的突變和/或用于診斷Olmsted綜合征的試劑盒中的用途。
15.權(quán)利要求8或9的治療劑在制備用于治療Olmsted綜合征的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明鑒定了與Olmsted綜合征相關(guān)的致病基因-TPRV3基因。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的TRPV3基因及其用途，包含突變的TRPV3基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷或治療Olmsted綜合征的方法，用于所述方法的診斷劑或治療劑，以及包含所述診斷劑或治療劑的試劑盒。
文檔編號A61K39/395GK102994508SQ20111026973
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者楊勇, 林志淼, 張朋, 劉軒竹, 管李萍, 汪建, 楊煥明 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 北京大學(xué)第一醫(yī)院