專利名稱：一種來源于納豆的脂肪酶抑制劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酶抑制劑及其用途，特別涉及一種來源于納豆的脂肪酶抑制劑及其用途。本申請是申請?zhí)枮?00710175440. O的分案申請。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高以及生活方式的改變，肥胖已成為全球成年人最大的慢性疾病。據(jù)研究報(bào)道，肥胖與許多現(xiàn)代疾病直接相關(guān)，肥胖者患心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、冠心病、膽囊疾病、痛風(fēng)、呼吸道疾病、和某些腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)很大，而高血脂、內(nèi)臟脂肪更是諸多生活習(xí)慣病的元兇，因此肥胖不僅影響人的外觀體型，而且嚴(yán)重威脅到了人類的健康。目前，美國FDA只批準(zhǔn)了2種藥物可以長期用于肥胖癥治療西布曲明 (Sibutramine)和奧利司他(Orlistat)。西布曲明是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑， 它作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以減少攝食而降低體重，但該藥可能引起患者血壓升高、心率加快， 且不能用于冠心病、心率失常和卒中等病史的患者中，使該藥應(yīng)用受到限制。肥胖癥和高膽固醇血癥在一定程度上與脂肪攝入有關(guān)，飲食脂肪在胃腸道被脂肪酶尤其是胰脂肪酶水解為脂肪酸和甘油三酯才能被人體吸收。因此，對胰脂肪酶的抑制可以導(dǎo)致對脂肪吸收的抑制，進(jìn)而達(dá)到減肥降脂的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開一種來源于枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)微生物，尤其是納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto或Bacillus natto)的脂肪酶抑制劑，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開這種脂肪酶抑制劑的制備方法及用途。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明脂肪酶抑制劑的制備方法如下將納豆芽孢桿菌(保藏于“中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心”，位于北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏號為CGMCC2186，保藏日期2007 年9月25日)，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-48 小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-48小時(shí)；再將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，培養(yǎng)溫度為30-40°C，液體培養(yǎng)pH控制范圍4_9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離對于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入1-5重量倍的50% -95%乙醇，超聲30-90分鐘，濾出提取液，再加入1-3重量倍的50 % -95 %乙醇，第二次超聲30-90分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液；用60°C -90°C水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用1-4倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50°C -90°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；對于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用 80°c -10(TC水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用1-3倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C -90°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；濕菌體沉淀放-10°C -30°C冰箱冷凍15-30小時(shí)，置室溫解凍后加入1-3倍體積倍甲醇，超聲提取2次，每次30-90分鐘；合并兩次提取液，用 400C -70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。本發(fā)明脂肪酶抑制劑的優(yōu)選制備方法如下將納豆芽孢桿菌(保藏于“中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心”，位于北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏號為CGMCC2186，保藏日期2007 年9月25日)，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度37°C ±1°C，培養(yǎng)時(shí)間為22-26小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時(shí)；將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí)，或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 68-96小時(shí)，培養(yǎng)溫度均為37°C 土 1°C，液體發(fā)酵pH控制范圍為4. 5-8. 5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離對于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入2. 5重量倍的95%乙醇，超聲60分鐘，濾出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超聲60分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液；用80°C水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用2-3倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；對于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用 80-10(TC水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用2倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得氯仿萃取物；濕菌體沉淀放_20°C冰箱冷凍24小時(shí)，置室溫解凍后加入2-3體積倍甲醇，超聲提取2次，每次 60分鐘；合并兩次提取液，用60°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。其中，上述培養(yǎng)基可以包含一種或多種碳源和一種或多種氮源和任選營養(yǎng)無機(jī)鹽和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、鹿糖、糊精、糖蜜、甘油，優(yōu)選葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆餅粉、花生粉、花生餅粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麥芽提取物、玉米漿，固體培養(yǎng)優(yōu)選大豆，液體培養(yǎng)優(yōu)選大豆蛋白胨；營養(yǎng)無機(jī)鹽包括但不限于磷酸鹽磷酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫銨、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸銨、碳酸鈣，優(yōu)選磷酸氫鈉、氯化鈣和硫酸鎂。其中，上述提取分離技術(shù)中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶劑可以用其他水不混溶劑如乙酸丁酯、二氯甲烷等，或水可混溶劑丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、異丙
醇等代替。本發(fā)明的脂肪酶抑制劑是通過培養(yǎng)枯草芽孢桿菌屬微生物(Bacillussubtilis) 尤其是納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto或Bacillusnatto)來獲得,包括枯草芽孢桿菌屬微生物的誘變育種菌種；本發(fā)明是通過抑制脂肪酶活性而達(dá)到減肥降脂的目的， 其新穎性在于①該脂肪酶抑制劑來源于食用納豆，對人體沒有毒副作用該脂肪酶抑制劑選擇性地作用于胃腸道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而對蛋白酶和淀粉酶等沒有抑制作用。下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例I :本發(fā)明納豆脂肪酶抑制劑對脂肪酶抑制作用實(shí)驗(yàn)I、制備樣品溶液定量稱取上述納豆提取物(或濃縮物)I. 000克，用5毫升95%乙醇溶液溶解，不溶物離心去除，再用95%乙醇適當(dāng)稀釋，稀釋濃度見表1，取稀釋液I毫升按照下述脂肪酶活力抑制率的測定方法檢測。2、脂肪酶活力抑制率的測定A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22. 5g，研磨均勻，加水研磨至 300ml，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑在3 μ m以下，并不得有10 μ m的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8. Og,置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至 IOOml容量瓶中定容；O. lmol/L氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2. 0g，加水溶解定容至 500ml ；三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030g，用O. lmol/L鹽酸溶液調(diào)PH值至8. 0，加水至500ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8. O ；脂肪酶溶液的制備精密稱取胰脂肪酶(SIGMA L3126)于容量瓶中，用冷卻至5°C 以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每Iml中含胰脂肪酶100活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至不同梯度90u/ ml、80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml 的測定酶液；0u/ml 的測定酶液(酶空白)是在水浴中煮沸15-30分鐘的酶原液。B.建立脂肪酶測活體系1)95%乙醇為樣品空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置IOOml三角瓶中，加95%乙醇溶液1ml，用O. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ；2)樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水10ml， 置IOOml三角瓶中，加Iml上述樣品溶液，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O。C.繪制脂肪酶抑制率“Y%”與pH變化幅度“ ΛρΗ”關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(% ) = (X0-Xn)/X0Υ(% )-表示脂肪酶抑制率X0-表示酶原液濃度(u/ml)Xn-表示不同稀釋度的酶液濃度(u/ml)；設(shè)定酶濃度為零時(shí)，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為O，將酶原液按一定梯度稀釋成 90u/ml、80u/ml >7Ou/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、IOu/ml 的測定酶液，則對應(yīng)的抑制率Y%分別為10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%； 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法如下將上述95%乙醇空白溶液脂肪酶測活體系在37°C水浴中保溫10分鐘，用O. Imol/ L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ;精密量取上述不同梯度濃度的測定酶液I體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在37°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時(shí)記錄反應(yīng)前后pH值，并計(jì)算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100u/ml時(shí)反應(yīng)前后的pH差值,分別減去酶濃度為90u/ml、 80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml、0u/ml 時(shí)反應(yīng)前后的 pH 差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的PH變化幅度“ ΛρΗ”值；以抑制率為縱坐標(biāo)，“ ΛρΗ”值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率“Υ%”與pH變化幅度“ΛρΗ”關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到95%為空白樣品溶液的脂肪酶抑制率計(jì)算公式。D.測定方法及樣品溶液脂肪酶抑制率的計(jì)算空白溶液測定將上述95%乙醇空白溶液脂肪酶測活體系在37°C水浴中保溫10 分鐘，用O. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ;精密量取酶原液Iml加至空白溶液測活體系中，在37°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時(shí)記錄反應(yīng)前后pH值，并計(jì)算空白溶液反應(yīng)前后的PH差值，記為Al ;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液I體積份，照上述方法測定作酶空白對照，PH差值記為AO ;則空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值為Λ A = Al-AO ；樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在37°C水浴中保溫10分鐘，用 O. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ;精密量取酶原液I體積份加至樣品溶液測活體系中，在37°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時(shí)記錄反應(yīng)前后pH值，并計(jì)算樣品溶液反應(yīng)前后的 PH差值，記為BI ;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液I體積份，照上述方法測定作酶空白對照，PH差值記為BO ;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為ΛΒ = B1-B0 ；測定樣品的脂肪酶抑制率的計(jì)算用空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值(ΛΑ)減去樣品溶液酶反應(yīng)的PH變化值(ΛΒ)，即得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的“ Λ pH”值，即ΛρΗ = Λ A-Λ B，將此“ Λ pH”值代入上述相應(yīng)的空白溶液的脂肪酶抑制率計(jì)算公式，即求得測定樣品的脂肪酶抑制率，結(jié)果見表I :表I納豆提取物的脂肪酶活力抑制率
測定樣品樣品濃度(mg/ml)脂肪酶活力抑制率(％)乙酸乙酯萃取物20. 260. 4氯仿萃取物20. 471. 7乙醇提取物20. I49. I甲醇提取物20. 455. 4實(shí)驗(yàn)例2 :本發(fā)明納豆脂肪酶抑制劑對脂肪酶抑制作用實(shí)驗(yàn)定量稱取上述納豆提取物(或濃縮物)I. 000克，用5毫升95%乙醇溶液溶解，不溶物離心去除，再用95%乙醇適當(dāng)稀釋，稀釋濃度見表2，取稀釋液I毫升按照下述脂肪酶活力抑制率的測定方法檢測。2、脂肪酶活力抑制率的測定A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030g，用0. lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8. 5，加水約500ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8. 5，定容至500ml ；橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22. 5g，研磨均勻，加水研磨至 300ml，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑在3 μ m以下，并不得有10 μ m的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8. Og,置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至 IOOml容量瓶中定容；O. lmol/L氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2. 0g，加水溶解定容至 500ml ；脂肪酶溶液的制備精密稱取胰脂肪酶(SIGMA L3126)于容量瓶中，用冷卻至5°C 以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每Iml中含胰脂肪酶100活力單位的溶液，作為測定酶液備用。B.建立脂肪酶測活體系I).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水 10ml，置IOOml三角瓶中，加甲醇溶液lml，用O. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水 10ml，置IOOml三角瓶中，加樣品溶液1ml，用O. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0。C.脂肪酶活力的測定及抑制率的計(jì)算I)空白溶液脂肪酶活力的測定將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37°C水浴中保溫10分鐘，用O. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ;精密量取上述測定酶液1ml，在 37°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，立即加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0. Imol/ L氫氧化鈉滴定液滴定至測定體系溶液變?yōu)榉凵?記錄消耗0. lmol/L氫氧化鈉滴定液的量 (ml)，記為Al。另取在水浴中煮沸15分鐘的測定酶液1ml，按照上述方法測定作為酶空白對照，記錄消耗0. lmol/L氫氧化鈉滴定液的量(ml)記為A0。2)樣品溶液脂肪酶活力的測定將上述樣品溶液脂肪酶測活體系在37°C水浴中保溫10分鐘，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9. O ;精密量取上述測定酶液1ml，在 37°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，立即加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0. Imol/ L氫氧化鈉滴定液滴定至測定體系溶液變?yōu)榉凵?記錄消耗0. lmol/L氫氧化鈉滴定液的量 (ml)，記為BI。另取在水浴中煮沸15分鐘的測定酶液1ml，按照上述方法測定作為酶空白對照，消耗0. lmol/L氫氧化鈉滴定液的量(ml)，記為BO。測定樣品脂肪酶抑制率的計(jì)算
抑制率丫％= (I- B1~B0 ) X 100%
Al-AO結(jié)果見表2:表2納豆提取物的脂肪酶活力抑制率
測定樣品樣品濃度(mg/ml)脂肪酶活力抑制率(％)乙酸乙酯萃取物20. 255. 8氯仿萃取物20. 475. 3乙醇提取物20. I40. 權(quán)利要求
1.一種脂肪酶抑制劑，其特征在于該脂肪酶抑制劑來源于枯草芽孢桿菌屬微生物，尤其是納豆芽孢桿菌。
2.如權(quán)利要求I所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于該脂肪酶抑制劑由如下方法制成將納豆芽孢桿菌，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間為 16-48小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-48小時(shí)；再將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí),或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，培養(yǎng)溫度為30-40°C，液體培養(yǎng)pH控制范圍4_9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離；對于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入1-5重量倍的50% -95%乙醇，超聲30-90分鐘， 濾出提取液，再加入1-3重量倍的50% -95%乙醇，第二次超聲30-90分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液；用60°C _90°C水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用1-4倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50°C -90°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；對于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用 80°C -10(TC水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用1-3倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C -90°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；濕菌體沉淀放-10°C -30°C冰箱冷凍15-30小時(shí)，置室溫解凍后加入1-3倍體積倍甲醇，超聲提取2次，每次30-90分鐘；合并兩次提取液，用 400C -70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。
3.如權(quán)利要求2所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于該脂肪酶抑制劑由如下方法制成 將納豆芽孢桿菌，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度37°C 土1°C，培養(yǎng)時(shí)間為22-26 小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時(shí)；將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí)，或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí)，培養(yǎng)溫度均為37°C ±1°C，液體發(fā)酵pH控制范圍為4. 5-8. 5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離；對于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入2. 5重量倍的95%乙醇，超聲60分鐘，濾出提取液，再加入2重量倍的80 %乙醇，第二次超聲60分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液； 用80°C水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用2-3倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；對于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用80-100°C 水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用2倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得氯仿萃取物；濕菌體沉淀放_20°C冰箱冷凍24小時(shí)，置室溫解凍后加入2-3體積倍甲醇，超聲提取2次，每次60分鐘； 合并兩次提取液，用60°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。
4.如權(quán)利要求2或3所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于培養(yǎng)基可以包含一種或多種碳源和一種或多種氮源和任選營養(yǎng)無機(jī)鹽和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、 蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，優(yōu)選葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆餅粉、花生粉、花生餅粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麥芽提取物、玉米漿，固體培養(yǎng)優(yōu)選大豆，液體培養(yǎng)優(yōu)選大豆蛋白胨；營養(yǎng)無機(jī)鹽包括但不限于磷酸鹽磷酸氫鈉、磷酸氫鉀、 磷酸氫銨、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸銨、碳酸鈣，優(yōu)選磷酸氫鈉、氯化鈣和硫酸鎂。
5.如權(quán)利要求2或3所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于提取分離技術(shù)中所使用的乙醇、 乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶劑可以用其他水不混溶劑如乙酸丁酯、二氯甲烷或水可混溶劑 如丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、異丙醇代替。
6.如權(quán)利要求1-3任一所述的脂肪酶抑制劑的制備方法，其特征在于該方法如下將納豆芽孢桿菌，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-48 小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-48小時(shí)；再將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，培養(yǎng)溫度為30-40°C，液體培養(yǎng)pH控制范圍4_9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離；對于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入1-5重量倍的50% -95%乙醇，超聲30-90分鐘， 濾出提取液，再加入1-3重量倍的50% -95%乙醇，第二次超聲30-90分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液；用60°C _90°C水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用1-4倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50°C -90°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；對于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用 80°C -10(TC水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用1-3倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C -90°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；濕菌體沉淀放-10°C -30°C冰箱冷凍15-30小時(shí)，置室溫解凍后加入1-3倍體積倍甲醇，超聲提取2次，每次30-90分鐘；合并兩次提取液，用 400C -70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。
7.如權(quán)利要求6所述的脂肪酶抑制劑的制備方法，其特征在于該方法如下將納豆芽孢桿菌，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度37°C ± 1°C，培養(yǎng)時(shí)間為22-26小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時(shí)；將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí),或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí)， 培養(yǎng)溫度均為37°C ±1°C，液體發(fā)酵pH控制范圍為4. 5-8. 5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離對于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入2. 5重量倍的95%乙醇，超聲60分鐘，濾出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超聲60分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液； 用80°C水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用2-3倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；對于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用80-100°C 水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用2倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得氯仿萃取物；濕菌體沉淀放_20°C冰箱冷凍24小時(shí)，置室溫解凍后加入2-3體積倍甲醇，超聲提取2次，每次60分鐘； 合并兩次提取液，用60°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。
8.如權(quán)利要求6所述的脂肪酶抑制劑的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基可以包含一種或多種碳源和一種或多種氮源和任選營養(yǎng)無機(jī)鹽和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、 葡萄糖、蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，優(yōu)選葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆餅粉、花生粉、花生餅粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麥芽提取物、玉米漿，固體培養(yǎng)優(yōu)選大豆，液體培養(yǎng)優(yōu)選大豆蛋白胨；營養(yǎng)無機(jī)鹽包括但不限于磷酸鹽磷酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫銨、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸銨、碳酸鈣，優(yōu)選磷酸氫鈉、氯化鈣和硫酸鎂。
9.如權(quán)利要求6所述的脂肪酶抑制劑的制備方法，其特征在于提取分離技術(shù)中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇可以用乙酸丁酯、二氯甲烷水不混溶劑代替，或用丙酮、乙腈、 正丙醇、正丁醇、異丙醇水可混溶劑代替。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis)微生物，尤其是納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto或Bacillus natto)的脂肪酶抑制劑及其制備方法和用途。該脂肪酶抑制劑是先將納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)活化培養(yǎng)，再用固體發(fā)酵或液體發(fā)酵的方法制成含有抑制脂肪酶的活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物，再進(jìn)行提取分離，最終制成脂肪酶抑制劑。本發(fā)明是通過抑制脂肪酶活性而達(dá)到減肥降脂的目的，其新穎性在于①該脂肪酶抑制劑來源于食用納豆，對人體沒有毒副作用；②該脂肪酶抑制劑選擇性地作用于胃腸道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而對蛋白酶和淀粉酶等沒有抑制作用。
文檔編號A61K45/00GK102579507SQ20111027859
公開日2012年7月18日 申請日期2007年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日
發(fā)明者何大林, 段震文, 郭樹仁, 閆雪秋 申請人:北京北大維信生物科技有限公司