專利名稱：一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物有效成分的分離純化領(lǐng)域，具體的講是涉及一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法。
背景技術(shù)：
葛根別名鹿藿、雞齊，為野葛或粉葛的干燥根，是常用的中藥材，歷代以來本草均有記載，味甘、辛、性平，具有解肌退熱、生津、透疹、溫陽止瀉、提高機(jī)體免疫力等功能。目前，葛根廣泛用于改善心腦血管。治療腹瀉、糖尿病等重要復(fù)方制劑中，用量極大，是制劑的重要成分?！吨腥A人民共和國藥典》和《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中收錄大約有140余種葛根復(fù)方制劑，其中主要有葛根片劑、針劑等。實(shí)際上葛根主要有效成分為葛根總黃酮，尤其野葛含葛根總黃酮較多，主要作為葛根制劑、藥品、保健品等的原料。黃酮類化合物具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗過敏、抗輻射、抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗突變、以及增強(qiáng)免疫能力等廣泛的生理活性。能防治心腦血管系統(tǒng)的疾病和呼吸系統(tǒng)的疾病等，如對治療冠心病、 心絞痛、高血壓等有顯著效果，對防治心肌梗塞、心肌缺血，心律失常等也起重要療效。葛根黃酮廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中，且因其毒性較低及顯著獨(dú)特的生物活性，還被應(yīng)用到保健食品方面，即用作食品、化妝品的天然添加劑，如食用色素、甜味劑、抗氧化劑等。葛根多糖由于獨(dú)特的生理活性也備受人們青睞。葛根中含有的黃酮類化合物多以糖苷的形式存在，一般提取時多采用水、甲醇、乙醇溶液做提取溶劑，用正丁醇做萃取劑。另據(jù)報道，有人采用大孔吸附樹脂的方法提取分離黃酮類化合物，采用正丁醇萃取，使用的溶劑毒性較大，而且需重復(fù)三次，操作繁瑣；采用大孔吸附樹脂，前處理方法復(fù)雜，而且提取率較低，費(fèi)時。雙水相萃取技術(shù)(Aqueous two-phase extraction, ATPS)又稱水溶液兩相分配技術(shù)，是近年來出現(xiàn)的引人注目，極有前途的新型分離技術(shù)。ATPE技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，從1956年瑞典倫德大學(xué)Albertsson發(fā)現(xiàn)雙水相體系到1979年德國GBF的Kula等將雙水相萃取分離技術(shù)應(yīng)用于生物產(chǎn)品分離，雖然只有二、三十年的歷史，但由于其條件溫和， 質(zhì)量傳輸快，成本低，易操作，可調(diào)節(jié)，容易放大，可連續(xù)操作等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取體系相比較，雙水相萃取體系在生物物質(zhì)的分離中有獨(dú)到的優(yōu)越之處。迄今，雙水相體系已經(jīng)在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工等有機(jī)物分離提純方面得到了較為廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的高聚物/高聚物或高聚物/無機(jī)鹽雙水相體系，已經(jīng)成功用于分離和提取各種蛋白質(zhì) (多肽和酶)，分離和提取各種抗生素、氨基酸、金屬和中藥的有效成份等領(lǐng)域。在生物物質(zhì)分離過程中得到應(yīng)用的雙水相系統(tǒng)有兩類，一類是聚合物和聚合物雙水相體系，一類是聚合物和無機(jī)鹽雙水相體系。因?yàn)樗玫木酆衔餆o毒性，已被許多國家的藥典所收錄，而且其多元醇、多元糖結(jié)構(gòu)能使生物大分子穩(wěn)定，但在實(shí)際應(yīng)用中這兩類雙水相系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，這兩種體系對生物活性物質(zhì)變性作用低，界面吸附少，但是所用的聚乙二醇(簡稱PEG)和葡聚糖(簡稱Dextran)成本太高，而且體系黏度大，影響工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的進(jìn)展，目前真正工業(yè)化的例子還很少。因此，開發(fā)廉價的雙水相體系則成了雙水相萃取分離技術(shù)發(fā)展的方向。當(dāng)能與水混溶的普通的有機(jī)溶劑，如乙醇、異丙醇、丙酮等，加入到某些電解質(zhì)水溶液中，利用鹽離子的水化作用，使鹽離子奪取原來與有機(jī)溶劑水合的水分子而釋放出有機(jī)溶劑分子，可形成有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽雙水相體系。當(dāng)生物物質(zhì)或天然產(chǎn)物中的有效成分進(jìn)入雙水相體系時，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(憎水鍵、氫鍵和離子鍵)的存在和環(huán)境因素(濃度、溫度、PH值以及離子的種類和強(qiáng)度等)的影響，生物物質(zhì)或天然產(chǎn)物中的有效成分易在兩相間形成選擇性的分配。利用這一點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)生物物質(zhì)和天然產(chǎn)物中有效成分的提取、濃縮和分離。這類新型的萃取體系，在眾多領(lǐng)域中表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，中草藥有效成分分子中多具有疏水性結(jié)構(gòu)，因此雙水相萃取技術(shù)在中草藥有效成分分離純化中應(yīng)用是當(dāng)前研究的熱門。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供了一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，其不但避免了有毒溶劑的使用，提高了葛根中總黃酮的提取率，且能將粗提品中的黃酮與多糖進(jìn)行分離，達(dá)到純化葛根黃酮的目的，且方法本身操作簡單經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，包括有以下步驟
1)固液浸提將葛根藥材粉碎，加入浸取劑，葛根藥材與浸取劑固液比為Ig 5ml-Ig 30ml，加熱回流提取三次，每次1小時，合并三次提取后的濾液，得到葛根粗提液；
2)雙水相萃取取步驟1)所得葛根粗提液，濃縮至原濾液體積的1/5-1/4，加入無水乙醇/磷酸二氫鉀形成的雙水相體系，加水，使系統(tǒng)中無水乙醇質(zhì)量為系統(tǒng)總質(zhì)量的 16%-30%，磷酸二氫鉀質(zhì)量為系統(tǒng)總質(zhì)量的17%-22%，混勻，靜置后分為上下兩相，其中，分相溫度為300C -800C，分相時間為5-20分鐘，控制pH為5. 0-9. 0 ；
3)減壓蒸餾，真空干燥取出含有大量葛根總黃酮的乙醇上相，對其進(jìn)行減壓蒸餾，減壓蒸餾的溫度為70°C -80°C，最后在70°C -80°C下真空干燥，得到葛根總黃酮提取物。按上述方案，所述的浸取劑為質(zhì)量百分比濃度為50-90%甲醇溶液或者乙醇溶液。按上述方案，所述的無水乙醇與磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1:1-2:1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的雙水相萃取葛根黃酮的方法的優(yōu)點(diǎn)在于1)分相迅速，回收率高，在實(shí)驗(yàn)中觀察到，采用雙水相萃取法，約10分鐘即可分相，并且沒有乳化層，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且回收率高；2 )過程集成，雙水相萃取既達(dá)到了純化的目的，又濃縮了料液，濃縮倍數(shù)達(dá)到4倍以上；3)避免了有毒溶劑正丁醇的使用，采用了低度的無水乙醇，利用環(huán)保且節(jié)約了試劑；4)界面張力小，有助于兩相之間的質(zhì)量傳遞；5)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去，有利于純化樣品；6)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)純化工序可直接相連，無需進(jìn)行特殊處理。


圖1為乙醇/磷酸二氫鉀相圖； 圖2為葛根素對照品紫外吸收光譜圖； 圖3葛根黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1
1)固液浸提
取粉碎的葛根藥材約50. 0g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇加熱回流提取lh，固液比為1 g:10 ml，重復(fù)3次后過濾，合并濾液即得到葛根粗提液，加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得葛根樣品溶液；
2)雙水相萃取
取上述葛根樣品溶液，加入無水乙醇，磷酸二氫鉀分別為100 ml和53 g，加水，控制無水乙醇和磷酸二氫鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在乙醇/磷酸二氫鉀相圖(圖1)曲線的上方，使其中無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%，pH為5. 8，30°C放置5分鐘，靜置分相，分別測量上下相中總黃酮的含量；
3)葛根總黃酮測定
精密稱取干燥的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5. 3 mg，置于50 mL容量瓶中，95%乙醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)液。得到0. 106 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次移取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5、 3.0,3.5 mL于10 mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋定容，得到系列對照品溶液。根據(jù)圖2，得到標(biāo)準(zhǔn)品的最佳吸收波長為250 nm，將配置好的系列對照品溶液于250 nm處測其吸光度， 得到吸光度A與葛根黃酮濃度C(mg/mL)的線性關(guān)系，如圖3所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得，線性回歸方程為=A = 56. 5027C + 0. 01957 ； 線性回歸系數(shù)為R= 0.99936
步驟2)所得上相稀釋20倍后，測得上相吸光度為1. 508，根據(jù)回歸方程計算的濃度為 0. 526 mg/ml,步驟2)所得下相稀釋5倍后，測得吸光度為0. 923，計算得下相為濃度為 0. 08 mg/ml。利用紫外分光光度法測定雙水相萃取體系中葛根總黃酮的濃度，按公式(3)計算回收率Y:
(1)r=V±/VT(1)
(2)K = C 上/C 下(2)
(3)Y=RXK/(1+RXK) X 100%(3)
式中r為相比；V±和Vt*上下相的體積(ml) ;C±，C〒分別是上、下相中目標(biāo)分離物的質(zhì)量濃度(mg/ml) ；K為分配系數(shù)。當(dāng)r為1時，計算得總黃酮在乙醇相的收率為86. 8%; 3)濃縮萃取液
取出含有大量葛根總黃酮的乙醇上相，置于70°C減壓蒸餾，70°C真空干燥后得到葛根總黃酮提取物。實(shí)施例2: 1)固液浸提
取粉碎的葛根藥材約50. 0g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇加熱回流提取lh，固液比為1 g:15 ml，重復(fù)3次后過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，既得葛根樣品溶液。2)雙水相萃取取上述葛根樣品溶液，加入無水乙醇，磷酸二氫鉀分別為100 ml和55 g，加水，其中無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27. 8%，磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19. 4%，pH為6. 5，30°C放置10分鐘，靜置分相，經(jīng)計算，同實(shí)施例1，得總黃酮在乙醇相的收率為92. 8%。3)濃縮萃取液
取出無水乙醇相，置于70°C減壓蒸餾，70°C真空干燥后得到葛根總黃酮提取物。實(shí)施例3: 1)固液浸提
取粉碎的葛根藥材約50. 0g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇加熱回流提取lh，固液比為1 g:20 ml，重復(fù)3次后過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，既得葛根樣品溶液。2)雙水相萃取
取上述葛根樣品溶液，加入無水乙醇，磷酸二氫鉀分別為100 ml和50 g，加水，其中無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28. 3%，磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17. 9%，pH為5. 3，30°C放置15分鐘，靜置分相。經(jīng)計算，同實(shí)施例1，得總黃酮在乙醇相的收率為87. 1。3)濃縮萃取液
取出無水乙醇相，置于70°C減壓蒸餾，70°C真空干燥后得到葛根總黃酮提取物。
權(quán)利要求
1.一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，包括有以下步驟1)固液浸提將葛根藥材粉碎，加入浸取劑，葛根藥材與浸取劑固液比為Ig 5ml-Ig 30ml，加熱回流提取三次，每次1小時，合并三次提取后的濾液，得到葛根粗提液；2)雙水相萃取取步驟1)所得葛根粗提液，濃縮至原濾液體積的1/5-1/4，加入無水乙醇/磷酸二氫鉀形成的雙水相體系，加水，使系統(tǒng)中無水乙醇質(zhì)量為系統(tǒng)總質(zhì)量的 16%-30%，磷酸二氫鉀質(zhì)量為系統(tǒng)總質(zhì)量的17%-22%，混勻，靜置后分為上下兩相，其中，分相溫度為300C -800C，分相時間為5-20分鐘，控制pH為5. 0-9. 0 ；3)減壓蒸餾，真空干燥取出含有大量葛根總黃酮的乙醇上相，對其進(jìn)行減壓蒸餾，減壓蒸餾的溫度為70°C -80°C，最后在70°C -80°C下真空干燥，得到葛根總黃酮提取物。
2.按權(quán)利要求1所述的雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，其特征在于所述的浸取劑為質(zhì)量百分比濃度為50-90%甲醇溶液或者乙醇溶液。
3.按權(quán)利要求1或2所述的雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，其特征在于所述的無水乙醇與磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1:1-2:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，包括有以下步驟1)固液浸提將葛根藥材粉碎，加入浸取劑，加熱回流提取，合并濾液，得到葛根粗提液；2)雙水相萃取取步驟1)所得葛根粗提液，濃縮加入無水乙醇/磷酸二氫鉀形成的雙水相體系，加水，混勻，靜置后分為上下兩相；3)減壓蒸餾，真空干燥得到葛根總黃酮提取物。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1)分相迅速，回收率高；2)過程集成，雙水相萃取既達(dá)到了純化的目的，又濃縮了料液；3)避免了有毒溶劑正丁醇的使用；4)界面張力小，有助于兩相之間的質(zhì)量傳遞；5)有利于純化樣品；6)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)純化工序可直接相連，無需進(jìn)行特殊處理。
文檔編號A61P9/06GK102319282SQ20111028067
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者余軍霞, 張越非, 池汝安 申請人:武漢工程大學(xué)