專利名稱：抗呼吸道合胞病毒的人單克隆抗體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說是涉及一種病毒的單克隆抗體及其制備方法，更具體地說是涉及一種對抗呼吸道合胞病毒RSV的人單克隆抗體及其制備方法。所述抗體可用于增強人類對象抗RSV感染的耐受性以及降低已感染的個體體內(nèi)的感染水平或減輕RSV感染所引起的癥狀。
背景技術：
I、概述及致病機制呼吸道合胞病毒肺炎(respiratory syncytial virus pneumonia)簡稱合胞病毒肺炎，是一種有被膜的負鏈RNA病毒，屬于副粘液病毒(Paramyxo-viridae)科的肺病 毒(Pneumovirus)屬(Fenner, Virology 71 :371-378,1975；Huang et al., J. Virol. 43,1982)。RSV是一種小兒常見的間質性肺炎，多發(fā)生于嬰幼兒。由于母傳抗體不能預防感染的發(fā)生，出生不久的小嬰兒即可發(fā)病，但新生兒較少見。國外偶有院內(nèi)感染導致產(chǎn)科醫(yī)院新生兒病房爆發(fā)流行的報道。呼吸道合胞病毒(RSV，簡稱合胞病毒，也屬副粘病毒科)是引起小兒病毒性肺炎最常見的病原，可引起間質性肺炎，及毛細支氣管炎。在北京，48%的病毒性肺炎和58%的毛細支氣管炎系由合胞病毒引起(1980 1984);在廣州，小兒肺炎及毛細支氣管炎的31. 4%由合胞病毒引起(1973 1986);在美國，20% 25%的嬰幼兒肺炎和50% 75%的毛細支氣管炎由合胞病毒引起。RSV在電鏡下所見與副流感病毒類似，病毒顆粒大小約為150nm，較副流感病毒稍小，為RNA病毒，對乙醚敏感，無血球凝集性，在人上皮組織培養(yǎng)形成特有的合胞(syncytium)，病毒在胞漿內(nèi)增殖，可見胞漿內(nèi)包涵體。合胞病毒只有一個血清型，最近分子生物學方法證明有二個亞型。合胞病毒感染的潛伏期為2 8天(多為4 6天)。合胞病毒肺炎的典型所見是單核細胞的間質浸潤。主要表現(xiàn)為肺泡間隔增寬和以單核細胞為主的間質滲出，其中包括淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞。此外肺泡腔充滿水腫液，并可見肺透明膜形成。在一些病例，亦可見細支氣管壁的淋巴細胞浸潤。在肺實質出現(xiàn)伴有壞死區(qū)的水腫，導致肺泡填塞、實變和萎陷。少數(shù)病例在肺泡腔內(nèi)可見多核融合細胞，形態(tài)與麻疹巨細胞相仿，但找不到核內(nèi)包涵體。2、流行病學合胞病毒感染極廣。在北京用免疫熒光法測定血清IgG抗全的結果(1978):臍帶血陽性率93%，出生至I個月為89%，I 6個月為40%，2歲及3歲均達70%以上，4歲直至14歲均為80%左右陽性(補體結合測定與此一致)。由于母傳抗體不能完全地預防感染的發(fā)生，合胞病毒肺炎在出生后任何時候都可能發(fā)生。多見于3歲以下，I 6個月可見較重病例，男多于女。我國北方多見于冬春季，廣東則多見于春夏。由于抗體不能完全防止感染，合胞病毒的再感染極為常見，有人觀察10年，再感染發(fā)生率高達65%。合胞病毒的傳染性很強，有報道家庭成員相繼發(fā)生感染，在家庭內(nèi)發(fā)生時，年長兒及成人一般為上呼吸道感染。文獻報道院內(nèi)繼發(fā)合胞病毒感染率高達30% 50%。從全球來說，其中包括美國、歐洲、澳大利亞和日本，長期以來RSV感染都是一個大問題。對于早產(chǎn)兒、幼兒和老年人來說，RSV感染尤其麻煩，對于那些免疫系統(tǒng)功能下降的成年人來說也是如此。據(jù)估計，I歲以下的兒童至少約有2/3，1-4歲的幾乎所有兒童會發(fā)生慢性嚴重感染，這個因素被認為可在后期誘發(fā)兒童出現(xiàn)喘鳴和哮喘樣癥狀。近十年來合胞病毒肺炎及毛細支氣管炎占我國嬰幼兒病毒性肺炎第一位，其癥狀與副流感病毒肺炎、輕癥流感病毒肺炎及輕癥腺病毒肺炎臨床上幾乎無法區(qū)別。重癥流感病毒肺炎及重癥腺病毒肺炎則高熱持續(xù)，中毒癥狀及呼吸癥狀重，臨床表現(xiàn)遠較合胞病毒肺炎嚴重。
3、產(chǎn)品研發(fā)及發(fā)展趨勢RSV有兩個主要的表面糖蛋白，F(xiàn)和G。兩個糖蛋白(90KD和68KD)暴露于病毒粒子表面。90KD的高度糖基化的G蛋白負責將病毒顆粒結合到靶細胞上(Walsh et al. ,J. Gen.Virol. 65 =761-767,1984)。68KD F蛋白介導病毒被膜與細胞融合和合胞體形成(Walsh etal.，J. Gen. Virol. 66 :409-415,1985)。所述的F和G表面糖蛋白為主要的保護性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有較小的保護性活性。中和和抑制融合單克隆抗體也已被確定在F糖蛋白的特定區(qū)域(Walsh et al. , Infect, Tmmun. 43 :756-758,1984 ；Trudel et al. , J. Gen.Virol. 68 :2273-80,1987 ；Beeler et al. , J. Virol. 63 :2941-50,1989 ；Lopez et al.,J. Virol. 64 :927-30,1990 ；Paradiso et al. , Vaccine 9:231_7，1991)。抗 G 糖蛋白的單克隆抗體比抗F糖蛋白的單克隆抗體不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性(Norrbyet al. , proc.Natl. Acad. Sci. USA 84 :6572-6576,1987 ;Garcia_Barreno et al.,J. Virol. 63 :925-932,1989 ；ffalsh et al.，J. Gen. Virol. 70 :2953-2961,1989)。F 糖蛋白的氨基酸序列在與人感染有關的RSV亞組間有大約90%的保守性(Toms，F(xiàn)EMSMicro-bioI.Immunol. 76 :243-256,1991)。過去人們將努力集中在開發(fā)減毒的活病毒疫苗上。但由于效果不佳，未充分減毒或是遺傳上不穩(wěn)定，最近人民將努力集中在RSV表面糖蛋白F和G上。目前唯一上市的抗RSV單克隆抗體只批準用于預防早產(chǎn)兒感染RSV，是抗F蛋白的抗體。該抗體的名稱是帕利珠單抗(Synagis ，MedImmune制造)，其作用廣譜,但目前每次給藥所需帕利珠單抗的劑量為15mg/kg(體重)，由于單克隆抗體生產(chǎn)工藝要求高，且制作昂貴，故目前市售產(chǎn)品價格偏高，在我國難以大批量推廣生產(chǎn)。由此，需要一種防止或治療RSV疾病的有效方法，且提供特異性更高、生產(chǎn)工藝更經(jīng)濟，給藥劑量更低，價格更低廉的產(chǎn)品以滿足目前廣大的社會需求。本發(fā)明探索滿足此需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所需要解決的技術問題是提供了新的對呼吸道合胞病毒RSV融合蛋白的人單克隆抗體及其制備方法，即一種新的抗RSV人單克隆抗體及其制備方法，以克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷。也就是說，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，通過大量生物技術實驗等實踐研究以及文獻檢索和理論研究，目的之一意在提供一類親和力更高的抗RSV人單克隆抗體，即提供一類用于治療RSV疾病的低劑量高效單克隆抗體，特別是可以用于預防和/或治療RSV疾病的人單克隆抗體，其特異性針對RSV的F糖蛋白。優(yōu)選地，該單克隆抗體是基本上純的形式，不含其它的免疫物質。本發(fā)明提供了一種抗RSV人單克隆抗體，包括人源恒定區(qū)，其重鏈可變區(qū)選擇SEQIDNO 1 ;其輕鏈可變區(qū)選自SEQ ID NO :2。優(yōu)選地，所述的單克隆抗體與所述序列同源性為98%或 95%。另一方面，本發(fā)明提供含有一種或多種單克隆抗體和合適載體或稀釋劑的組合物。在本發(fā)明也提供了含有該細胞系的組合物，該組合物含有該細胞系及能維持該細胞系的營養(yǎng)培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基含有碳源，氮源，且如果需要，還含有維生素和/或有機鹽。 本發(fā)明的目的之二是提供一種治療或防止RSV在宿主中感染的方法，該方法包括給宿主施用足以達到治療或防止疾病量的本發(fā)明抗體。另一方面，本發(fā)明還包括用于預防或治療RSV的藥物組合物，其中包括降低炎癥反應，該組合物包含本發(fā)明的單個抗體或免疫反應性片段作為活性劑，或者本發(fā)明的不超過兩個抗體或片段作為活性劑。本發(fā)明的其他方面包括使用抗體治療人類對象RSV感染或誘導這些對象對RSV耐受的方法。本發(fā)明的目的之三是一種含有所述的人單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段的制備方法。本發(fā)明的單克隆抗體可利用重組方法制備，因此此發(fā)明還包括用于制備單克隆抗體的重組材料以及用于制備這些抗體的細胞系或永生細胞。另一方面，本發(fā)明提供了一種繁殖本發(fā)明雜交瘤細胞系的方法，包括將此細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育。繁殖方法也代表生產(chǎn)可以從培養(yǎng)基分離的本發(fā)明抗體的方法。優(yōu)選，本發(fā)明雜交瘤細胞系的繁殖是體外進行的。其中該細胞系是在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育的。本發(fā)明細胞的適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源、氮源和如果需要，還含有維生素和/或無機鹽。如，可以使用補有10%胎牛血清(SIGMA)的RPMI 1640培養(yǎng)基。另一種合適的培養(yǎng)基是Sigma無血清和無蛋白雜交瘤培養(yǎng)基。(一 )技術構思由于技術限制，目前市售的單克隆抗體類藥物一直價格偏高，限制其使用和推廣。因此，結合現(xiàn)有的單克隆抗體技術，進行改進和完善，特別是從低劑量高效的抗RSV人單克隆抗體及其制備方法等方面進行探索，具有非常重要的意義。根據(jù)此想法和思路，發(fā)明人通過反復的實驗研究與分析和理論探索，已成功得到預期的研究結果和應用產(chǎn)品抗RSV的人單克隆抗體。( 二)單克隆抗體的制備方法抗RSV人單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟I.雜交瘤的制備，包括A.小鼠免疫；
B.雜交瘤培養(yǎng)和篩選；2.單克隆抗體中和抗原能力比較及篩選；3.單克隆抗體的克隆和人源化；4.單克隆抗體表達質粒的構建；5.單克隆抗體的表達和純化。其中，所述的小鼠免疫的方法為A.通過雜交瘤技術篩選獲得表達抗RSV F蛋白的細胞株。在Capricon公司市售的含有RSV抗原的磷酸緩沖液(PBS) 120ul中加入120ul的弗氏完全佐劑(CFA)混合、乳化， 制作CFARSV抗原溶液240ul。再同樣的方法利用弗氏不完全佐劑(IFA)制作240ul的IFARSV抗原溶液；B.用240ul的FCA RSV抗原溶液向7_8周齡的BALB/C雌鼠進行腹腔注射，進行首次免疫。首次免疫后，隔2-3周用FIA RSV抗原溶液進行追加免疫。在分離脾細胞10天和3天前靜脈注射240ul RSV抗原(Capricon公司制)。在免疫第42天后取出脾，分離脾細胞，用PEG法1/1融合脾細胞和SP2-0鼠骨髓瘤細胞，制備雜交瘤。所述的雜交瘤培養(yǎng)和篩選的方法為A.無菌條件下將雜交瘤懸用HAT培養(yǎng)基調(diào)整濃度至3X106/ml，向96微孔板(Croming公司)各孔分裝鋪板，3X IO5/孔，IOOul/孔。96微孔板置于37°C>8% C02的二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，直至雜交瘤克隆出現(xiàn)；B.制備RSV抗原包被的ELISA篩選96孔板將RSV抗原(Capricon公司)用PH7. O并含有O. 1% (w/v)NaN3的磷酸緩沖液(PBS)稀釋，至濃度O. 5ug/ml，并分裝至空白的ELISA板中(NUNC公司)，IOOul/孔，2_8°C條件下靜置孵育過夜。孵育結束后的ELISA板用含O. 05% TffEEN 20的PBS緩沖液(簡稱清洗液)清洗3次，并控干殘液。再將含I %(w/v) BSA的PBS緩沖液(簡稱包被液)加入ELISA板中，300ul/孔，2_8°C條件下靜置孵育6小時以上再使用，如不及時使用則置于2-8°C條件下保存；C.檢測前去除ELISA板中的包被液，制備新鮮的包被液，再向各孔中加入60ul。取出待測的雜交瘤培養(yǎng)96孔板，在已經(jīng)長出克隆的各孔處做好標識和代碼，無菌條件下吸取40ul/孔的細胞培養(yǎng)上清，加入已經(jīng)包被好的ELISA板中，混合均勻并做好標識。ELISA板在室溫條件下輕輕晃動1-2個小時使免疫反應充分進行。移除反應液體，用清洗液洗滌ELISA板3次并控干殘液。用新鮮制備的包被液稀釋辣根過氧化酶(POD)標記的抗小鼠IgG多克隆抗體(SANTA CRUZ)，稀釋倍數(shù)為IX 104。在ELISA板每孔中加入120ul稀釋后的檢測抗體,室溫避光反應30分鐘。移除反應液體終止反應，用清洗液洗滌ELISA板3次并控干殘液，在每孔中加入IOOul反應底物鄰苯二胺(OPD)，室溫避光反應15分鐘，然后加入終止液終止反應。ELISA板用酶標儀(MD公司)檢測492nm波長的吸光值；D.篩選獲得3個表達較高的雜交瘤細胞株，編號為BW01-4H13、BW01-7B05和BW01-10E02,細胞擴增培養(yǎng)后冷凍保存在液氮中待用。所述的單克隆抗體中和抗原能力比較及篩選方法為對篩選雜交瘤細胞株獲得的三種抗RSV單克隆抗體的抗原中和能力進行確認。從美國標準生物品收藏中心(ATCC)購入三種RSV病毒株B1 wild-type株(10[4. 5]TCID (50) /ml)、A2 (10 [5. 5] TCID (50) /ml)和 Long 株(10 [6. 7] TCID (50) /ml)，獲得的 RSV 用含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(簡稱稀釋液)進行10倍稀釋。制備抗原萃取試劑0.4M NaCl、0. IM檸檬酸、IOmM 二硫蘇糖醇和O. I %聚氧乙烯新基苯基醚。將已稀釋的RSV病毒和抗原萃取試劑進行等體積混合,反應5-10分鐘后即獲得抗原萃取液。制備包被了抗小鼠IgG多克隆抗體(SANTA CRUZ)的瓊脂糖凝膠(GE)，膠體濃度為15% (v/v)的瓊脂糖凝膠溶液。并將凝膠溶液同萃取出的抗原進行混合，制備抗體滴度檢測混合試劑(檢測液)。將上述混合均勻的檢測液加入96微孔板(Croming公司，簡稱反應板)中，各孔分裝50ul，做好標記后待用。同時將BW01-4H13、BW01-7B05和BW01-10E02細胞株的等條件培養(yǎng)上清分別加入各孔中，150ul/孔。同時設立陽性對照組，即用等體積的清洗液代替三種抗體和檢測液反應，分別是三種陽性對照。然后室溫條件下輕輕震蕩混勻并孵育1-2小時，使三種病毒株提取的抗原和三種抗體充分反應。實驗前一天制備陽性檢測ELISA板在空白的ELISA板(NUNC公司)上包被羊抗RSV多克隆抗體(CHEMIC0N公司)，抗體用包被液稀釋至10ug/ml，IOOul/孔分裝在ELISA板，2_8°C條件下靜置孵育過夜。使用前用清洗液清洗陽性檢測ELISA板，控干殘液。從反應板中吸取反應混合液，并依次轉移至陽性檢測ELISA板中，每孔吸取IOOul，嚴格避免將凝膠吸出。做好對應標記后，將陽性檢測ELISA板 不斷輕輕晃動混勻，在室溫反應1-2小時，使包被的抗體充分捕獲游離的抗原分子。同時設立陰性對照，即利用清洗液和包被的抗體反應，作為檢測的本底值。利用清洗液的三次洗滌，終止免疫反應。用新鮮制備的包被液稀釋辣根過氧化酶(POD)標記的抗小鼠IgG多克隆抗體(SIGMA)，稀釋倍數(shù)為IX 102。在ELISA板每孔中加入IOOul稀釋后的檢測抗體，室溫避光反應30分鐘。移除反應液體終止反應，用清洗液洗滌ELISA板3次并控干殘液，在每孔中加入IOOul反應底物鄰苯二胺(OPD)，室溫避光反應20分鐘，然后加入終止液終止反應。ELISA板用酶標儀(MD公司)檢測492nm波長的吸光值；從吸光值結果可以得出，除4H13外，其余兩種抗體對于三種病毒株都有一定的中和作用，相比較而言中和能力的強弱依次為 7B05 > 10E02 > 4H13。所述的單克隆抗體的克隆和人源化的方法為A.按照RNesay試劑盒(Qiagen)的操作說明從2 X 107BW01-7B05雜交瘤細胞中提取總mRNA。使用寡-dT引物和逆轉錄酶制備單鏈cDNA，將cDNA的等分試樣用作聚合酶鏈式反應(PCR)的起始物質以擴增可變區(qū)的基因；B.單鏈 cDNA 的制備利用 Iug 總 mRNA 為模板，在 50mM Tris_cl、8mM Mg2Cl、30mMKC1PH8. 5的緩沖體系中，加入ImM 二硫蘇糖醇(DTT)、lmM dNTP、25個單位的人胎盤核糖核酸抑止劑、33uM隨機六聚體和10個單位的AMV逆轉錄酶，反應系統(tǒng)置于42°C反應1_2小時。7B05單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(VH)用引物P1(SEQID NO 1)和P2 (SEQID NO 2)進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增獲得，輕鏈可變區(qū)(VL)用引物P3(SEQ ID NO 3)和P4(SEQ ID NO:4)進行PCR擴增獲得；C. DNA 片段的 PCR 擴增以 Iug 單鏈 CRNA 為模板，在 IOmM Tris_cl、l· 5mM Mg2Cl、50mMKCl PH8. 5的緩沖體系中，加入ImM 二硫蘇糖醇(DTT)、0. 5mM dNTPs、IuM對應引物和2.5個單位的Taq酶(TAKARA)，反應系統(tǒng)置于PCR儀(THERMO) 94°C退火I分鐘、55°C引物結合2分鐘、72°C擴增2分鐘，25循環(huán)反應。擴增的DNA片段用酚氯仿抽提后用無菌純化水溶解、稀釋。DNA片段用EcoR I和BamH I (TAKARA)雙酶切后整合入質粒pUC18 (TAKARA)，操作說明見PUC18試劑盒。利用引物T7對擴增的產(chǎn)物DNA進行測序(上海美季生物技術公司)，證實其序列的準確性；D.將7B05的VH和VL序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，和多條已經(jīng)提交的人的VH和VL序列進行比較，選擇相似度最高的序列進行序列的人源化處理。通過比較，7B05的VH序列和人的IgG Cor序列相似度最聞，達到82% ;VL序列和人的IgG K102序列相似度最高，達到75%。人源化的結果要盡量提高人源化的程度同時盡量保持抗體對抗原識別位點的特異性和高親和力，因此在VH和VL的各自三個高度可變區(qū)(CD1、CD2和CD3)保留鼠源7B05抗體的序列，其余區(qū)域則采用人的IgG Cor序列和K102序列。所述的單克隆抗體表達質粒的構建的方法為A. 7B05單克隆抗體的恒定區(qū)序列(CH和CL)采用人的IgG Cor序列和K102序列相對應片段。其中CH片段的擴增模板為IgG Cor基因，CL片段的擴增模板為IgG K102基因。CH和CL片段采用序列拼接的方式獲得； B.片段的合成采用引物拼重疊延伸PCR，將如將片段I和2，3和4，5和6，7和8，9和10分別配對混合，進行重疊延伸PCR，在常規(guī)PCR條件下經(jīng)歷退火、引物識別配對和片段擴增得到1-2，3-4，5-6，7-8，9-10等重疊及延伸片段。同理將1_2和3_4，5_6和7_8拼接延伸，9-10片段輪空。經(jīng)多輪PCR后獲得1-10號片段。最終經(jīng)過多輪拼接后獲得輕重鏈片段。人源化的重鏈片段在Nhe I和Mlu I之間整合進入pIRES質粒(Clontech，質粒圖譜如圖I所示)的MCSA區(qū)間，輕鏈片段在Not I和Sal I之間整合進入pIRES質粒的MCSB區(qū)間。質粒經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)后，經(jīng)質粒抽提試劑盒(QIAGEN)制備后凍存待用。所述的單克隆抗體的表達和純化的構建的方法為A. 7B05單克隆抗體的獲得通過轉染CHO-Kl細胞(ATCC)，在藥物篩選的情況下獲得穩(wěn)定表達抗體蛋白的細胞株；B.轉染采用Invitrogen公司生產(chǎn)的IipofectamineTM 2000脂質體轉染試劑盒，按照說明書操作。轉染實驗的空白對照采用PlRES載體轉染CHO-Kl細胞。在培養(yǎng)基中加入G418(200uM)進行聯(lián)合加壓篩選，細胞置于8% C02、37°C條件下培養(yǎng)，3天更換一次培養(yǎng)基，去除死亡漂浮的細胞。連續(xù)培養(yǎng)20天后，細胞培養(yǎng)皿中出現(xiàn)分散成單一群落的細胞克隆，細胞去除培養(yǎng)基后用胰蛋白酶(INVITR0GEN)消化分離后按有限稀釋法轉移至96孔板培養(yǎng)篩選，盡量保證每孔中為單一細胞。96孔板置于8% C02、37°C條件下培養(yǎng)I周后取培養(yǎng)上清進行ELISA測定蛋白表達量；C.鼠抗人 TNFR 一抗(SIGMA)用 PH7. O 并含有 O. I % (w/v) NaN3 的 PBS (稀釋液)稀釋，稀釋倍數(shù)1X103。稀釋后的抗體加入待包被的ELISA板(CORING)，IOOul/孔，2_8°C過夜。ELISA板用含O. 05% TffEEN 20的PBS緩沖液(簡稱清洗液)清洗三次，每孔加入IOOul 5% (w/v)BSA磷酸鹽緩沖液室溫作用1_2小時，待檢測的細胞培養(yǎng)上清加入ELISA板中，IOOul/孔，室溫靜置反應1-2小時孵育。棄去反應液，用清洗液清洗三次，加入稀釋液稀釋1000倍的鼠抗人IgG-Fc/HRP 二抗(SIGMA)，150ul/孔，室溫靜置孵育1_2小時后TMB試劑(PERCE)顯色，450nm測OD值。以新鮮培養(yǎng)基為陰性對照；D.選擇表達水平最高的多個克隆擴增至24孔板，培養(yǎng)3天后檢測蛋白表達，檢測采用上述的ELISA檢測。選擇表達量高的10個克隆持續(xù)擴增培養(yǎng)，保持細胞篩選條件不變(G418(200uM)和MSX(50ug/ml));多輪擴增后選擇表達水平最高的6個克隆擴增至T75培養(yǎng)瓶中，將細胞株建立細胞庫并低溫保藏。同時將表達水平最高的克隆BW-7B05-3接種到2L轉瓶中，用含5%小牛血清(INVITROGEN)的EX-CELL 302培養(yǎng)基(SIGMA)培養(yǎng)，待細胞長滿瓶壁時，換為無血清培養(yǎng)基EX-CELL 302，隔天收液，連續(xù)收液3_5次；E.利用蛋白A對IgG的特異性吸附作用，采用分離介質rProteinA Sepharose4Fast Flow(GE)對收獲的細胞培養(yǎng)上清進行親和層析，純化表達蛋白。操作方法參見產(chǎn)品說明。純化后，以紫外分光光度計測定A260和A280值。蛋白定量公式蛋白含量(mg/ml)=0D280 值 X I. 45-0D260 值 XO. 74。(三)主要用途與技術特長本發(fā)明為醫(yī)藥等行業(yè)提供了一種新的抗RSV人單克隆抗體及其制備方法，從而拓展了呼吸道合胞病毒肺炎新治療或預防產(chǎn)品的應用。本發(fā)明抗RSV人單克隆抗體是安全的，能夠用于醫(yī)療、診斷等工業(yè)和行業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)和應用。 與現(xiàn)有的抗RSV疾病產(chǎn)品相比，本發(fā)明抗RSV人單克隆抗體在實際應用等方面，可大大降低單位給藥劑量，減少生產(chǎn)成本等顯著特點。因此，本發(fā)明所述方法的成功開發(fā)對于疫苗的研發(fā)中抗原表位這一有效組分的檢測有著重要的意義，同時該方法也為RSV疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準確、簡便、有效的監(jiān)測手段，具有廣泛的應用范圍和社會需求?？傊?，本發(fā)明積極適應了現(xiàn)代生物、預防保健、臨床診斷等領域的工作需要和人性化服務的需要，本發(fā)明為研究開發(fā)該抗RSV人單克隆抗體，對改進和提高現(xiàn)有的治療或預防RSV疾病產(chǎn)品具有重要價值。


圖I為pIRES表達載體的基因圖譜。圖2為PIRES表達載體的多克隆位點及酶切點圖譜。圖3為每微克人源化7B05單克隆抗體和Synagis抗體對應的蝕斑的絕對數(shù)結果。圖4為人源化7B05單克隆抗體和Synagis對RSV-Bl病毒株的中和作用的對比圖。
具體實施例方式本發(fā)明研究了現(xiàn)有的RSV疾病治療或預防方法，提供了一種新的抗RSV的人單克隆抗體，便于現(xiàn)代生物、預防保健、臨床診斷等領域的安全使用。本發(fā)明最終需要制備成抗RSV人單克隆抗體進行應用，下面將列舉實施例進行進一步說明。如有問題，可以與發(fā)明人直接聯(lián)系。上述提供的一些實驗數(shù)據(jù)以及下列實施例中按前述發(fā)明內(nèi)容給出幾種抗RSV人單克隆抗體及其制備方法及一些試驗研究內(nèi)容，但應該理解本發(fā)明并不僅限于此處所列出的研究內(nèi)容，還應該理解此處所使用的術語僅用于描述特定的實施例，而并不是對本發(fā)明的限定。也就是說，在本發(fā)明中，以上所述的具體實施方式
和以下所述的實施例均是為了更好地闡述本發(fā)明，特別是這些實施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，不能解釋為了對本申請的限制或者用來限制本發(fā)明的保護范圍。為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合如下實施例對本發(fā)明作詳細描述。
實施例I雜交瘤的制備I.小鼠免疫通過雜交瘤技術篩選獲得表達抗RSV F蛋白的細胞株。在Capricon公司市售的含有RSV抗原的磷酸緩沖液(PBS) 120ul中加入120ul的弗氏完全佐劑(CFA)混合、乳化，制作CFARSV抗原溶液240ul。再同樣的方法利用弗氏不完全佐劑(IFA)制作240ul的IFARSV抗原溶液。用240ul的FCARSV抗原溶液向7_8周齡的BALB/C雌鼠進行腹腔注射，進行首次免疫。首次免疫后，隔2-3周用FIARSV抗原溶液進行追加免疫。在分離脾細胞10天和3天前靜脈注射240ul RSV抗原(Capricon公司制)。在免疫第42天后取出脾，分離脾細胞，用PEG法1/1融合脾細胞和SP2-0鼠骨髓瘤細胞，制備雜交瘤。2.雜交瘤培養(yǎng)和篩選 無菌條件下將雜交瘤懸用HAT培養(yǎng)基調(diào)整濃度至3X106/ml，向96微孔板(Croming公司)各孔分裝鋪板，3X IO5/孔，IOOul/孔。96微孔板置于37°C>8% C02的二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，直至雜交瘤克隆出現(xiàn)。制備RSV抗原包被的ELISA篩選96孔板將RSV抗原(Capricon公司)用PH7. O并含有O. 1% (w/v)NaN3的磷酸緩沖液(PBS)稀釋，至濃度O. 5ug/ml，并分裝至空白的ELISA板中(NUNC公司)，100ul/孔，2-8°C條件下靜置孵育過夜。孵育結束后的ELISA板用含O. 05% TffEEN 20的PBS緩沖液(簡稱清洗液)清洗3次，并控干殘液。再將含1% (w/v)BSA的PBS緩沖液(簡稱包被液)加入ELISA板中，300ul/孔，2_8°C條件下靜置孵育6小時以上再使用，如不及時使用則置于2-8°C條件下保存。檢測前去除ELISA板中的包被液，制備新鮮的包被液，再向各孔中加入60ul。取出待測的雜交瘤培養(yǎng)96孔板，在已經(jīng)長出克隆的各孔處做好標識和代碼，無菌條件下吸取40ul/孔的細胞培養(yǎng)上清，加入已經(jīng)包被好的ELISA板中，混合均勻并做好標識。ELISA板在室溫條件下輕輕晃動1-2個小時使免疫反應充分進行。移除反應液體，用清洗液洗滌ELISA板3次并控干殘液。用新鮮制備的包被液稀釋辣根過氧化酶(POD)標記的抗小鼠IgG多克隆抗體(SANTA CRUZ)，稀釋倍數(shù)為IX 104。在ELISA板每孔中加入120ul稀釋后的檢測抗體，室溫避光反應30分鐘。移除反應液體終止反應，用清洗液洗滌ELISA板3次并控干殘液，在每孔中加入IOOul反應底物鄰苯二胺(OPD)，室溫避光反應15分鐘，然后加入終止液終止反應。ELISA板用酶標儀(MD公司)檢測492nm波長的吸光值。篩選獲得3個表達較高的雜交瘤細胞株，編號為BW01-4H13、BW01-7B05和BW01-10E02,細胞擴增培養(yǎng)后冷凍保存在液氮中待用。實施例2單克隆抗體中和抗原能力比較對篩選雜交瘤細胞株獲得的三種抗RSV單克隆抗體的抗原中和能力進行確認。從美國標準生物品收藏中心(ATCC)購入三種RSV病毒株B1 wild-type株(10[4. 5]TCID (50) /ml)、A2 (10 [5. 5] TCID (50) /ml)和 Long 株(10 [6. 7] TCID (50) /ml)，獲得的 RSV 用含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(簡稱稀釋液)進行10倍稀釋。制備抗原萃取試劑0. 4M NaCUO. IM檸檬酸、IOmM 二硫蘇糖醇和O. I %聚氧乙烯新基苯基醚。將已稀釋的RSV病毒和抗原萃取試劑進行等體積混合，反應5-10分鐘后即獲得抗原萃取液。
制備包被了抗小鼠IgG多克隆抗體(SANTA CRUZ)的瓊脂糖凝膠(GE)，膠體濃度為15% (v/v)的瓊脂糖凝膠溶液。并將凝膠溶液同萃取出的抗原進行混合，制備抗體滴度檢測混合試劑(檢測液)。針對抗原萃取液的濃度和病毒滴度，緩和方案如下表所示(表一)表一各抗原萃取液緩和方案
權利要求
1.一種抗RSV人單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段，包括人源恒定區(qū)，其重鏈可變區(qū)選擇SEQ ID NO : I ;其輕鏈可變區(qū)選自SEQ ID NO :2。
2.如權利要求I所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段，其與權利要求I所述的序列同源性為98%或95%。
3.如權利要求I所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段為特異性針對RSVF蛋白的抗體。
4.如權利要求I所述的抗RSV人單克隆抗體是基本上純的形式，不含其它的免疫物質。
5.一種DNA分子，它編碼權利要求I所述的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO :1。
6.一種DNA分子，它編碼權利要求I所述的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO :2。
7.一種載體或稀釋劑的組合物，包含如權利要求I所述的一種或多種單克隆抗體或其 保守性突變體或其活性片段。
8.一種雜交瘤細胞系，可獲得如權利要求I所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。
9.如權利要求8所述的細胞系，還含有該細胞系及能維持該細胞系的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
10.如權利要求9所述的細胞系，其所述的的營養(yǎng)培養(yǎng)基可為碳源或氮源。
11.如權利要求8所述的細胞系，其所述的營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有維生素和/或有機鹽。
12.—種治療或防止RSV在宿主中感染的方法，該方法包括給宿主施用足以達到治療或防止疾病量的如權利要求I所述的抗體或其保守性突變體或其活性片段。
13.一種預防或治療RSV的藥物組合物，該組合物如權利要求I所述的單個抗體或免疫反應性片段作為活性劑。
14.如權利要求13所述的組合物，還包括不超過兩個如權利要求I所述的抗體或片段作為活性劑。
15.如權利要求13所述的組合物，其作用在于降低炎癥反應。
16.一種含有權利要求I所述的人單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段的制備方法。
17.如權利要求16所述的方法為用基因重組方法。
18.一種繁殖本權利要求8的雜交瘤細胞系的方法，包括將此細胞系在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育。
19.如權利要求18所述的方法，包括從培養(yǎng)基分離的權利要求I所述的抗體或其保守性突變體或其活性片段的方法。
20.如權利要求18的方法，所述的雜交瘤細胞系的繁殖是體外進行的。
21.如權利要求18的方法,所述的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源、氮源。
22.如權利要求18的方法，所述的營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有維生素和/或無機鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說是涉及一種病毒的單克隆抗體及其制備方法，更具體地說是涉及一種對抗呼吸道合胞病毒RSV的人單克隆抗體及其制備方法。所述抗體可用于增強人類對象抗RSV感染的耐受性以及降低已感染的個體體內(nèi)的感染水平或減輕RSV感染所引起的癥狀，且給藥劑量較目前市售產(chǎn)品低。
文檔編號A61P31/14GK102850454SQ20111028966
公開日2013年1月2日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權日2011年9月27日
發(fā)明者張愛暉, 吳克, 徐亞南 申請人:上海博沃生物科技有限公司