專利名稱：山香圓葉乙醇滲漉提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種山香圓葉乙醇滲漉提取物及其制備方法和用途。
背景技術：
目前流行性感冒病毒日益嚴重，并且流行性感冒病毒與呼吸道疾病及引起的全身性疾病密切相關，我國是流感高發(fā)國家之一，不但人口眾多，而且生活習慣也有利于流感病毒的轉播，每年人平均發(fā)病次數達到O. 3 O. 7次不等，重點人群達到2 4次。流感對人類存在嚴重威脅，尤其是新發(fā)品種流感病毒，其不但引起繼發(fā)性其它微生物感染，而且會直接導致器官破壞和變態(tài)反應致人死亡。但目前并沒有有效的治療流行性感冒病毒及其疾病(流感)的方法和治療手段，如針對臨床癥狀進行炎癥反應治療，治標不治本。目前最常見的預防和治療流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接種，非特異性抗病毒中藥或西藥磷酸奧司他韋(達菲)_神經氨酸酶抑制劑。然而流感病毒疫苗預防接種弊端在于接種人群有選擇性，不是人人可以接種。此外，流感病毒疫苗保護率不高，保護時間也較短(3 6個月)。目前大多數非特異性抗病毒中藥雖然宣稱有抗病毒作用，但是并非針對流感病毒，且抗病毒作用機理不清楚。在我們以往研究的許多種治療外感風寒，西醫(yī)所認為的感冒的中藥組方并沒有直接抗流感病毒的作用。簡單的說，不是所有的治療感冒的中藥組方都有明確的抑制流感病毒的作用。西藥“磷酸奧司他韋(達菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨基-3(1-丙氧乙酯)-1_環(huán)己烯-I羧酸乙酯磷酸鹽)”是神經氨酸酶抑制劑，對流感病毒進入細胞有特異性抑制作用，但是不僅價格昂貴，而且有一些患者服用后出現嘔吐、惡心、失目民、頭痛、腹痛、腹瀉、頭暈、疲勞、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反應。達菲是在體內被位于肝臟和腸道的酯酶轉化為活性代謝產物而起著抑制神經氨酸酶作用，如果患者肝臟和腸道器官功能不正常也將影響其藥效，腎功能不全患者也要慎用。因此，針對性抑制流感病毒復制、抑制流感病毒神經氨酸酶水解細胞表面唾液酸，從而導致流感病毒不能與細胞表面受體結合而進入細胞內，以及減少流感病毒在細胞內的產生將是治療流感病毒性感冒的病因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種山香圓葉乙醇滲漉提取物，抑制流感病毒神經氨酸酶水解細胞表面唾液酸，導致流感病毒不能與細胞表面受體結合而進入細胞內，從而能有效的抑制流感病毒復制，更重要地是克服藥物的副反應弊端。本發(fā)明的另一目的是提供了一種山香圓葉乙醇滲漉提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供了山香圓葉乙醇滲漉提取物制備預防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供了含有山香圓葉乙醇滲漉提取物的藥物組合物。本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物，通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取 方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸潰12 72小時后，以I 8ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4 14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用30 85%乙醇作為提取劑，浸潰24 72小時后，以I 7ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 13倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用35 80%乙醇作為提取劑，浸潰24 48小時后，以I 6m/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 11倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用45 75%乙醇作為提取劑，浸潰48小時后，以I 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 10倍量的滲漉液，回 收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用55 70%乙醇作為提取劑，浸潰36小時后，以2 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰36小時后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用60 70%乙醇作為提取劑，浸潰12小時后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4 6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰72小時后，以4 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。本發(fā)明還提供了山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥物的用途。優(yōu)選的，用于抑制流感病毒。優(yōu)選的，用于抑制流感病毒FMl。優(yōu)選的，用于抑制神經氨酸酶。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。本發(fā)明還提供了一種山香圓葉乙醇滲漉提取物制劑，該制劑以所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物為主要活性成分。本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠提取出有效的抑制神經氨酸酶成分，山香圓葉乙醇滲漉提取物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經氨酸酶活性的能力，即神經氨酸酶抑制率的高低也相應發(fā)生變化，并且成正相關，山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠通過抑制流感病毒表面神經氨酸酶，進而抑制流感病毒進入細胞里面、抑制已經進入細胞里面的流感病毒復制、增殖，從而減少了流感病毒對細胞的感染、生長，以及預防和治療流感及其并發(fā)癥。
具體實施例方式本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物，其是通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸潰12 72小時后，以I 8ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4 14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例I制備方法取山香圓葉粗粉，用50%乙醇作為提取劑，浸潰24小時后，以7ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材11倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例2制備方法取山香圓葉粗粉，用60%乙醇作為提取劑，浸潰48小時后，以2ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例3制備方法取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰48小時后，以5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例4制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰36小時后，以2ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例5制備方法取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰36小時后，以4ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例6制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰12小時后，以3ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例7制備方法取山香圓葉粗粉，用80%乙醇作為提取劑，浸潰24小時后，以6ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實施例8制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰72小時后，以4ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實驗數據I、提取工藝優(yōu)化研究山香圓葉主要含黃酮類、有機酸等化合物，黃酮類化合物以乙醇提取效果較佳，因、此，我們以乙醇濃度(A)、收集乙醇量(B)、滲漉速度(C)、浸潰時間⑶四項作為考察因素，每一因素設三個水平，按L9(34)正交表進行正交實驗設計(表I、表2)對提取工藝進行優(yōu)化研究，考察指標為總黃酮提取率。表I因素水平表
子浸漬時間(h)收集乙醇量滲漉速度~乙醇濃度(％)
水平^"^ A_(倍)B_C_P17281 380%248102-460%
312123-670%取山香圓葉藥材27份，每組平均三份，共九組，按表1L9(34)正交試驗表設計試驗。結果見表2。表2L9 (34)正交試驗表
素"~~I"總黃酮含~總黃酮提取
試量(％)率(％)
111118.7159.69
212229.7266.64
3133310.8874.60
421239.5562.06
5223110.2570.25
Γ 623129.4264.56
731328.8060.29
83 2 1 3 10.1669.65 _9_3_3_2_I_9.7967.12
Kl200.93182.04193.9197.06
捍
^ Κ2196.87206.54195.82191.49 Κ3197.06206.28205.14206.31 __R4.06 24.511.2414.82方差分析將正交試驗結果進行方差分析，結果見表3。表3以總黃酮提取率為指標的方差分析
方差來源離差平方和自由度方差F值顯著性
誤差 e(A)3.5021.75B131.99265.9937.7*
C24.10212.056.9
_D_37.36_2_18.68_IOJ_Fl-O. 05(2,2) — 19. OFl-O. 01(2,2) — 99. O
結論直觀分析可知，收集乙醇量(B)對提取效果影響較大，浸潰時間(A)、滲漉速度(C)及乙醇濃度(D)對提取效果影響較小。表3方差分析結果進一步驗證了直觀分析結論，即因素B對提取效果有較大影響。結合K值分析，確定提取條件為取山香圓葉，用70%乙醇浸潰72小時后，以3 6ml/kg/分鐘滲漉，收集藥材10倍量滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實驗數據2 :山香圓葉乙醇滲漉提取物對神經氨酸酶活性的抑制作用取實施例4制備方法所獲得的山香圓葉乙醇滲漉提取物，加適量水使溶解，應用神經氨酸酶抑制劑鑒定試劑盒測定山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制神經氨酸酶(NI)的效價見表I。(I).標準曲線準備a.在96孔熒光酶標板內每孔加入70 μ I神經氨酸酶檢測緩沖液；b.每孔再分別加入O、I、2、5、7. 5、10 μ I Η5Ν1神經氨酸酶；c.每孔再加入O 20 μ IMilli-Q 水。(2).樣品檢測的準備a.在96孔熒光酶標板內每孔加入70 μ I神經氨酸酶檢測緩沖液；b.每孔再加入10 μ I Η5Ν1神經氨酸酶；c.每孔再加入O 10 μ I山香圓葉乙醇滲漉提取物樣品；d.每孔再加入O 10 μ I Milli-Q水。(3).檢測步驟a.振動混勻約Imin ；b. 37°C孵育2min使抑制劑和H5N1神經氨酸酶充分相互作用，做標準曲線的樣品也一起孵育；c.每孔加入10 μ I神經氨酸酶熒光底物；d.再振動混勻約Imin ；e. 37°C孵育20 30min后進行突光測定。激發(fā)波長為360nm,發(fā)射波長為440nm。(4).根據標準曲線計算出樣品對于H5N1神經氨酸酶的抑制百分比，以及做濃度曲線后計算出山香圓葉乙醇滲漉提取物對于H5N1神經氨酸酶的IC50。山香圓葉乙醇滲漉提取物達到對神經氨酸酶的抑制率IC50為13. 35mg/ml。見表4。表4.山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制神經氨酸酶的活性
權利要求
1.山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預防和治療流感并發(fā)癥疾病的藥物的用途，所述并發(fā)癥是指腎功能衰竭，其中所述提取物通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸潰12 72小時后，以I 8ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
2.如權利要求I所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用30 85%乙醇作為提取劑，浸潰24 72小時后，以I 7ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
3.如權利要求I或2所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用35 80%乙醇作為提取劑，浸潰24 48小時后，以I 6m/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
4.如權利要求3所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用45 75%乙醇作為提取劑，浸潰48小時后，以I 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
5.如權利要求3所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用55 70%乙醇作為提取劑，浸潰36小時后，以2 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5 8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
6.如權利要求5所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰36小時后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
7.如權利要求I所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用60 70%乙醇作為提取劑，浸潰12小時后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4 6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
8.如權利要求I所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰72小時后，以4 5ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預防和治療流感并發(fā)癥疾病的藥物的用途，所述并發(fā)癥是指腎功能衰竭，其中所述提取物通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25～90％乙醇作為提取劑，浸漬12～72小時后，以1～8ml/kg/分鐘的速度進行滲漉，收集藥材4～9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
文檔編號A61P31/16GK102631382SQ201110290528
公開日2012年8月15日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權日2010年4月13日
發(fā)明者劉地發(fā), 呂武清, 唐春山, 廖祝元, 李志勇, 楊小玲, 楊金火, 王燕平, 蔡元魁, 謝寧 申請人:江西山香藥業(yè)有限公司