專利名稱：一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽c1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有降壓效應(yīng)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽乳白肽Cl (LAP-Cl)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高血壓是目前最常見(jiàn)的心血管疾病之一，控制高血壓的發(fā)展進(jìn)程，有助于降低心血管系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在這一病因中，腎素-血管緊張素這一升壓酶系是高血壓發(fā)病的一個(gè)最重要因素。目前作用于這一環(huán)節(jié)的化學(xué)藥品很多，雖然療效不錯(cuò)，但均有不同程度的毒副作用。近年來(lái)天然食品蛋白來(lái)源的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，因其無(wú)毒副作用有望成為控制高血壓病程的理想選擇而備受關(guān)注，正在成為防治高血壓的研究熱點(diǎn)。天然食品蛋白來(lái)源的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽大致來(lái)源于動(dòng)物蛋白、植物蛋白、微生物蛋白。有關(guān)這方面的文獻(xiàn)報(bào)道有很多，將其總結(jié)，并將文章發(fā)表在《P印tides》2008 ;29(6) :1062-71上。但目前的研究多停留在發(fā)現(xiàn)與提取層面，工藝復(fù)雜，純度低，保存困難。根據(jù)文獻(xiàn)合成的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽乳白肽(氨基酸序列l(wèi)eu-Arg-Pro-Val-Ala-Ala)，源于乳鐵蛋白，是臺(tái)灣等人所作研究，并沒(méi)有在臺(tái)灣相關(guān)部門申報(bào)專利。將其與牛血清白蛋白偶聯(lián)，延緩降解， 結(jié)果取得長(zhǎng)時(shí)間控制SHR大鼠血壓的效果，亦沒(méi)有申請(qǐng)專利，只是將相關(guān)文章在《Kidney Blood Press Res》2011 ;34 :358-364上發(fā)表了。根據(jù)目前已提取的ACE抑制肽，證明降血壓肽的抑制活性與其氨基酸種類和組成密切相關(guān)。有關(guān)ACE抑制劑活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系的研究認(rèn)為，維持其高活性所必需的結(jié)構(gòu)是C端ftx)，Phe, Thy或序列中含有疏水性氨基酸；二肽的N端為芳香族氨基酸或C端為Tyr，Try, Pro抑制作用最強(qiáng)。抑制ACE活性的肽的特點(diǎn)是①分子量相對(duì)較低，約含2 12個(gè)氨基酸殘基。如果從N端延長(zhǎng)某個(gè)二肽，相應(yīng)三肽的抑制活性通常增強(qiáng)，但如繼續(xù)延長(zhǎng)，活性則會(huì)降低；②C端含有苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、 酪氨酸的三肽或二肽，活性比較高；③N端為疏水性支鏈氨基酸如纈氨酸和異亮氨酸，活性比較高，而N端為脯氨酸則活性降低；④C端殘基上存在賴氨酸或精氨酸，肽的抑制活性可以提高，賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈上的胍或ε-氨基上的正電荷在其中起著重要作用，取代C端的精氨酸殘基會(huì)造成其類似物活性的基本喪失。因此，試圖通過(guò)改良血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽乳白肽的氨基酸序列來(lái)增加血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽乳白肽的活性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽 LAP-Cl，該血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl具有降壓效應(yīng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供了一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl，該血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽 LAP-C 1 的氨基酸序列為 Leu-Arg-Pro-Val-Ala-Ala-Pro。所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl物理性狀白色粉末，水溶性好；分子量 722. 89 ；純度> 95%。
所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性 IC50 18. 06 μ M0所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl用于治療和預(yù)防高血壓的藥物。在既往研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)參考文獻(xiàn)提出的添加Pro可以增強(qiáng)肽的降壓效應(yīng)的規(guī)則，將乳白肽改造為乳白肽Cl，即在其C’端添加ftx)。體外實(shí)驗(yàn)揭示乳白肽Cl體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性(IC50)為18. 06 μ M，明顯高于乳白肽(IC50 :4. 14 μ M)。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、本發(fā)明的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl降壓效果更強(qiáng)，半衰期長(zhǎng)，可以減少患者的用藥次數(shù)，提高患者的依從性，節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。2、本發(fā)明的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl的合成技術(shù)成熟，操作簡(jiǎn)便。3、本發(fā)明的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl的合成方法中副反應(yīng)少。


圖1為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽LAP-Cl的質(zhì)譜分析圖譜。圖 2 為 Hip 0. 112mmol/L 與 HHL 0. 29mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜。圖3為對(duì)照組a :50ul血管緊張素轉(zhuǎn)化酶+IOul緩沖液+200ulHHL(l. 523mmol/ L) +250HCL,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性圖譜。圖4為抑制劑組b :50ul血管緊張素轉(zhuǎn)化酶+10ulLAP-Cl (18. 06umol/ L) +200ulHHL(l. 523mmol/L) +250HCL,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性變化圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖所示實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-Cl的合成采用固相合成儀合成血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽LAP-C1，質(zhì)譜分析儀鑒別，質(zhì)樸圖見(jiàn)圖1。(1)合成原料及相關(guān)試劑1). FMOC-酪氨酸-OH(FMOC-Tyr-OH)，F(xiàn)MOC-Thr-OH, FMOC-Asn-OH, FMOC-Pro-OH, FMOC-Lys-OH,FMOC-Leu-OH,FMOC-Phe-OH，F(xiàn)0MC-Asp-0H，F(xiàn)MOC-Met-OH，F(xiàn)MOC-Arg-OH 等(吉爾生化(上海)有限公司)2).苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(吉爾生化(上海) 有限公司)3).NMM(國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)4). 二甲基甲酰胺(DMF) (D i kma 公司)5). DCM (Dikma 公司)6).乙腈(Fisher 公司)7). FMOC-酪氨酸王樹(shù)脂(FMOC-Tyr-Wang-Resin)(吉爾生化(上海)有限公司)8).哌啶(國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)9).氮?dú)?上海比歐氣體工業(yè)公司)
10).反式脂肪酸(TFA) (J. T. Baker 公司)
11). TIS(ALDRICH 公司)12).無(wú)水乙醚(上海試一化學(xué)試劑有限公司)13).精密電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)(2)儀器設(shè)備SYMPHONY型12通道多肽合成儀(型號(hào)SYMPH0NY，軟件Version. 201廠家 Protein Technologies. Inc)SHIMADZU高效液相色譜儀(型號(hào)制備型，分析型，軟件=Class-VP. Sevial System，廠商SHIMADZU)LABC0NC0凍干機(jī)(型號(hào)Freezone. Plus. 6，廠商LABC0NC0，離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào)TDL-40B)(3)合成過(guò)程儀器固相多肽合成操作步驟SYMPHONY是世界第一臺(tái)一次可合成12個(gè)不同的復(fù)合多肽合成儀步驟1)、根據(jù)軟件計(jì)算配制所需要的保護(hù)氨基酸溶液，和縮合試劑，切割試劑，在儀器相應(yīng)的瓶里加入足量的DMF、DCM。2)、在反應(yīng)器中加入 IOOumol FMOC-AA-Wang-Resin。3)、在收集切割液的管道上放如15mg的離心管。4)、編輯程序，一般樹(shù)脂的溶漲時(shí)間是30min，脫保護(hù)時(shí)間是5min、15min兩次、縮合時(shí)間是30分鐘，切割程序是池。5)、開(kāi)機(jī)按照SYMPHONY型12通道多肽合成儀(型號(hào)SYMPHONY，軟件 Version. 201廠家Protein Technologies. Inc)說(shuō)明書(shū)提供的操作程序合成。6)、最后將切割液用乙醚沉淀，離心，吹干，用SHIMADZU高效液相色譜儀(型號(hào)制備型，分析型，軟件ClaSS-VP. Sevial System，廠商SHIMADZU)按其說(shuō)明書(shū)提供的步驟純化。實(shí)施例2LAP-Cl體外抑制ACE的活性IC50值采用高壓液相色譜分析儀，通過(guò)直接進(jìn)樣、等梯度洗脫測(cè)定LAP-Cl抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性。結(jié)果對(duì)照組a(LAP-Cl由緩沖液替代)分析中，進(jìn)樣前底物馬尿酰組胺酰亮氨酸(SIGMA 公司 H1635) (HHL)的濃度(1. 523mmol/L)較 HHL 標(biāo)準(zhǔn)品(0. 29mmol/L)高出近5倍，圖2為Hip 0. 112mmol/L與HHL 0. ^mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品圖譜。圖3為對(duì)照組a :50ul 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶+IOul緩沖液+200ulHHL(l. 523mmol/L)+250HCL，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性圖譜。圖3中17. 743分鐘所出峰的峰面積與圖2比較高出約1. 8倍，圖2中6. 43分鐘所出峰的峰面積與圖3比較高出約2. 9倍，綜合圖2、圖3所示結(jié)果，提示馬尿酸(SIGMA公司S57965) (HIP)出峰時(shí)間約為6. 4分鐘，而HHL出峰時(shí)間約為17. 8分鐘可能性極大。隨后在18. 06umol/L的LAP-Cl抑制劑組中(圖4，圖4為抑制劑組b :50ul血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 +10ulLAP-Cl(18. 06umol/L) +200ulHHL(l. 523mmol/L) +250HCL，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性變化圖譜。)，6至8分鐘內(nèi)所出峰峰面積與對(duì)照組比較減低，而16至20分鐘內(nèi)所出峰峰面積則增高，從而進(jìn)一步證實(shí)了同前所述Hip及HHL的出峰時(shí)間。以上圖譜證明在常溫條件下，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能使HHL降解生成Hip，同時(shí)在測(cè)定各濃度的LAP-Cl溶液體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)抑制劑組b (加入LAP-Cl組)與對(duì)照組的比較，證明 LAP-Cl體外能較明顯抑制的活性(見(jiàn)表1)，使血管緊張素轉(zhuǎn)化酶降解HHL產(chǎn)生Hip的量減少，其抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶使Hip生成減少約50%的IC50值為18. 06umol/L(圖4)。表 權(quán)利要求
1.一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl，其特征在于該血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl的氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Arg-Pro-Val-Ala-Ala-Pro。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl，其特征在于所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl物理性狀白色粉末，水溶性好；分子量722. 89 ；純度> 95%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl，其特征在于所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性IC50 18. 06 μ Mo
4.權(quán)利要求1至3任一所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽乳白肽Cl用于治療和預(yù)防高血壓的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種具有降壓效應(yīng)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽乳白肽C1及其應(yīng)用，該血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-C1的氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Arg-Pro-Val-Ala-Ala-Pro，體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性IC5018.06μM，具有降壓效果，可用來(lái)作為治療和預(yù)防高血壓的藥物。本發(fā)明的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽LAP-C1降壓效果更強(qiáng)，半衰期長(zhǎng)，可以減少患者的用藥次數(shù)，提高患者的依從性，節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。
文檔編號(hào)A61K38/08GK102336810SQ20111029718
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者方宏, 羅明 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)