專利名稱：紅茂草醇提取物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥提取物的新用途，具體涉及紅茂草醇提取物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用。
背景技術：
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，20世紀80年代全世界每年新患癌癥的病人約700 萬，每年死于癌癥者約500萬人。50年代初，我國癌癥死亡占全部死因的第9位或第10位， 70年代我國癌癥死亡已躍居第3位。1991年統(tǒng)計資料，我國一些大中城市居民的癌癥死亡已占據(jù)全部死因的第1位。我國每年新患癌癥約160萬人、死于癌癥者約130萬人。上述資料表明全世界和我國的癌癥發(fā)病率在逐年明顯增加。此外，我國癌癥病人就診時晚期病人仍占多數(shù)，具有已失去了手術等根治機會、治療效果較差的特點。廣大醫(yī)務工作者加強腫瘤治療的研究，掌握和提高現(xiàn)有各種治療手段的治療效果，對降低癌癥死亡率，減少復發(fā)率，提高癌癥病人的生活質量具有重要意義。按現(xiàn)在我國癌癥死亡的水平，全國每1分鐘就有2個人死于癌癥，每天將有2800多人被癌癥奪走生命，1年將相當于一個有百萬人口的城市被毀滅?？梢?，癌癥是常見病、多發(fā)病，對人們生命和健康有者嚴重威脅，對國民經(jīng)濟建設的影響也是巨大的。在美國，每年癌癥治療費用830億美元，占全國醫(yī)療費用的14%。幾乎每個人都感受到癌癥的威脅。因為全世界每年因癌癥死亡的人數(shù)高達630萬人，而我國每年因癌癥死亡的人數(shù)已達130萬人，并且癌癥病人每年以3%的速度遞增，相當于每200個家庭中就有1個家庭受到癌癥的威脅?；熓悄壳爸委煱┌Y的一個重要手段，化療藥物在殺死癌細胞的同時，對機體正常細胞也存在毒性。近年來，隨著抗癌新藥的不斷涌現(xiàn)，聯(lián)合化療方案的合理應用，化療的療效有了較大的提高，但這些藥物同時對正常組織器官有損害或毒性作用，從而降低機體免疫功能，出現(xiàn)骨髓抑制等一系列毒副反應，影響化療的療效，甚至迫使化療終止。臨床研究表明，在化療時根據(jù)患者的體質、癌癥分期以及出現(xiàn)的毒副反應癥狀，輔以中藥治療，可有效地增強化療的效果，又能在一定程度上避免或減輕放化療的毒副反應，延長患者的生存期和提高患者的生存質量。而中藥作為我國得天獨厚的資源，有些藥物具有明顯的抗腫瘤作用，因此從我國傳統(tǒng)的天然藥物中篩選高效低毒、靶向性強的抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。王光鳳等采用多種腫瘤模型，研究橘皮中提取的黃酮化合物川陳皮素的抗腫瘤作用。結果顯示，川陳皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率為42. 24% 65. 95%， 對小鼠Lewis肺癌的抑瘤率為38. 84% 59. 09%;對小鼠S180肉瘤的抑瘤率為36. 02% 45. 98%。川陳皮素與小劑量的紫杉醇、絲裂霉素、52氟尿嘧啶、順鉬和阿霉素聯(lián)用時，表現(xiàn)明顯的協(xié)同效應。川陳皮素對小鼠Lewis肺癌腋皮下接種肺轉移的抑制率為33. 63% 38. 94% ；對小鼠Colon26結腸癌腹腔接種腹膜轉移的抑制率為37. 74% 43. 40%。(王光鳳，王小晨，肖璘，等.柑橘黃酮川陳皮素的抗腫瘤作用研究，中草藥，2007,38(11) 1694-1697)，但以上研究都只能對某種腫瘤細胞發(fā)揮作用，研究還不夠深入。
紅茂草主要化學成分為多種異喹啉類生物堿。全草含異紫堇堿、原阿片堿、紫堇堿、異紫堇啡堿、木蘭堿、血根堿、別隱品堿、海罌粟堿。根含原阿片堿、白屈菜紅堿、血根堿、別隱品堿、隱品堿，但沒有報道過紅茂草醇提取物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用。

發(fā)明內容
發(fā)明目的為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種紅茂草醇提取物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用。技術方案本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的紅茂草醇提物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用。上述紅茂草醇提物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用，所述的紅茂草醇提物按如下方法制備而成取紅茂草藥材，加入6-10倍藥材重量的體積濃度為60% -75%乙醇進行加熱回流，回流0. 2-0. 8小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為 1. 20 1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。上述紅茂草醇提物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用，所述的紅茂草醇提物按如下方法制備而成取紅茂草藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。紅茂草為罌粟科禿瘡花屬植物禿瘡花Dicranostigma leptopodum(Maxim.) Fedde,以全草入藥。有益效果為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面將紅茂草醇提取物的藥理試驗及實驗結果來說明其在制藥領域中的新用途。以下是紅茂草醇提取物抗腫瘤轉移作用的研究，實驗方法及結果如下一、紅茂草醇提取物的制備取50克紅茂草藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。二、紅茂草醇提取物對自發(fā)性B16F10黑色素瘤轉移模型的影響1.實驗材料1.1實驗動物與細胞清潔級C57BL/6小鼠(雌性，6_8周齡，16_20g)，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK (滬)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤細胞株。1. 2實驗藥物紅茂草醇提取物按照上述方法制備而成。1. 3實驗試劑DMEM (美國GIBCO公司批號1340114)，PBS (實驗室自制)，小牛血清(天津市洋生物制品科技有限公司批號:QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批號=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批號0105)，甲醛(上海久億化學試劑有限公司批號20070610)，生理鹽水(上海華源長富藥業(yè)有限公司批號070405045)，NaHC03(南京化學試劑有限公司批號050480039)，液體石蠟(上海久億化學試劑有限公司批號20040701)。1. 4實驗器材萊卡倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司型號DM1L)，精密移液器(法國吉爾森公司型號P2)，全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號MLS-3020)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司型號Nu-6511)，C02培養(yǎng)箱 (FORMA型號3111)，純水儀(美國Spring公司型號S/N020579)，電子天平(德國賽多利斯有限公司型號BT323S)，臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號DHG9123A)， 冰箱(西門子公司型號KG18V21TI)，液氮罐(CBS型號2001)，離心機(上海安亭科學儀器廠型號=KA-IOOO)，PH計(HANNA公司型號HI_221)，注射器。2.實驗方法2. 1制備B16F10細胞懸液常規(guī)培養(yǎng)B16F10腫瘤細胞，實驗前4-5天，按1 10細胞傳代于細胞培養(yǎng)瓶中， 以免細胞生長過度而出現(xiàn)不完全融合。每個培養(yǎng)瓶大約含6-8 X 106細胞，取對數(shù)生長期的細胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗凈，加入ImL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入細胞培養(yǎng)箱中，l-3min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細胞脫落。加IOmL DMEM，用移液管吹打細胞，獲得單細胞懸液，轉入50mL聚丙烯離心管。離心細胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗兩遍。用苔盼藍計數(shù)細胞，調整細胞濃度為lX107/mL。2. 3復制B16F10自發(fā)性腫瘤轉移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足墊皮下注射含5 X IO5個B16F10細胞的懸液0. 05mL, 這些小鼠每五天稱一次體重。于接種后第八天按照左足墊上原發(fā)瘤的大小將小鼠隨機分為四組模型組對照組(生理鹽水組)、紅茂草醇提取物低劑量組(2g/kg小鼠體重)、紅茂草醇提取物中劑量組(4mg/kg小鼠體重)、紅茂草醇提取物高劑量組(6g/kg小鼠體重)，每組動物數(shù)為10只。從接種的第九天開始各組灌胃給予相應劑量的藥物，模型組給予相應的生理鹽水，每日一次，直至處死動物，采集標本。在接種后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福爾馬林固定原發(fā)瘤組織，稱取原發(fā)腫瘤重量以及用直尺測量原發(fā)瘤的長軸 (Li)和縱軸(L2)，按照以下公式計算原發(fā)瘤的體積0. 5236XL1X (L2)2。切除原發(fā)灶后22 天處死小鼠，取出肺，避免鑷子觸及臟器表面損傷組織，用PBS洗凈組織。10% PBS-福爾馬林固定肺組織，稱取肺重，拍照并且在解剖顯微鏡下計算肺腫瘤結節(jié)數(shù)。3.實驗結果3. 1紅茂草醇提取物對B16F10黑色素瘤自發(fā)性轉移模型肺轉移的影響實驗結果采用Excel統(tǒng)計軟件學生t檢驗進行檢驗，由實驗數(shù)據(jù)可以看出，紅茂草醇提取物各劑量組與對照組相比對黑色素瘤自發(fā)性轉移模型的肺轉移結節(jié)數(shù)均有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量相關性紅茂草醇提取物2g/kg劑量組(P < 0. 05)、紅茂草醇提取物4g/kg 劑量組(P <0.01)、紅茂草醇提取物6g/kg劑量組(P <0.01)。對于肺重的影響，紅茂草醇提取物6g/kg劑量組的肺重量明顯低于對照組的肺重(P <0.01)，其他兩組無明顯作用。3. 2紅茂草醇提取物對B16F10黑色素瘤原發(fā)位腫瘤體積和重量的影響與生理鹽水組相比，紅茂草醇提取物對于接種B16F10黑色素瘤細胞后的小鼠足墊部的原發(fā)位腫瘤無論是體積以及重量都沒有明顯的影響作用。
4.結論紅茂草醇提取物能夠抑制B16F10黑色素瘤肺轉移，而且也抑制轉移灶的生長，但是對原發(fā)腫瘤細胞增殖沒有影響，從小鼠體重變化可以看出，紅茂草醇提取物的毒副作用很小，為今后體內安全用藥提供基礎。三、紅茂草醇提取物對B16F10黑色素瘤細胞實驗性肺轉移影響1.實驗材料同前2.實驗方法2.1制備細胞懸液同前2. 2復制B16F10實驗性腫瘤轉移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾靜脈注射0. 2mL細胞懸液(含5X IO5腫瘤細胞)。接種過腫瘤細胞的小鼠隨機分為4組模型組對照組(生理鹽水組)、紅茂草醇提取物低劑量組(2g/kg小鼠體重)、紅茂草醇提取物中劑量組(4mg/kg小鼠體重)、紅茂草醇提取物高劑量組(6g/kg小鼠體重)，每組動物數(shù)為10只，從接種后開始各組灌胃給予相應劑量的藥物，模型組給予相應的生理鹽水，每日一次，給藥23天，處死小鼠，取肺臟。避免鑷子觸及臟器表面，防止損傷組織，用PBS洗凈組織。10% PBS-福爾馬林固定肺組織，稱取肺重，拍照，評價紅茂草醇提取物對B16F10腫瘤血行肺轉移的影響。3.實驗結果實驗結果采用Excel統(tǒng)計軟件學生t檢驗，從各組取出的肺組織可以看出，模型組的肺組織轉移腫瘤結節(jié)數(shù)目顯著多于給藥組，由于肺結節(jié)太多，無法計數(shù)統(tǒng)計，對肺重的統(tǒng)計分析表明，紅茂草醇提取物高劑量組(6g/kg)和紅茂草醇提取物中劑量組(4g/kg)均能抑制小鼠肺組織重量，P值分別為P < 0. 01和P < 0. 05。紅茂草醇提取物給藥前后小鼠體重差異不大，且與對照組相比，小鼠體重未發(fā)現(xiàn)有大幅度減少，各組的死亡率顯示，紅茂草醇提取物藥物對于小鼠的體內毒性較小。4.結論紅茂草醇提取物給藥組小鼠的死亡率與對照組相當，而且體重與給藥前也沒有明顯的減少，說明紅茂草醇提取物的毒副作用很小，紅茂草醇提取物可以很好的抑制實驗性 B16F10黑色素瘤肺轉移，紅茂草醇提取物對于B16F10細胞直接入血之后的血行過程，黏附過程以及穿出血管過程有一定的抑制作用。
具體實施例方式以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。制備實施例1 取50克紅茂草藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制備實施例2:取50克紅茂草藥材，加入6倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制備實施例3 取50克紅茂草藥材，加入10倍藥材重量的體積濃度為70 %乙醇進行加熱回流，回流0. 6小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至90°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制備實施例4 取50克紅茂草藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為60%乙醇進行加熱回流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制備實施例5 取50克紅茂草藥材，加入6倍藥材重量的體積濃度為75%乙醇進行加熱回流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制備實施例6 取50克紅茂草藥材，加入10倍藥材重量的體積濃度為60 %乙醇進行加熱回流，回流0. 6小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至90°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎
成干浸膏粉。
權利要求
1.紅茂草醇提物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用。
2.如權利要求1所述紅茂草醇提物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用，其特征在于所述的紅茂草醇提物按如下方法制備而成取紅茂草藥材，加入6-10倍藥材重量的體積濃度為60% -75%乙醇進行加熱回流，回流0. 2-0. 8小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 20 1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。
3.如權利要求2所述紅茂草醇提物在制備抗黑色素瘤轉移藥物中的應用，其特征在于所述的紅茂草醇提物按如下方法制備而成取紅茂草藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回流，回流0.5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至95°C時相對密度為1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從紅茂草醇提物在抗腫瘤藥物中的新用途，該提取物具有抗腫瘤轉移作用，具體表現(xiàn)為抑制黑色素瘤自發(fā)性腫瘤轉移和實驗性腫瘤轉移，可用于制備抗黑色素腫瘤轉移藥物。
文檔編號A61K36/66GK102357123SQ20111029960
公開日2012年2月22日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權日2011年9月28日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:南京正寬醫(yī)藥科技有限公司