專利名稱：環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)磷酰胺的應(yīng)用，尤其涉及環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝臟疾病，是一種廣泛影響人類健康的疾病，在中國(guó)有高達(dá)10%的人群被乙肝病毒感染成為乙肝病毒攜帶者或乙型肝炎患者。乙肝病毒感染肝臟的肝細(xì)胞并不造成肝細(xì)胞的損傷，但乙肝病毒對(duì)人體而言屬于完全異己的生物體，其抗原成分會(huì)強(qiáng)烈刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，并趨化大量免疫細(xì)胞達(dá)到肝臟部位， 以便將乙肝病毒進(jìn)行清除，但這種募集的免疫細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，正是這種炎癥直接地?fù)p傷肝臟細(xì)胞，引發(fā)乙型肝炎。目前對(duì)于乙肝病毒感染所致的乙型肝炎的治療并不理想。盡管免疫調(diào)節(jié)劑如干擾素類和抗病毒的核苷類藥物被廣泛用于慢性乙型肝炎的治療，并且是作為治療乙型肝炎常用的臨床用藥，但干擾素類藥物通常具有較強(qiáng)的毒性，長(zhǎng)期或大量服用對(duì)于患者的毒副作用非常明顯，而核苷類抗病毒藥物只能抑制HBV的DNA復(fù)制，不能完全清除乙肝病毒，需要長(zhǎng)期服藥甚至是終身服藥，但核苷類抗HBV藥物又往往導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，使治療失敗。其它種類的藥物在臨床治療中也存在類似的問題。因此，如何克服現(xiàn)有的治療乙型肝炎藥物的缺陷成為有待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎的輔助藥物中的應(yīng)用，該輔助藥物為輔助核苷類抗病毒藥物治療乙型肝炎的藥物。環(huán)磷酰胺是目前廣泛應(yīng)用的抗癌化療藥物，其對(duì)包括惡性淋巴瘤、急性或慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、肺癌、頭頸部鱗癌、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤在內(nèi)的腫瘤均具有一定的療效。在臨床治療中主要為口服和注射給藥，通過給患者攝入較大劑量的環(huán)磷酰胺，達(dá)到殺死腫瘤的目的，并且，為了殺死腫瘤，需要維持一定時(shí)間的連續(xù)給藥，以及周期性治療，但由于大劑量且長(zhǎng)時(shí)間治療，在殺死腫瘤的過程中對(duì)患者身體傷害也非常大。目前還沒有報(bào)道顯示環(huán)磷酰胺可作為乙型肝炎治療藥物或乙型肝炎治療的輔助藥物，尤其是可以經(jīng)低劑量口服實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎的治療或輔助治療。核苷類抗病毒藥物例如包括拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋和阿德福韋等，是目前治療乙型肝炎常用的臨床用藥中的一種或多種。上述核苷類抗病毒藥物已被廣泛應(yīng)用于治療乙型肝炎，但最大問題是上述核苷類抗病毒藥物治療機(jī)理是只能抑制HBV的DNA復(fù)制，而非清除乙肝病毒，臨床上常見的情況是，采用治療達(dá)到預(yù)期效果后一旦停藥，由于病毒的反彈，其血清病毒DNA載量甚至超過治療前水平，因此需要長(zhǎng)期甚至終身服藥，不僅給患者造成痛苦，同時(shí)還面臨耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，不僅貽誤治療還可能引發(fā)其它病癥(例如對(duì)其它臟器功能的損害)，這也是乙肝治療難度大的原因。因此，開發(fā)新的抗乙肝病毒的藥物具有重要的臨床意義。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，提高機(jī)體免疫能力來有效殺滅乙肝病毒，是清除乙肝病毒的理想手段。低劑量的環(huán)磷酰胺通過選擇性地殺傷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，使效應(yīng)性T細(xì)胞增殖活化能力增強(qiáng)，從而能夠有效增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。該結(jié)論雖然已經(jīng)有公開，但從另一方面，增強(qiáng)抗病毒免疫，同時(shí)也導(dǎo)致炎癥的加強(qiáng)，后者會(huì)進(jìn)一步惡化對(duì)肝細(xì)胞的損傷。所以，環(huán)磷酰胺藥物與治療乙型肝炎之間的關(guān)系，在本發(fā)明以前始終沒有確定的結(jié)果。本案發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，使用環(huán)磷酰胺，尤其是口服低劑量環(huán)磷酰胺，在治療乙型肝炎中具有意想不到的效果，對(duì)乙肝患者，口服環(huán)磷酰胺治療能夠平衡免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療乙肝病毒感染的目的。發(fā)明人的研究還發(fā)現(xiàn)，雖然上述核苷類抗病毒藥物不能從根本上治愈乙型肝炎， 但經(jīng)核苷類抗病毒藥物治療后的乙型肝炎患者，其血清HBV-DNA載量迅速下降、肝功能恢復(fù)正常、肝臟組織學(xué)的病變明顯改善，體內(nèi)存在的乙肝病毒數(shù)量已大大減少，如在此時(shí)應(yīng)用環(huán)磷酰胺作為輔助核苷類抗病毒藥物治療乙型肝炎的輔助藥物，即，實(shí)施對(duì)乙肝的免疫治療，提高機(jī)體抗病毒免疫能力以殺滅這些殘余的病毒，同時(shí)不會(huì)造成過多的肝損傷，并且經(jīng)核苷類抗病毒藥物治療之后轉(zhuǎn)好的肝功能也為后續(xù)的抗病毒免疫治療提供了支撐。環(huán)磷酰胺可以在清除剩余乙肝病毒的同時(shí)保持肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)在機(jī)體可承受的范圍，不對(duì)患者的肝腎功能產(chǎn)生不良影響。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎患者經(jīng)核苷類抗病毒藥物治療之后，在病毒載量和肝功能恢復(fù)的情況下，再聯(lián)合低劑量的環(huán)磷酰胺可有效清除乙型肝炎患者所感染的乙肝病毒，而且對(duì)患者肝腎功能均不產(chǎn)生影響，無明顯的毒副作用。在停止核苷類抗病毒藥物治療之后，未見乙肝病毒的反彈，達(dá)到防止復(fù)發(fā)，無須長(zhǎng)期服用核苷類抗病毒藥物的目的?？梢岳斫猓h(huán)磷酰胺作為治療乙型肝炎的輔助藥物，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在本發(fā)明的方案中，作為治療用藥的環(huán)磷酰胺可以是目前已經(jīng)臨床使用的藥物種類和規(guī)格，也可以是利用環(huán)磷酰胺作為有效成分而自制的藥劑。可以商購(gòu)的藥物例如環(huán)磷酰胺注射液、環(huán)磷酰胺片等。優(yōu)選采用環(huán)磷酰胺片通過低劑量口服給藥實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎的治療。進(jìn)一步的，可以使用單位制劑的環(huán)磷酰胺，所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑，常見的單位制劑如一單位(片)片劑、一單位(針)針劑等，其中作為有效成分的環(huán)磷酰胺含量為一次給藥所需的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)患者乙型肝炎的嚴(yán)重程度，選擇合適的藥物規(guī)格(含有的環(huán)磷酰胺的量)，同時(shí)也可以根據(jù)使用核苷類抗病毒藥物治療后的狀態(tài)，選擇合適的輔助藥物規(guī)格(含有的環(huán)磷酰胺的量)，作為藥物或輔助藥物時(shí)，采用低劑量給藥，優(yōu)選給患者口服環(huán)磷酰胺片，對(duì)于成人(體重在正常范圍)給藥劑量每天一次，每次50mg (—片)，遠(yuǎn)低于環(huán)磷酰胺通常在腫瘤化療中使用的劑量(一般為 2mg-10mg/kg體重)。治療過程為連續(xù)服藥7天，間隔7天后，再連續(xù)服藥7天，再間隔7天后，再連續(xù)服藥7天，作為一個(gè)治療周期。總之，本發(fā)明的研究結(jié)果證明，將環(huán)磷酰胺作為治療乙肝病毒感染肝臟的藥物，尤其是控制低劑給藥，在臨床治療中能夠比較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的平衡，可在提高機(jī)體免疫力的同時(shí)避免肝臟細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；尤其是用于輔助核苷類抗病毒藥物對(duì)乙肝病毒感染肝臟的治療，可實(shí)現(xiàn)對(duì)乙肝病毒的有效清除，同時(shí)保持肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)在機(jī)體可承受的范圍。


圖1顯示了環(huán)磷酰胺降低了乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。圖2顯示了環(huán)磷酰胺降低了乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。圖3顯示了環(huán)磷酰胺不影響乙型肝炎患者外周血總T細(xì)胞的數(shù)量。圖4顯示了環(huán)磷酰胺不影響乙型肝炎患者外周血NK細(xì)胞的數(shù)量。圖5顯示了環(huán)磷酰胺增強(qiáng)了乙型肝炎患者效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活化能力。圖6顯示了環(huán)磷酰胺增強(qiáng)了乙型肝炎患者效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活化能力。圖7顯示了環(huán)磷酰胺降低了乙型肝炎病毒攜帶者的HBV載量。圖8顯示了環(huán)磷酰胺作為輔助藥物增強(qiáng)了對(duì)經(jīng)核苷類抗病毒藥物治療后患者體內(nèi)殘余HBV的清除。圖9A和圖9B顯示了環(huán)磷酰胺不影響乙型肝炎患者的肝腎功能。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案。為了證實(shí)將環(huán)磷酰胺應(yīng)用于制備治療乙型肝炎藥物，所得的藥物可在提高機(jī)體免疫力的同時(shí)避免肝臟細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；將環(huán)磷酰胺應(yīng)用于制備輔助核苷類抗病毒藥物制備治療乙肝病毒感染肝臟的輔助藥物，獲得的輔助藥物可實(shí)現(xiàn)對(duì)乙肝病毒的有效清除，同時(shí)保持肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)在機(jī)體可承受的范圍，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1 環(huán)磷酰胺可清除乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)者為病癥基本相同的乙型肝炎患者，共M名，分為等數(shù)量?jī)山M。第1天，對(duì)第一組的12名乙型肝炎患者(體重為52_7^g)每天施用50mg環(huán)磷酰胺片1次，連續(xù)給藥7天，作為給藥組；同時(shí)對(duì)第二組的12名乙型肝炎患者(體重為 55-77kg)每天施用50mg淀粉安慰劑1次，連續(xù)給藥7天，作為對(duì)照組。第8天，分別取上述給藥組和對(duì)照組患者的外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。與施用安慰劑的對(duì)照組相比，施用環(huán)磷酰胺的給藥組患者顯示出顯著降低的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和數(shù)量(圖1和圖2，* < 0. 05)，但其總T細(xì)胞和NK細(xì)胞的水平則不產(chǎn)生影響(圖 3 和圖 4，* < 0. 05)。實(shí)施例2 環(huán)磷酰胺增強(qiáng)了乙肝患者細(xì)胞免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)者為病癥基本相同的乙型肝炎患者(體重為45_85kg)，共12名，分為等數(shù)量?jī)山M。對(duì)第一組的6個(gè)乙型肝炎患者施用50mg低劑量環(huán)磷酰胺，作為給藥組，同時(shí)對(duì)第二組的6個(gè)乙型肝炎患者施用50mg淀粉安慰劑，作為對(duì)照組，7天時(shí)間后，分別分離上述給藥組和對(duì)照組患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，進(jìn)行效應(yīng)性T細(xì)胞增殖試驗(yàn)(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為抑制性細(xì)胞，其抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖)，具體為在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)PBMCs，培養(yǎng)至良好狀態(tài)。
5
第1天，將上述培養(yǎng)好的來自給藥組患者的PBMCs分為兩組，在來自給藥組患者的第一組PBMCs中加入抗⑶3和⑶觀的抗體，48小時(shí)后，進(jìn)行氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖；對(duì)來自給藥組患者的第二組PBMCs中采用NK細(xì)胞分離試劑盒分離NK細(xì)胞，然后對(duì)分離的NK細(xì)胞進(jìn)行對(duì)NK細(xì)胞敏感的1(5 白血病細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)；同樣在第1天，將來自對(duì)照組患者的PBMCs分為兩組，以相同的方法檢測(cè)檢測(cè)效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，以及進(jìn)行NK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，結(jié)果如圖5和圖6所示?？梢钥闯雠c施用安慰劑的對(duì)照組相比，施用50mg的環(huán)磷酰胺的給藥組中效應(yīng)性T 細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(* < 0. 05)，并且對(duì)1(5 白血病細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。實(shí)施例3 環(huán)磷酰胺降低了乙型肝炎病毒攜帶者的HBV載量。實(shí)驗(yàn)者為病癥基本相同的乙型肝炎病毒攜帶者，這些患者的外周血中HBV病毒載量> IO6拷貝數(shù)，但肝功能正常且無其它臨床癥狀，共20名，分為等數(shù)量?jī)山M。對(duì)第一組的10名乙型肝炎病毒攜帶者(體重為52_75kg)，每天口服給藥50mg環(huán)磷酰胺片1次，連續(xù)給藥四周，作為給藥組；對(duì)第二組的10名乙型肝炎病毒攜帶者(體重為55_77kg)，每天口服給藥50mg淀粉安慰劑1次，連續(xù)服用四周，作為對(duì)照組；給藥四周后，檢測(cè)上述給藥物和對(duì)照組患者的外周血中HBV病毒載量，結(jié)果如圖7 所示，口服環(huán)磷酰胺片的給藥組中有3人的病毒載量拷貝數(shù)顯著下降，從IXlO6以上降到 1 X IO4以下，而施用淀粉安慰劑的對(duì)照組中則無一人病毒載量下降。實(shí)施例4 環(huán)磷酰胺作為輔助藥物增強(qiáng)了對(duì)經(jīng)核苷類抗病毒藥物治療后患者體內(nèi)殘余HBV的清除選取經(jīng)核苷類抗病毒藥物拉米夫定治療后，血清轉(zhuǎn)氨酶水平正常、HBV-DNA拷貝數(shù)小于IO4的乙型肝炎患者M(jìn)人(體重為52-7^g)，隨機(jī)平均分為3組進(jìn)行不同治療第1天開始，對(duì)第一組中的所有患者每天施用拉米夫定(IOOmg/次/天)并聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺片(50mg)，治療5周后，停用拉米夫定但繼續(xù)采用上述低劑量環(huán)磷酰胺片治療5周(每天一次，每次50mg，連續(xù)7天，間隔7天后，再以同樣劑量連續(xù)服用環(huán)磷酰胺片7 天，間隔7天，再連續(xù)服用7天，總時(shí)間為5周)，然后停藥，一個(gè)月后檢測(cè)患者血清HBV-DNA 拷貝數(shù)；第1天開始，對(duì)第二組中的所有患者每天施用第二組拉米夫定(IOOmg/次/天) 并聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺片(50mg)，治療5周后停藥，一個(gè)月后檢測(cè)血清HBV-DNA拷貝數(shù)；第1天開始，對(duì)第三組中的所有患者每天施用拉米夫定(IOOmg/次/天)，5周后停藥，一個(gè)月后檢測(cè)血清HBV-DNA拷貝數(shù)。圖8中各線條左端為停藥時(shí)的HBV-DNA拷貝數(shù)，右端為停藥1個(gè)月后的HBV-DNA 拷貝數(shù)，從圖8可以看出第三組中的患者停藥1個(gè)月后，HBV-DNA拷貝數(shù)均反彈上升在IO5 拷貝數(shù)以上；第二組中的患者，在1個(gè)月后多數(shù)患者的HBV-DNA拷貝數(shù)出現(xiàn)反彈，但力度不大，有2名患者未反彈；而第一組中有一半患者未反彈。上述結(jié)果表明環(huán)磷酰胺作為輔助藥物增強(qiáng)了對(duì)經(jīng)核苷類抗病毒藥物治療后患者體內(nèi)殘余HBV的清除。實(shí)施例5 環(huán)磷酰胺不影響乙型肝炎患者的肝腎功能。分別對(duì)上述實(shí)施例4的三組患者，在最后停藥時(shí)，取患者的外周血，檢測(cè)血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量，結(jié)果如圖9A-圖9B所示。與未用環(huán)磷酰胺的第三組比較，服用了環(huán)磷酰胺的第一組和第二組患者血中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量均沒有顯著變化，表明低劑量環(huán)磷酰胺不影響乙型肝炎患者的肝腎功能。
權(quán)利要求
1.環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述藥物為口服制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述藥物為片劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，所述藥物每單位制劑含環(huán)磷酰胺50mg。
5.環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎的輔助藥物中的應(yīng)用，該輔助藥物為輔助核苷類抗病毒藥物治療乙型肝炎的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述核苷類抗病毒藥物包括拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋和阿德福韋中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述輔助藥物為口服制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述輔助藥物為片劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，所述輔助藥物每單位制劑含環(huán)磷酰胺50mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，以及環(huán)磷酰胺在制備治療乙型肝炎的輔助藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的研究證明，環(huán)磷酰胺作為治療乙型肝炎的藥物或輔助藥物，可有效調(diào)動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗人乙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答，清除乙型肝炎患者所感染的乙型肝炎病毒，同時(shí)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)在機(jī)體的可承受范圍，對(duì)乙型肝炎產(chǎn)生良好治療作用，并可防止病毒反彈，而且無明顯的毒副作用。
文檔編號(hào)A61K31/675GK102349922SQ201110302298
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者黃波 申請(qǐng)人:湖北盛齊安生物科技有限公司