專利名稱：惡性b細胞淋巴瘤抗體藥物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已知惡性B細胞淋巴瘤抗體的新用途。
背景技術(shù)：
惡性淋巴瘤(ML)是源于淋巴結(jié)和淋巴結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤，ML可分為何杰金氏淋巴瘤(HD)和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)兩大類。在我國，惡性淋巴瘤新發(fā)病例中，NHL患者占85 90%。在NHL中，預(yù)后較好的低度惡性淋巴瘤在我國的發(fā)病率較低，約占NHL的5% ;而預(yù)后較差的高度惡性淋巴瘤發(fā)病率較高，占NHL的30%左右。調(diào)查顯示，隨著時間的推移和社會經(jīng)濟的發(fā)展，惡性淋巴瘤呈現(xiàn)增長的趨勢，其中HD相對穩(wěn)定，而NHL的發(fā)病率和死亡率均在上升。非何杰金氏淋巴瘤的病因與發(fā)病機制尚未確定，目前認為與性別、年齡、免疫功能缺失、細菌或病毒感染、環(huán)境等多種因素有關(guān)。臨床上治療NHL的方法有化學(xué)治療、放射治療、手術(shù)治療、骨髓移植等。目前對NHL的治療以化療為主，但化療的短期副作用很明顯，而且對復(fù)發(fā)病人作用不肯定，一般化療聯(lián)合方案效果不佳；放療存在的問題是應(yīng)用范圍較小，而手術(shù)對NHL僅起診斷作用，極易復(fù)發(fā)，需要結(jié)合化療；骨髓移植方法則由于配型困難、排異反應(yīng)、價格昂貴等原因難以開展。隨著細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程技術(shù)的發(fā)展，免疫療法在最近幾年逐漸成為癌癥治療的主要方法之一。它直接或間接利用人體免疫系統(tǒng)內(nèi)的免疫細胞及抗體來對抗癌癥或減少因癌癥或其治療所引起的副作用，而腫瘤特異性的單克隆抗體類藥物是目前免疫治療的主導(dǎo)方向。目前在國際上研究的用以治療NHL的單抗類藥物主要是靶向于淋巴細胞表面的抗原，已發(fā)表的研究結(jié)果中有針對⑶20、⑶22、⑶52、⑶19、⑶30及HLA-DR等幾種抗原的抗 體產(chǎn)品。由 National Cancer Insititute 研制的人源化 IgGl 單抗 Apolizumab (MoAbHulDlO)可作用在正常及惡性B淋巴細胞表面的HLA-DR抗原β鏈上的多個位點上產(chǎn)生抗體依賴性的細胞毒殺作用，在針對復(fù)發(fā)性或彌漫型CLL或ALL的I期臨床試驗中，有11 %的病人治療后達到PR，67%的病人為SD，22%的病人為H)。所有的病人都出現(xiàn)了 1_2度輸注反應(yīng)(58%乏力、50%惡心、50%高血糖、42%發(fā)熱、42%風(fēng)疹和33%頭痛)。該藥現(xiàn)正處在II期臨床試驗研究階段。由Peregrine Pharmaceuticals 公司研制的鼠源型單抗 Lym-1 (Oncolym)是一種能夠特異性識別HLA-DRlO抗原的鼠源性IgG2a單抗，該抗原在80%惡性淋巴瘤B細胞表面都有表達。它與淋巴瘤細胞的結(jié)合能力明顯高于與正常B淋巴細胞的結(jié)合能力。在對1251-Lym-l的放射性顯像研究中證實，Lym-1對已知的淋巴瘤組織部位有高度的選擇性結(jié)合，而在正常的組織上結(jié)合較少。在對Lym-1進行的在I期臨床試驗中，10例病人中有3例出現(xiàn)緩解。IgM HAMA反應(yīng)均呈陰性。主要的毒性反應(yīng)表現(xiàn)為有8例病人出現(xiàn)了在注射近終點時或注射完成后的發(fā)熱，其中4例最高體溫保持在38°C以下，另4例最高體溫保持在38 40°C之間，該發(fā)熱很容易用藥控制，而且通常只持續(xù)2 4小時；有4例病人在注射后出現(xiàn)了風(fēng)疹；在研究過程中，沒有發(fā)現(xiàn)心臟、肝腎或肺部毒性反應(yīng)；而且在血液學(xué)指數(shù)方面也沒有明顯的改變；大多數(shù)病人的外周血淋巴細胞沒有降低，免疫球蛋白的水平也未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。放射免疫治療(Radioimmunotherapy，RIT)則是一種免疫療法和放射療法相結(jié)合的治療手段，它是以能與腫瘤抗原結(jié)合的物質(zhì)作為靶向載體，偶聯(lián)放射性核素作為“彈頭”(治療劑)的腫瘤治療藥物注入體內(nèi)與腫瘤細胞相關(guān)抗原特異結(jié)合所致的腫瘤局部比其他正常組織劑量高，達到對腫瘤殺傷而對正常組織損傷小的一種治療方法，而放免療法中最常用的靶向載體是腫瘤細胞相關(guān)抗原的單克隆抗體。目前在美國獲準上市銷售的治療腫瘤的單抗類放射免疫藥物主要有=Zevalin和Bexxar,輸液反應(yīng)及骨髓毒性是其主要毒副反應(yīng)。3度或4度白細胞減少和血小板減少較為常見，并常發(fā)生于治療后5-7周，并在2-4周后恢復(fù)。約5-7%接受Zevalin和Bexxar治療的患者因感染需要住院治療。少部分接受Zevalin和Bexxar治療的患者可出現(xiàn)骨髓增生異常綜合癥和急性白血病，但這些病人往往先前接受過烷化劑治療。研究還發(fā)現(xiàn)，若患者的骨髓受淋巴瘤侵犯越嚴重，則更多的放射性同位素聚集骨髓，從而對正常骨髓的損傷更大。因此，在使用Zevalin或Bexxar治療前,必須仔細評價患者骨髓情況。淋巴瘤骨髓侵犯超過25%或發(fā)現(xiàn)骨髓功能不良者不宜接受Zevalin或Bexxar治療。由美國Peregrine Pharmaceuticals 公司研制的鼠源型單抗 Lym-1 (Oncolym)既可以引導(dǎo)放射性核素靶向到腫瘤局部殺死腫瘤細胞，還具有ADCC、CDC及誘導(dǎo)Raji細胞凋亡的作用殺傷腫瘤細胞。Lym-1經(jīng)放射性核素131I標(biāo)記后形成的1311-Lym-1與大多數(shù)惡性B細胞表面的HLA-DRlO抗原結(jié)合后可以引導(dǎo)放射性核素1311靶向到腫瘤局部殺死腫瘤細胞。中國專利ZL200410053872. O公開了將Lym-1的可變區(qū)基因和人IgGl的Yl和K恒定區(qū)基因融合，得到的一個低免疫原性的人鼠嵌合單抗(chLym-1)其中人源性序列為65%,鼠源性序列占35%。研究表明chLym-1有著和Lym-1相似的親和力，而且在攝取后的24-72小時內(nèi)chLym-1在腫瘤上的滯留量與Lym-1近乎相同。此外,chLym-1同樣具有誘導(dǎo)ADCC、CDC效應(yīng)及誘導(dǎo)淋巴瘤細胞凋亡效應(yīng)來直接殺死腫瘤細胞的能力。它誘導(dǎo)ADCC效應(yīng)的水平是鼠源型Lym-1的兩倍，而且即便在較低的抗體濃度的條件下也可誘導(dǎo)最大的ADCC效應(yīng)。因此新一代的人鼠嵌合型單克隆抗體chLym-1相對于鼠源型Lym-1具有表達率高、性能穩(wěn)定、腫瘤攝取率高、正常組織攝取率低、可增加效應(yīng)器功能、不易起HAMA反應(yīng)而降低免疫源性及自身殺傷腫瘤細胞能力優(yōu)秀等優(yōu)點，優(yōu)化了放免治療效果。但該藥物目前的研究僅限于腫瘤治療上的應(yīng)用，對于其它疾病的應(yīng)用還有待開發(fā)及拓展。中國專利申請200810034400. 9進一步揭示了 chlym_l在治療惡性淋巴瘤及自身免疫性疾病中的應(yīng)用。白血病是造血組織的惡性疾病，又稱“血癌”。其特點是骨髓及其它造血組織中有大量無核細胞無限制地增生，并進入外周血液，將正常血細胞的內(nèi)核明顯吸附，該病居年輕人惡性疾病中的首位，原生性病毒可能是神經(jīng)性負感組織增生，還有許多因素如食物的礦物放射性化、毒化(苯等)或藥物變異、遺傳素 質(zhì)等可能是致病的輔因子。根據(jù)白血病細胞不成熟的程度和白血病的自然病程，分為急性和慢性兩大類。我國急性白血病比慢性白血病多見(約5. 5 I)，其中急粒細胞白血病最多(1. 62/10萬)，其次為急淋白血病(O. 39/10萬)、慢粒白血病(O. 36/10萬)，慢淋白血病少見。目前對于白血病主要治療有下列幾類化學(xué)治療、放射治療、標(biāo)靶治療、中藥治療。部分高危險性病人，需要進行骨髓移植。近10年來，隨著分子生物學(xué)、生物遺傳學(xué)的進展，使白血病預(yù)后得到極大的改觀。本發(fā)明根據(jù)研制單抗的作用機理，進一步研究了 chlym-1在治療白血病上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對現(xiàn)有的抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體chLym_l的應(yīng)用進一步拓展，提供了其在治療白血病上的用途。本發(fā)明一方面公開了一種抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體用于制備治療白血病藥物的用途,所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體包括重鏈及輕鏈，其中，重鏈含恒定區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈含恒定區(qū)，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :2，重鏈及輕鏈通過二硫鍵相連。所述白血病可選自急性淋巴細胞白血病，早幼粒細胞白血病，急性粒細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病。·在一優(yōu)選例中，所述抗體重鏈恒定區(qū)為Y類型；而抗體輕鏈恒定區(qū)為K類型。
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在另一優(yōu)選例中，所述抗體是由NSO細胞株產(chǎn)生。較佳的，所述抗體的重鏈的恒定區(qū)為人抗體重鏈的恒定區(qū)，所述抗體的輕鏈的恒定區(qū)為人抗體輕鏈的恒定區(qū)。進一步的，所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體經(jīng)放射性同位素標(biāo)記。較佳的，上述放射性同位素選自1311、188Re、90Y或67Cu，優(yōu)選1311。本發(fā)明的抗體可作為主要活性成分與常用藥用輔料配伍制成藥物組合物用以治療白血病?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。例如每天約I微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的抗體還可與其他治療劑一起使用。本發(fā)明進一步拓展了抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體在治療白血病上的新用途，為白血病患者帶來了福音。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例1抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的制備采用中國專利(專利號200410053872. O)中記載的保藏號為CCTCC NO. 200405的小鼠骨髓瘤細胞株NSO-clym，將該細胞株接種于含10%血清、不含L-谷氨酰胺的SFM培養(yǎng)基中置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，將過濾后的無細胞上清上樣到MabSelect填充的FineLINE柱，上樣的濃度是30mg/ml。洗脫后，洗脫液立即用磷酸鉀中和PH值到6. 8-7.0。再用凝膠過濾檢測，結(jié)果表明純度在95%以上。將產(chǎn)品測序，結(jié)果為，抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID N0:2，符合預(yù)期。采用中國專利200410053872. O實施例4記載的方式檢測該抗體的親和常數(shù)Ka =3. βθΧΙΟ^οΓ1實施例2 131I標(biāo)記的抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的制備
采用氯胺-T碘化標(biāo)記法，將mI標(biāo)記到實施例1獲得的抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體上，制得產(chǎn)物的放射性比活度為llmCi/mg。采用實施例1的方式檢測該單抗的親和常數(shù)Ka = 3. ^ΧΚΛ οΓ1。實施例3抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體治療白血病的藥效學(xué)研究試驗方法(一 )細胞準備本實驗檢測的細胞均為懸浮細胞，實驗檢測48小時前1: 3傳代細胞，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640 (GIBCO)培養(yǎng)基中。IOOOrpm離心收集細胞，PBS洗漆2次。試驗細胞系淋巴瘤細胞系Raj1、白血病細胞系HL-60。(二)封閉封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合，封閉劑為1% BSA, PBS pH 7. 5。封閉30分鐘。(三)抗體孵育一抗孵育一抗為實施例1制備的人源化抗體ChLym-1抗體，孵育濃度為lug/ml，孵育時間60分鐘。PBST洗滌3次。二抗孵育二抗為Jackson公司的羊抗人FC片段抗體，使用濃度lug/ml，孵育時間30分鐘。PBST洗滌3次。`免疫熒光法中的二抗是熒光抗體，因此抗體孵育的時候必須避光。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥，抗體孵育在濕盒中進行。(四)流式檢測流式檢測各細胞表面ChLym-1抗原的表達情況。本實驗使用的流式細胞儀為Beckman FC500,檢測中使用只加二抗而未加入一抗的細胞作為對照細胞，以此計算各組細胞中陽性細胞的比例。試驗結(jié)果淋巴瘤細胞系Raji陽性率70%—80% M0LT-4 陽性率40%-50%白血病細胞系HL-60陽性率27%—35%。從結(jié)果上看，淋巴瘤細胞系表達較高，白血病細胞系有少數(shù)也表達lym-1，此試驗說明ChLym-1抗體有望作用與白血病細胞起到一定的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體用于制備治療白血病藥物的用途，所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體包括重鏈及輕鏈，其中，重鏈含恒定區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈含恒定區(qū)，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID N0:2，重鏈及輕鏈通過二硫鍵相連。
2.如權(quán)利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述白血病選自急性淋巴細胞白血病，早幼粒細胞白血病，急性粒細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病。
3.如權(quán)利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗體重鏈恒定區(qū)為Y類型；而抗體輕鏈恒定區(qū)為K類型。
4.如權(quán)利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗體的重鏈的恒定區(qū)為人抗體重鏈的恒定區(qū)，所述抗體的輕鏈的恒定區(qū)為人抗體輕鏈的恒定區(qū)。
5.如權(quán)利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗體是由NSO細胞株產(chǎn)生。
6.如權(quán)利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體經(jīng)放射性同位素標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求6所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述放射性同位素選自1311、 188Re、9°Y或67Cu。
全文摘要
本發(fā)明涉及惡性B細胞淋巴瘤抗體的新用途，公開了一種抗HLA-DR10的淋巴瘤特異性人源化抗體用于制備治療白血病藥物的用途，所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特異性人源化抗體包括重鏈及輕鏈，其中，重鏈含恒定區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNO:1，輕鏈含恒定區(qū)，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNO:2，重鏈及輕鏈通過二硫鍵相連。本發(fā)明進一步拓展了抗HLA-DR10的淋巴瘤特異性人源化抗體在治療白血病上的新用途，為白血病患者帶來了福音。
文檔編號A61K39/395GK103041387SQ201110306828
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者倪健, 潘健, 許國貞 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)晨健抗體組藥物開發(fā)有限公司