專利名稱：L-02細(xì)胞作為具有肝功能的細(xì)胞源的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及L-02細(xì)胞的肝細(xì)胞功能研究，及其在體外培養(yǎng)增殖后在肝細(xì)胞移植、治療急性肝功能衰竭和肝細(xì)胞功能相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究等中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性肝衰竭(Acute liver failure, ALF)死亡率很高，目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。但供肝數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的過(guò)程中死亡。除肝移植外，急性肝衰竭尚有兩種有效治療方法，即肝細(xì)胞移植和生物人工肝。用人源性肝細(xì)胞充填的生物人工肝是治療急性肝衰竭的一種公認(rèn)有效的方法，可有效降低急性肝功能衰竭死亡率，可作為肝移植前的一種過(guò)渡性治療。肝細(xì)胞移植可以明顯降低急性肝功能衰竭死亡率，促進(jìn)病肝再生和恢復(fù)，也可作為肝移植的過(guò)渡療法。肝細(xì)胞移植和生物人工肝都需要大量的肝細(xì)胞，很多肝細(xì)胞相關(guān)醫(yī)學(xué)研究也需要大量的肝細(xì)胞源，但目前人原代肝細(xì)胞的來(lái)源很困難，主要是可供分離肝細(xì)胞的肝臟來(lái)源不足，且原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖極為困難。其他的一些可用細(xì)胞系，如干細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞、異種肝細(xì)胞等，都有嚴(yán)重的不足，如永生化肝細(xì)胞潛在的致瘤危險(xiǎn)性，異種肝細(xì)胞強(qiáng)烈的排異反應(yīng)， 有關(guān)干細(xì)胞的研究尚不充分等。人胚胎肝細(xì)胞作為肝細(xì)胞移植和生物人工肝一種可用的細(xì)胞來(lái)源，已有相關(guān)研究證實(shí)了原代分離的胚胎肝細(xì)胞具有成人肝細(xì)胞類似的肝細(xì)胞功能。人胚胎肝細(xì)胞系L-02， 是上世紀(jì)80年代由國(guó)內(nèi)學(xué)者自行建系的胚胎肝細(xì)胞系，其體外培養(yǎng)容易，來(lái)源方便，目前多作為許多實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組細(xì)胞。但L-02細(xì)胞系是否具有肝細(xì)胞相關(guān)功能及是否能應(yīng)用于肝細(xì)胞移植和生物人工肝，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚無(wú)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對(duì)人胎肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞系進(jìn)行肝細(xì)胞功能研究，并將其應(yīng)用于肝細(xì)胞移植，研究其治療急性肝功能衰竭的效果，旨在提供一種新型可用、功能穩(wěn)定、來(lái)源充足的具有良好肝功能的細(xì)胞系來(lái)源。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明選擇了目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多且來(lái)源方便、經(jīng)無(wú)限繁代后的人胎肝細(xì)胞系L-02 細(xì)胞系，對(duì)其進(jìn)行肝細(xì)胞功能研究。將L-02細(xì)胞解凍后進(jìn)行培養(yǎng)增殖，其貼壁后增殖迅速， 傳代周期較穩(wěn)定，以新生牛血清培養(yǎng)2至3天即可傳代，可完全滿足實(shí)驗(yàn)的需求。對(duì)L-02 細(xì)胞進(jìn)行肝細(xì)胞功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞表達(dá)多種肝細(xì)胞特異性因子，包括白蛋白、膽紅素葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、凝血因子、轉(zhuǎn)氨酶等，表明其具有確切的肝細(xì)胞功能。為進(jìn)一步驗(yàn)證 L-02細(xì)胞對(duì)于急性肝衰竭的治療作用，本發(fā)明人選擇了大鼠90%肝切除誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝切除術(shù)后存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組大鼠，實(shí)驗(yàn)組大鼠30 天存活率達(dá)到70%以上，而對(duì)照組大鼠均于術(shù)后72小時(shí)內(nèi)死亡，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)存活30天大鼠進(jìn)行開(kāi)腹觀察可見(jiàn)明顯肝臟再生。同時(shí)抽血檢測(cè)血氨及肝功能指標(biāo)，證實(shí)L-02細(xì)胞能有效改善肝功能。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明所用的人胎肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞系來(lái)源方便，無(wú)成瘤危險(xiǎn)性，且易在體外大量培養(yǎng)增殖，適合臨床推廣。(2)本發(fā)明證明L-02細(xì)胞具有良好的肝細(xì)胞功能，可以作為良好的人源肝細(xì)胞替代來(lái)源，用于在治療急性肝功能衰竭中的應(yīng)用，為L(zhǎng)-02細(xì)胞在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究上的應(yīng)用奠定了基石出。


圖1 :SD大鼠肝臟解剖圖。圖2 顯微鏡下觀察L-02細(xì)胞(X 100)。圖3 =RT-PCR檢測(cè)L_02細(xì)胞肝細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)。從左至右依次為白蛋白 (ALB)、人凝血因子-X(HBCF-X)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。圖4 :ffestern-blot檢測(cè)L-02肝細(xì)胞白蛋白的表達(dá)。圖A從左至右依次為L(zhǎng)_02 細(xì)胞、Hepg-2細(xì)胞、人原代肝細(xì)胞；圖B為β -actin條帶。圖5 :L-02細(xì)胞免疫熒光染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記白蛋白，激光共聚焦顯微鏡下觀察白蛋白的分泌情況。圖A、圖B分別為20倍及60倍下觀察所見(jiàn)，肝細(xì)胞質(zhì)染成綠色顆粒狀。圖C 為100倍下所見(jiàn)，藍(lán)色為DAPI所染胞核，胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)綠染的白蛋白顆粒。圖6 :L-02細(xì)胞免疫熒光染色，TRITC標(biāo)記葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGTlAl)，激光共聚焦顯微鏡下觀察。圖A為60倍鏡下觀察所見(jiàn)，圖B為100倍鏡下見(jiàn)，藍(lán)色為DAPI所染的胞核。兩圖均可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)紅染的UGTlAl顆粒。圖7 :L_02移植、90%肝切除后分別測(cè)定并計(jì)算各組大鼠的存活率、血氨、白蛋白、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、直接膽紅素及堿性磷酸酶水平。其中Gl為移植L-02 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組，G2為對(duì)照組。圖8 裸鼠細(xì)胞種植后4周結(jié)果。圖中右肩為種植H印g_2細(xì)胞，左肩種植等量L-02 細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1L-02細(xì)胞的肝細(xì)胞功能檢測(cè)(一 )細(xì)胞培養(yǎng)-80°C取出事先凍存的L-02細(xì)胞，37°C水浴搖晃1分鐘使之溶解，加入15ml離心管中，同時(shí)加入少量DMEM培養(yǎng)基以去除DMSO的影響，1200rpm/min離心3分鐘，去上清，加入^iIDMEM高糖培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后投入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C 5% C02培養(yǎng)箱中。每隔24h換液一次，大約3天左右細(xì)胞長(zhǎng)到80%-90%融合后，按1 3比例傳代， 待細(xì)胞擴(kuò)增到足夠數(shù)量后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞(X 100)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞解凍后12h內(nèi)即可貼壁，24h后觀察細(xì)胞， 間細(xì)胞生長(zhǎng)較密集，呈多邊形，胞質(zhì)豐富，其內(nèi)可見(jiàn)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核，核仁清晰(見(jiàn)圖2)。
( 二)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)1. L-02肝細(xì)胞mRNA的提取DDEPC Iml加入999ml雙蒸水中制備DEPC水，留下部分作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用，余下用來(lái)浸泡實(shí)驗(yàn)器具，以去除RNA酶影響。2)棄去T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入約2ml Transhl (約IOcm2加Iml TransZol), 使細(xì)胞裂解，裂解的同時(shí)用槍頭反復(fù)吹吸數(shù)次，室溫孵育5分鐘后轉(zhuǎn)入Ep管。3)加入0. 4ml氯仿(每Iml TransZol加0. 2ml氯仿)，劇烈震蕩15秒，室溫放置 3分鐘。4) 10000g/min，4°C離心15分鐘。此時(shí)可見(jiàn)Ep內(nèi)液體分3層，其中RNA位于最上層水相中。5)轉(zhuǎn)上層水相至一新的Ep管中，加入Iml異丙醇(1ml TransZol加500 μ L異丙醇)，充分混勻后室溫放置10分鐘。6) 10000g/min，4°C離心10分鐘，去上清，可見(jiàn)于Ep管底和管側(cè)形成膠樣沉淀。7)加入anl由DEPC水配制而成的75%乙醇，每Iml TransZol至少加Iml乙醇， 劇烈渦旋振蕩。8)7500g，4°C離心 5 分鐘。9)去上清，超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)干燥約5分鐘，但不能完全干燥。10)加入100 μ L RNA溶解液以使沉淀溶解。11) 550C -60°C孵育10分鐘，立即保存RNA樣本于_70°C或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。2.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 1)于0. 2ml Ep管中依次加入以下試劑(20 μ L體系)
權(quán)利要求
1.L-02細(xì)胞用于作為肝細(xì)胞移植的細(xì)胞源的應(yīng)用。
2.L-02細(xì)胞用于作為生物人工肝的細(xì)胞源的應(yīng)用。
3.L-02細(xì)胞用于肝功能相關(guān)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用。
4.按權(quán)利要求1或2所述的L-02細(xì)胞在治療急性肝功能衰竭疾病上的應(yīng)用。
5.按權(quán)利要求1或2所述的L-02細(xì)胞在治療其他肝功能衰竭疾病上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明對(duì)人胎肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞系進(jìn)行了肝細(xì)胞功能研究，并將其應(yīng)用于肝細(xì)胞移植。研究發(fā)現(xiàn)L-02細(xì)胞具有良好的肝細(xì)胞功能，能夠表達(dá)多種肝細(xì)胞特異性因子，包括白蛋白、膽紅素葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、凝血因子、轉(zhuǎn)氨酶等。大鼠90％肝切除誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型實(shí)驗(yàn)表明，L-02細(xì)胞能有效延長(zhǎng)急性肝衰竭大鼠的存活時(shí)間，且無(wú)成瘤危險(xiǎn)性，有望成為肝細(xì)胞移植、生物人工肝和肝細(xì)胞功能相關(guān)醫(yī)學(xué)研究等的較好細(xì)胞來(lái)源，用于治療急性肝功能衰竭和肝細(xì)胞功能研究等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102397583SQ201110307209
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者周平, 孟凡迎, 楊濤, 林菊生, 胡昕鵬 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院