專利名稱：促使骨髓間充質干細胞在大鼠腦內分化成神經元的新方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過病毒載體體外轉導神經營養(yǎng)因子編碼基因，促使腦內移植的骨髓間充質干細胞高效定向分化成神經元，同時旁分泌神經營養(yǎng)因子營養(yǎng)、支持周圍神經細胞的方法。
背景技術：
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)起源于中胚層，是成纖維細胞、成骨細胞、脂肪細胞等多種基質細胞的前體細胞，具有較強的增殖能力和多分化潛能。MSCs可通過貼壁培養(yǎng)達到較高的純度。MSCs在體外可被誘導分化為表達NeuN的神經元和表達GFAP的神經膠質細胞。將MSCs移植到腦組織中，可長期存活，并向神經細胞分化。但實驗表明植入腦的MSCs大部分分化為神經膠質細胞，分化為神經元樣細胞的比例較小。過多的神經膠質細胞不但對改善神經功能無益，還可導致膠質疤痕形成等副作用。因此，如何提高腦內移植的MSCs向神經元分化，特別是能夠建立正確突觸聯(lián)系的神經元，是間充質干細胞治療退化性神經系統(tǒng)疾病的關鍵。 腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic factor, BDNF)是神經營養(yǎng)因子(neurotrophin)家族成員之一,對神經細胞具有普遍的營養(yǎng)、支持作用，可促使神經干細胞增殖并向神經元分化。當將BDNF和骨髓細胞混合移植到大鼠大腦中動脈閉塞梗塞邊緣區(qū)時，BDNF可以促進腦內移植的MSCs增殖并向神經元分化。但是BDNF蛋白質在腦的半壽期很短，所以將BDNF與MSCs混合移植，并不能讓BDNF充分發(fā)揮其生物功能，因此必須尋找一種可以使BDNF長期作用于植入的MSCs的方法。當代基因工程技術提供了各種載體，可將基因片段導入細胞中表達。其中逆轉錄病毒基因載體是較為廣泛應用的一種。該載體可將外源基因整合到靶細胞的基因組中，因此可使目的基因在靶細胞中長期、穩(wěn)定表達。已有實驗表明逆轉錄病毒可將外源基因導入MSCs并穩(wěn)定表達。因此，利用逆轉錄病毒將BDNF基因導入MSCs，然后將攜帶重組BDNF基因的MSCs植入腦內，在BDNF的作用下，可使這種基因修飾后的MSCs的腦內存活率及神經元分化比率大大提高，同時大量旁分泌的BDNF，可以營養(yǎng)、支持腦出血后遺癥、帕金森癥、阿爾茨海默癥等病變組織及其周圍的神經細胞。因此本發(fā)明可為干細胞移植治療腦血管疾病、老年癡呆、腦外傷后遺癥、神經系統(tǒng)變性疾病等提供來源充足、取自自體的種子細胞，并使種子細胞更好地修復補充受損神經元，維持殘存神經元。另外，利用MSCs在體內的歸巢性，還可將載有目的基因的MSCs用于治療遺傳性神經病和神經系統(tǒng)其他疾病，同時為相關的藥物開發(fā)和篩選提供一種新的模式。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種通過攜帶人BDNF編碼基因的逆轉錄病毒，將BDNF基因導入MSCs，經篩選獲得攜帶重組BDNF基因的MSCs (BDNF-MSCs)，將BDNF-MSCs植入腦，在自分泌的BDNF誘導下定向分化成神經元的方法。技術方案如下從人骨髓中分離得到hMSCs，再利用反復貼壁培養(yǎng)純化。從人的神經母細胞瘤細胞中克隆人BDNF的cDNA片段，構建重組質粒pMSCV-hBDNF，建立逆轉錄病毒細胞株。制備病毒并純化。以重組BDNF基因的逆轉錄病毒感染MSCs，通過耐藥基因篩選，使BDNF在MSCs內穩(wěn)定表達。本發(fā)明能夠在通過高效轉導使外源性基因在MSCs中穩(wěn)定表達的同時，保持MSCs在體內、體外的多能性和其他生物特性。本發(fā)明的另一個主要內容是通過特定的細胞密度和注射方式，使BNDF-MSCs在腦內分化為神經元細胞，同時通過旁分泌BDNF營養(yǎng)、支持周圍神經細胞。通過DAPI核染色區(qū)分供體細胞和自體細胞，利用神經細胞特異表型蛋白可以證明BDNF-MSCs在腦內向神經元分化的比例為55%，而未經基因修飾的MSCs在腦內向神經元分化的比例為10%。
具體實施方式
實施例1、攜帶hBDNF編碼基因的逆轉錄病毒的制備離心收集2 3X106神經母細胞瘤(SK-N-SH)細胞，抽提總RNA，構建cDNA文庫，以SK-N-SH cDNA為模板，PCR引物為5 ’ -ATGACCATCCTTTTCCTTAC-3’，5 ’ -CTATCTTCCCCTTTTAATGG-3，克隆hBDNF的cDNA，并將其連接到T-載體上進行測序。得到的hBDNF的氨基酸序列如下MT ILFLTMVI SYFGCMKAAP MKEANIRGQG GLAYPGVRTH GTLESVNGPK AGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPN EENNKDADLY TSRVMLSSQV PLEPPLLFLL EEYKNYLDAA 匪SMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTA ADKKTAVDMS GGTVTVLEKV PVSKGQLKQY FYETKCNPMG YTKEGCRGIDK 麗 NSQCRTTQSYVRALTM DSKKRIGffRF IRIDTSCVCT構建的pMSCV-hBDNF逆轉錄病毒質粒以pMSCV_neo為載體，含有完整的hBDNF氨
基酸編碼序列。在對數(shù)期生長的PT67細胞中加入pMSCV-hBDNF質粒和脂質體進行轉染，然后用500ug/ml G418篩選耐藥細胞。待抗性克隆形成后用不含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)瓶置于-20°C過夜，化凍后將培養(yǎng)液4°C 500gX5min離心，吸取上清，即得到含重組hBDNF基因的逆轉錄病毒原液。測定病毒原液滴度后，病毒原液4°C 50，000gX90min離心,棄上清，溶于1/50體積的TNE中即為病毒存儲液，病毒存儲液按一次用量分裝，可在_70°C長期保存。實施例2、通過逆轉錄病毒感染轉導BDNF編碼基因將Pl代MSCs按lX104Cells/Cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，然后按細胞與病毒顆粒比例1: 10感染8小時后，用無病毒培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，再用250ug/ml G418選擇培養(yǎng)。待抗性克隆形成后，換用不含G418的培養(yǎng)液。ELISA法測定結果顯示BDNF_MSCs培養(yǎng)液中BDNF水平顯著高于未經BDNF基因修飾的MSCs培養(yǎng)液中的BDNF水平。實施例3、大鼠腦內移植的BDNF-MSCs定向誘導為神經元
用2. 4cGy Y射線照射Wistar大鼠，對其進行免疫消減。24小時后利用大鼠腦立體定向儀，按照《大鼠腦立體定向圖譜》的指示，在大鼠紋狀體前部注射經DAPI核染色的BDNF-MSCs。坐標為前囪前1. 0mm,旁開2. 5mm,硬膜下4. 5mm。注入細胞懸浮液量為20ul (含5X106 BDNF-MSCs)，注射速度為lul/min，留針lOmin，緩慢退針lmm/min。細胞移植后I天、3天、6天、15天、30天,剪心處死大鼠,4%多聚甲醇/0.1M PBS固定液主動脈灌注固定腦組織，冰凍切片。用NeuN、GFAP、Nestin免疫組化抗體結合熒光二抗標記。結果BDNF-MSCs (DAPI陽性細胞)在正常大鼠及H)模型大鼠腦紋狀體內長期存活，其中55%的BDNF-MSCs分化成神經元樣細胞(NeuN陽性 細胞)。
權利要求
1.誘導移植的人骨髓間充質干細胞在腦內高效向神經元細胞定向分化的方法，其特征是移植前的干細胞攜帶表達hBNDF編碼基因的病毒載體。
2.按照權利要求1對間充質干細胞進行誘導的方案，其特征在于該類干細胞表達人腦源性神經營養(yǎng)因子(hBNDF)編碼基因。
3.按照權利要求1對間充質干細胞進行誘導的方案，其特征在于人腦源性神經營養(yǎng)因子(hBNDF)編碼基因是通過逆轉錄病毒載體導入干細胞。
4.按照權利要求1或2對間充質干細胞進行誘導的方案，其特征在于重組逆轉錄病毒以特定時間和濃度感染間充質干細胞，可使外源基因在間充質干細胞內穩(wěn)定表達。
5.按照權利要求1對間充質干細胞進行誘導的方案，其特征在于通過腦立體定向局部注射的方法將攜帶重組人腦源性神經營養(yǎng)因子(hBNDF)編碼基因的間充質干細胞移植入腦內。
6.按照權利要求1或5對間充質干細胞進行誘導的方法，其特征在于移植部位為尾狀核頭部。
7.按照權利要求1或5對間充質干細胞進行誘導的方法，其特征在于以特定的細胞密度及注射體積進行移植。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使大鼠腦內移植的骨髓間充質干細胞定向分化成神經元的方法。具體步驟包括從骨髓分離間充質干細胞并進行擴增和純化；并通過PCR克隆為人腦源性神經營養(yǎng)因子(hBNDF)蛋白編碼的cDNA序列，構建攜帶hBNDF編碼基因的表達載體，最終將表達hBNDF編碼基因的間充質干細胞通過腦立體定向方法移植入大鼠腦內。在hBNDF的誘導下，間充質干細胞定向分化成神經元的數(shù)量明顯增多。本發(fā)明提供的方法可大大提高腦內移植的間充質干細胞向神經元分化的數(shù)量，為神經系統(tǒng)疾病的干細胞治療開拓了新方法，具有廣闊的臨床應用前景。
文檔編號A61K35/28GK103045540SQ20111031049
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權日2011年10月14日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細胞科技有限公司