專利名稱：一種采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種 獸用生物制品，特別是涉及一種采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)生產(chǎn)豬痕活疫苗的方式主要有脾淋疫苗(動物組織法)、細(xì)胞疫苗。細(xì)胞疫苗又分為原代(牛睪丸細(xì)胞)和傳代(豬睪丸細(xì)胞)兩種細(xì)胞生產(chǎn)方式。脾淋疫苗的免疫保護力要好于細(xì)胞疫苗，但一只兔子僅能生產(chǎn)500頭份效力不低于100 PD50的豬瘟疫苗。僅在中國，每年的豬瘟疫苗的市場容量不低于14億頭份，這相當(dāng)于需要280萬只兔子來制備這些疫苗，如此龐大的數(shù)量，是不可能實現(xiàn)的。所以，細(xì)胞疫苗是未來生產(chǎn)豬瘟活疫苗的發(fā)展方向。目前，前面提到的兩種細(xì)胞均可用于豬瘟活疫苗的生產(chǎn)。當(dāng)采用牛睪丸原代細(xì)胞生產(chǎn)時，存在一種外源病毒BVDV的感染風(fēng)險，一旦牛睪丸原代細(xì)胞感染BVDV，將極大影響豬瘟活疫苗的質(zhì)量；另外，牛睪丸原代細(xì)胞的制備來源很受限制，它需要從活體組織上獲取。由此，傳代細(xì)胞更適合豬瘟活疫苗的生產(chǎn)。近年來，利用豬睪丸傳代細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗已在國內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，其生產(chǎn)用細(xì)胞主要采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，當(dāng)大規(guī)模生產(chǎn)時，需要大量的人力和物力，生產(chǎn)效率低；細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)生長和產(chǎn)毒時，營養(yǎng)供應(yīng)、環(huán)境pH、培養(yǎng)基內(nèi)含氧情況都不能及時調(diào)整，轉(zhuǎn)瓶內(nèi)的細(xì)胞密度只有0.5 I X IO6個/ml，這些都會影響疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量；由于每瓶內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)不盡相同，進而導(dǎo)致產(chǎn)品的均一性很差，從而造成疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量水平有較大的波動。這些都不利于優(yōu)質(zhì)、高效地生產(chǎn)豬瘟疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，為了能夠優(yōu)質(zhì)、高效地生產(chǎn)豬瘟疫苗，而提供一種創(chuàng)新的豬瘟活疫苗生產(chǎn)方式，即采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過生物反應(yīng)器高效生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法。本發(fā)明選用了一種完全不同的傳代細(xì)胞系，小型豬腎細(xì)胞(MPK)。經(jīng)馴化，豬瘟病毒可以很好地在該細(xì)胞系內(nèi)快速增殖；由于該細(xì)胞系為豬源細(xì)胞，所以可降低疫苗注射后異源蛋白引起的不良反應(yīng)；同時該細(xì)胞系生長時對營養(yǎng)條件要求不十分苛刻，因而適合大規(guī)模、高密度培養(yǎng)。本發(fā)明由于米用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可使細(xì)胞密度達到8 16X IO6個/ml，由此得到的病毒培養(yǎng)液的收獲量與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比可提高20 40倍，因此顯著提高了豬瘟活疫苗的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量，同時也降低了生產(chǎn)成本，減輕了疫苗的副反應(yīng)，還增強了疫苗生產(chǎn)的批次穩(wěn)定性，得到了更為安全和有效的豬瘟活疫苗。為了達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明給出的技術(shù)解決方案是:這種采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特點是將傳代貼壁細(xì)胞MPK細(xì)胞接種到裝有微載體的生物反應(yīng)器中，細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)灌注的方式加入生物反應(yīng)器，MPK細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)快速增殖，當(dāng)細(xì)胞密度穩(wěn)定后接種豬瘟病毒，并開始連續(xù)收獲豬瘟病毒培養(yǎng)液，由此得到的病毒培養(yǎng)液經(jīng)澄清、濃縮，在加入穩(wěn)定劑和緩沖液配苗后，真空冷凍干燥制成豬瘟活疫苗，具體步驟為:(I)將MPK細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)擴增；(2)經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)得到足量的細(xì)胞后，接種到裝有微載體的生物反應(yīng)器中開始高密度細(xì)胞增殖培養(yǎng)；(3)當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度增長穩(wěn)定后，接種豬瘟病毒；(4)在接種病毒后第三天，開始連續(xù)收獲反應(yīng)器內(nèi)的病毒培養(yǎng)液，收獲期維持25 35天；(5)收集到的病毒培養(yǎng)液，經(jīng)澄清、濃縮，加入穩(wěn)定保護劑和PH緩沖液配制成疫苗原液，再將原液分 裝，經(jīng)冷凍干燥得到豬瘟活疫苗成品。本發(fā)明提及豬瘟病毒的細(xì)胞感染毒株為來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的豬瘟兔化弱毒株，屬于現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明提及的MPK細(xì)胞為Minipig Kidney Cell，是一種傳代貼壁細(xì)胞系。經(jīng)對微載體的貼壁適應(yīng)性馴化，得到適應(yīng)在微載體上貼壁生長的特異性MPK細(xì)胞。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，使用的微載體為NBS公司的Fibra Disk、GE公司的Cytodex I和Cytodex 3中的一種；使用的生物反應(yīng)器為NBS公司帶有CELL LIFT IMPELLER和DECANTER的細(xì)胞培養(yǎng)罐，或者是NBS公司帶有BASKET的細(xì)胞培養(yǎng)罐中的一種。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述步驟(I)、(2)中使用的細(xì)胞生長培養(yǎng)基是經(jīng)過優(yōu)化的，適合MPK細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。每升液體培養(yǎng)基含有5 8克的高糖DMEM，3.5
5.5克的M199，1.5 3克的NaHCO3, 50 120毫升的牛血清；培養(yǎng)基的pH為7.2 7.4。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，MPK細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)適宜生長溫度為36.5 37.50C，適宜培養(yǎng)pH為7.0 7.5，適宜溶氧值為25% 85%，適宜攪拌速度為30 120rpm ο為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，MPK細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)生長時，培養(yǎng)基的灌注速度根據(jù)培養(yǎng)基中糖類的代謝消耗變化和乳酸的代謝累積變化，階段性調(diào)整灌注速度，每天的培養(yǎng)基消耗量為0.5 5個生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述步驟(3)中，細(xì)胞經(jīng)高密度培養(yǎng)后，密度可達到8 16X IO6 個/ml。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述步驟(4)中，細(xì)胞培養(yǎng)基更換為經(jīng)優(yōu)化的維持培養(yǎng)基，每升液體培養(yǎng)基含有5 8克的高糖DMEM，3.5 5.5克的M199，1.5 3克的NaHCO3, 50 120毫升的牛血清；培養(yǎng)基的pH為7.2 7.4，該培養(yǎng)基可延長病毒收獲期。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述步驟(5)中，最后得到的豬瘟活疫苗可在2 8°C條件下保存12月，疫苗的生物活性不損失。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:提供了一種采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，通過此種方法可得到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的疫苗。其優(yōu)勢特點集中為:(O細(xì)胞密度是轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的10 20倍；(2)收獲的病毒量是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的20 40倍；(3)制得的疫苗的免疫活性可在2 8°C條件下保存12月；(4)采用生物反應(yīng)器和微載體培養(yǎng)技術(shù)極大降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率；(5)疫苗成品的均一性和穩(wěn)定性得到了大幅提高。利用本發(fā)明可得到免疫保護性良好的豬瘟活疫苗。


圖1:Fibra Disk微載體培養(yǎng)病毒滴度和培養(yǎng)基殘?zhí)橇壳€圖。圖2:cytodex I微載體培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線圖。
圖3:cytodex I微載體培養(yǎng)病毒滴度和培養(yǎng)基殘?zhí)橇壳€圖。圖4:cytodex 3微載體培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線圖。圖5:cytodex 3微載體培養(yǎng)病毒滴度和培養(yǎng)基殘?zhí)橇壳€圖。
具體實施例方式為使本發(fā)明的優(yōu)點和 特點更加容易理解，下面通過三種微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)方式，結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或者替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1。(I)選擇微載體:NBS公司的Fibra Disk。(2)選擇反應(yīng)器:NBS公司的帶有BASKET的5升細(xì)胞培養(yǎng)罐。(3)本實施例中選用小型豬腎細(xì)胞(MPK)，MPK細(xì)胞按1: 2 8的比例在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶中傳代培養(yǎng)，通常每個代次細(xì)胞的生長時間為48 72h。當(dāng)細(xì)胞匯合率超過80%后，向生物反應(yīng)器中接種細(xì)胞。(4)接種生物反應(yīng)器的細(xì)胞，與經(jīng)優(yōu)選的微載體裝量為100克，完全貼壁后，細(xì)胞密度達到1.5X IO6個細(xì)胞/ml，開始連續(xù)灌注培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)過程控制條件:生長溫度36.5 37.5°C、攪拌速度60 120rpm、pH值為7.0 7.4、溶解氧濃度為30 80%和葡萄糖含量為1500 4500mg/L，5L生物反應(yīng)器中細(xì)胞增殖后密度穩(wěn)定在14X IO6個/ml。(5)細(xì)胞感染毒株為來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的豬瘟兔化弱毒株。(6)病毒接種前，停止灌注培養(yǎng)，接種MOI為350的豬瘟病毒，24 48小時后繼續(xù)灌注培養(yǎng)。接毒后第3天收獲病毒液，連續(xù)收獲32天，收獲的病毒液低溫保存。收獲期間病毒滴度不低于105_°的兔感染量(RID)。(7)將連續(xù)收集的病毒液經(jīng)1.2 μ m的濾膜澄清，再經(jīng)300KD的超濾膜包濃縮6倍。(8)制劑凍干:向濃縮后病毒液加入優(yōu)化的含4%的右旋糖酐，3%的甘氨酸和5%的蔗糖的磷酸鹽緩沖液作為穩(wěn)定保護劑，進行真空冷凍干燥得到豬瘟活疫苗制劑。按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗，符合“豬瘟細(xì)胞活疫苗”的相關(guān)規(guī)定。實施例2。(I)選擇生物反應(yīng)器:NBS細(xì)胞提升式攪拌槳(CELL LIFT MPELLER)生物反應(yīng)器。(2)選擇微載體:GE公司的Cytodex I型微載體。(3)本實施例中選用小型豬腎細(xì)胞(MPK)，MPK細(xì)胞按1: 2 8的比例在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶中傳代培養(yǎng)，通常每個代次細(xì)胞的生長時間為48 72h。當(dāng)細(xì)胞匯合率超過80%后，向生物反應(yīng)器中接種細(xì)胞。(4)反應(yīng)器內(nèi)裝有 微載體Cytodex I適合范圍在每升10 25克，本次使用20克/升，接種細(xì)胞后密度為1.2 X 1O6個細(xì)胞/ml，并加入適量的培養(yǎng)基，開始連續(xù)灌注培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)過程控制條件:生長溫度36.5 37.5°C、攪拌速度30 70rpm、pH值為7.0
7.4、溶解氧濃度為20 50%和葡萄糖含量為1500 4500mg/L，5L生物反應(yīng)器中細(xì)胞增殖后密度穩(wěn)定在11 X IO6個/ml。細(xì)胞生長曲線如圖2。
(5)細(xì)胞感染毒株為來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的豬瘟兔化弱毒株。(6)病毒接種前，停止灌注培養(yǎng)，接種MOI為300的豬瘟病毒，24 48小時后繼續(xù)灌注培養(yǎng)。接毒后第3天收獲病毒液，連續(xù)收獲30天，收獲的病毒液低溫保存。收獲期間病毒滴度不低于105_°的兔感染量(RID)。病毒滴度和培養(yǎng)基殘?zhí)橇壳€如圖3。(7)將連續(xù)收集的病毒液經(jīng)1.0 μ m的濾膜澄清，再經(jīng)100KD的超濾膜包濃縮8倍。(8)制劑凍干:向濃縮后病毒液加入優(yōu)化的含4%的右旋糖酐，2.5%的甘氨酸和5%的乳糖的磷酸鹽緩沖液作為穩(wěn) 定保護劑，進行真空冷凍干燥得到豬瘟活疫苗制劑。按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗，符合“豬瘟細(xì)胞活疫苗”的相關(guān)規(guī)定。實施例3。(I)選擇生物反應(yīng)器:NBS細(xì)胞提升式攪拌槳(CELL LIFT MPELLER)生物反應(yīng)器。(2)選擇微載體:GE公司的Cytodex 3型微載體。(3)本實施例中選用小型豬腎細(xì)胞(MPK)，MPK細(xì)胞按1: 2 8的比例在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶中傳代培養(yǎng)，通常每個代次細(xì)胞的生長時間為48 72h。當(dāng)細(xì)胞匯合率超過80%后，向生物反應(yīng)器中接種細(xì)胞。(4)反應(yīng)器內(nèi)裝有微載體Cytodex 3適合范圍在每升10 20克，本次使用15克/升，接種細(xì)胞后密度為0.9X IO6個細(xì)胞/ml，并加入適量的培養(yǎng)基，開始連續(xù)灌注培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)過程控制條件:生長溫度36.5 37.5°C、攪拌速度50 80rpm、pH值為7.0
7.4、溶解氧濃度為25 50%和葡萄糖含量為1500 4500mg/L，5L生物反應(yīng)器中細(xì)胞增殖后密度穩(wěn)定在10X IO6個/ml。細(xì)胞生長曲線如圖4。(5)細(xì)胞感染毒株為來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的豬瘟兔化弱毒株。(6)病毒接種前，停止灌注培養(yǎng)，接種MOI為250的豬瘟病毒，24 48小時后繼續(xù)灌注培養(yǎng)。接毒后第3天收獲病毒液，連續(xù)收獲27天，收獲的病毒液低溫保存。收獲期間病毒滴度不低于105_°的兔感染量(RID)。病毒滴度和培養(yǎng)基殘?zhí)橇壳€如圖5。(7)將連續(xù)收集的病毒液經(jīng)0.8 μ m的濾膜澄清，再經(jīng)100KD的超濾膜包濃縮10倍。(8)制劑凍干:向濃縮后病毒液加入優(yōu)化的含2.5%的右旋糖酐，4%的甘氨酸和5%的麥芽糖的磷酸鹽緩沖液作為穩(wěn)定保護劑，進行真空冷凍干燥得到豬瘟活疫苗制劑。按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗，符合“豬瘟細(xì)胞活疫苗”的相關(guān)規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于將傳代貼壁細(xì)胞MPK細(xì)胞接種到裝有微載體的生物反應(yīng)器中，細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)灌注的方式加入生物反應(yīng)器，MPK細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)快速增殖，當(dāng)細(xì)胞密度穩(wěn)定后接種豬瘟病毒，并開始連續(xù)收獲豬瘟病毒培養(yǎng)液，由此得到的病毒培養(yǎng)液經(jīng)澄清、濃縮，在加入穩(wěn)定劑和緩沖液配苗后，真空冷凍干燥制成豬瘟活疫苗，具體步驟為: (1)將MPK細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)擴增； (2)經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)得到足量的細(xì)胞后，接種到裝有微載體的生物反應(yīng)器中開始高密度細(xì)胞增殖培養(yǎng)； (3)當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度增長穩(wěn)定后，接種豬瘟病毒； (4)在接種病毒后第三天，開始連續(xù)收獲反應(yīng)器內(nèi)的病毒培養(yǎng)液，收獲期維持25 35天; (5)收集到的病毒培養(yǎng)液，經(jīng)澄清、濃縮，加入穩(wěn)定保護劑和pH緩沖液配制成疫苗原液，再將原液分裝，經(jīng)冷凍干燥得到豬瘟活疫苗成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于使用的微載體為NBS公司 的Fibra Disk、GE公司的Cytodex I和Cytodex 3中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于使用的生物反應(yīng)器為NBS公司帶有CELL LIFT IMPELLER和DECANTER的細(xì)胞培養(yǎng)罐，或者是NBS公司帶有BASKET的細(xì)胞培養(yǎng)罐中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于所述步驟(I)、(2)中使用的細(xì)胞生長培養(yǎng)基是經(jīng)過優(yōu)化的，適合MPK細(xì)胞生長的培養(yǎng)基；每升液體培養(yǎng)基含有5 8克的高糖DMEM，3.5 5.5克的M199，1.5 3克的NaHCO3, 50 120毫升的牛血清；培養(yǎng)基的pH為7.2 7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于MPK細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)適宜生長溫度為36.5 37.5°C，適宜培養(yǎng)pH為7.0 7.5，適宜溶氧值為25% 85%，適宜攪拌速度為30 120 rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于MPK細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)生長時的培養(yǎng)基灌注速度根據(jù)培養(yǎng)基中糖類的代謝消耗變化和乳酸的代謝累積變化，階段性調(diào)整灌注速度，每天的培養(yǎng)基消耗量為0.5 5個生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(3)中細(xì)胞經(jīng)高密度培養(yǎng)后，密度達到8 16X IO6個/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(4)中細(xì)胞培養(yǎng)基為經(jīng)優(yōu)化的維持培養(yǎng)基；每升液體培養(yǎng)基含有5 8克的高糖DMEM，3.5 5.5克的M199，1.5 3克的NaHCO3, 50 120毫升的牛血清；培養(yǎng)基的pH為7.2 7.4。
全文摘要
一種采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特點是將傳代貼壁細(xì)胞MPK細(xì)胞接種到裝有微載體的生物反應(yīng)器中，細(xì)胞生長所需的培養(yǎng)基灌注到生物反應(yīng)器，MPK細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)快速增殖，當(dāng)細(xì)胞密度穩(wěn)定后接種豬瘟病毒，并開始連續(xù)收獲豬瘟病毒培養(yǎng)液，得到的病毒培養(yǎng)液經(jīng)澄清、濃縮，在加入穩(wěn)定劑和緩沖液配苗后，真空冷凍干燥制成豬瘟活疫苗。本發(fā)明采用微載體高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞密度在生物反應(yīng)器內(nèi)可達到8～16×106個/ml，病毒培養(yǎng)液的收獲量比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的提高了20～40倍，顯著提高豬瘟活疫苗生產(chǎn)效率和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，減輕疫苗的副反應(yīng)，增強疫苗生產(chǎn)的批次穩(wěn)定性，得到更為安全有效的豬瘟活疫苗。
文檔編號A61P31/14GK103083653SQ20111033206
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者陳曉鋒, 高軍, 侯劍英 申請人:遼寧成大動物藥業(yè)有限公司