專利名稱：表達(dá)BDNF-HA₂TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組載體的應(yīng)用，具體地說，是一種表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抑郁障礙存在海馬神經(jīng)元萎縮、細(xì)胞凋亡加速、神經(jīng)元再生障礙等神經(jīng)病理學(xué)改變。如何有效的保護(hù)海馬神經(jīng)元一直是抑郁障礙研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的重要成員,BDNF表達(dá)下調(diào)可能參與慢性應(yīng)激所致抑郁癥海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變。將外源性BDNF注入強(qiáng)迫游泳和學(xué)習(xí)無助的抑郁大鼠模型的海馬齒狀回可以產(chǎn)生抗抑郁樣活性，這說明BDNF中樞給藥對(duì)于抑郁癥來說是有效的。然而BDNF抗抑郁作用的發(fā)揮一方面有賴于其有效的中樞血藥濃度，另一方面中樞多次給藥以及輸注設(shè)備持久存在會(huì)引起神經(jīng)組織的額外損傷。盡管外周靜脈內(nèi)給藥簡(jiǎn)便、無損傷，但由于BDNF在血液循環(huán)中存在降解和血腦屏障的通透性問題，以致很難到達(dá)中樞神經(jīng)的保護(hù)效應(yīng)。腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一無致病性的單鏈 DNA病毒，也是已知的唯一能與人基因組特異染色體定點(diǎn)整合的天然復(fù)制缺陷病毒。它無明顯的致病性，無免疫源性及炎癥反應(yīng)；不能獨(dú)立復(fù)制，在無輔助病毒(如腺病毒、皰疹病毒)感染時(shí)，AAV只能整合在宿主細(xì)胞的DNA中，呈潛伏感染狀態(tài)，插入的外源基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移外源基因時(shí)不伴隨任何病毒基因的表達(dá)。AAV以點(diǎn)特異方式固定地整合在人19 號(hào)染色體上，不存在致癌及插入突變；宿主范圍廣，不僅可感染分裂期細(xì)胞，對(duì)非分裂期細(xì)胞(如神經(jīng)元、肌細(xì)胞等)也較敏感?；谝陨咸攸c(diǎn)而開發(fā)的腺相關(guān)病毒載體是繼腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒后出現(xiàn)的新型基因治療工具。如果將BDNF基因序列導(dǎo)入AAV載體，則可以持續(xù)分泌表達(dá)BDNF。近年來，經(jīng)鼻入腦的給藥方式為國(guó)內(nèi)外中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥方式研究的熱點(diǎn)，這種給藥方式既可以避免腹腔或靜脈注射途徑中需經(jīng)血液循環(huán)入腦而引起的全身副作用，又可以避免在血液循環(huán)中降解過快，并且有著腦內(nèi)藥物濃度高的優(yōu)點(diǎn)。以往的研究發(fā)現(xiàn)脂溶性好的小分子物質(zhì)(小于IOkD)可以沿“鼻-腦”通路入腦，但大分子蛋白難以沿此通路入腦。 由于在基因治療中對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有治療作用的基因產(chǎn)物多為大分子蛋白，因此，尋求將大分子蛋白經(jīng)“鼻-腦”通路導(dǎo)入腦內(nèi)的方法，將為解決基因治療的難題提供一種新的思路和方法。穿膜肽為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的短肽，研究發(fā)現(xiàn)它的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為新的非能量、非受體、非溫度依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，常用的穿膜肽有果蠅的Ant蛋白、TAT蛋白和人工合成的多聚精氨酸等。Murriel等通過腹腔注射穿膜肽2B2半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)穿膜肽能攜帶該蛋白通過血腦屏障到達(dá)腦組織，同時(shí)能保持酶的活性，且在該過程中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞及血腦屏障的免疫反應(yīng)很弱。上述實(shí)驗(yàn)均顯示穿膜肽能夠攜帶蛋白質(zhì)透過血腦屏障并保持蛋白的活性，同時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、血腦屏障的免疫性很弱。
中國(guó)專利文獻(xiàn)CN11M343C公開了一種由腦組織獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，涉及編碼了腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列以及用這些核酸順序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物，還涉及BDNF蛋白質(zhì)在制造治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)的藥物中的用途。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101078013A公開了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NT-3信號(hào)通路新成員Dok5的鑒定和應(yīng)用，克隆了人dok5的基因?yàn)橹委煻喾N神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的作用靶點(diǎn)，因此可用于開發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101302529A公開了共表達(dá)⑶NF和BDNF的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞，描述了一種構(gòu)建共表達(dá)GDNF和BDNF的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞的方法及其用途和意義，為臨床治療神經(jīng)退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一種轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞治療新途徑。王海珍等通過克隆人BDNF基因，構(gòu)建含有TAT-BDNF的重組表達(dá)載體，為進(jìn)一步表達(dá)融合蛋白及探討TAT攜帶BDNF穿透血腦屏障治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了基礎(chǔ)(詳見王海珍等.BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重組表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 神經(jīng)損傷與功能重建，2008，3(5) :304-306.)。李惠明等采用PCR和體外連接的方法構(gòu)建了帶有信號(hào)肽的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的融合基因，將此基因插入到腺相關(guān)病毒載體穿梭質(zhì)粒PSNAV，然后用重組質(zhì)粒pSNAV-Ig-BDNF轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，篩選出永久細(xì)胞株后，用攜帶腺相關(guān)病毒rep及cap基因的單純皰疹病毒超感染包裝細(xì)胞，成功包裝出含有目的基因的一型血清型腺相關(guān)病毒(詳見李惠明等.表達(dá)分泌型腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其表達(dá)的檢測(cè)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2008，24(2) :328-332.)。但是關(guān)于表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用，所述的表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒是由下列方法構(gòu)建得到的
a、克隆BDNFcDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_T Easy/BDNF轉(zhuǎn)化受體菌五Coli DH5 α，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA ；
b、酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帶穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒 pSSCMV-HA2TAT，構(gòu)建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ；
C、在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒PSSCMV-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒 PTO140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒上清，即表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。所述的步驟a中BDNF基因擴(kuò)增的上游引物和下游引物分別具有SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、本發(fā)明的表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒即可以分泌表達(dá)大分子蛋白BDNF，表達(dá)的BDNF又有穿過血腦屏障作用，同時(shí)將BDNF基因序列導(dǎo)入AAV載體，可以持續(xù)分泌表達(dá) BDNF，解決了 BDNF需反復(fù)給藥的難題；2、通過抗抑郁效力篩選實(shí)驗(yàn)證明了可分泌表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒具有抗抑郁的作用，建立了一種有效預(yù)防和治療抑郁障礙和應(yīng)激障礙等精神疾病的手段和方法。


附圖1是目的基因BDNF克隆結(jié)果1，DNA Marker ;2，PCR產(chǎn)物。附圖2是重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/ BDNF酶切鑒定結(jié)果1，重組質(zhì)粒；2，重組質(zhì)粒酶切；3，DNA Marker。附圖3是重組質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT酶切鑒定結(jié)果1，重組質(zhì)粒；2，重組質(zhì)粒酶切；3，DNA Marker。附圖4是重組質(zhì)粒PUC19-BDNF-HA2TAT酶切鑒定結(jié)果1，DNA Marker ；2，重組質(zhì)粒酶切；3，重組質(zhì)粒。附圖5是BDNF-HA2TAT測(cè)序結(jié)果。附圖6是Hela細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。附圖7是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給5d的FST結(jié)果。數(shù)據(jù)為mean士SEM，* ρ
<0. 05 ；_ ρ < 0. 001。附圖8是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給5d的OPF結(jié)果。數(shù)據(jù)為mean 士 SEM，** ρ
<0. 01。附圖9是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給IOd的FST結(jié)果。數(shù)據(jù)為mean士SEM，* ρ
<0. 05 ；** ρ < 0. 01 ；_ ρ < 0. 001。附圖10是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給IOd的OPF結(jié)果。數(shù)據(jù)為mean士 SEM，* ρ
<0. 05。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例1構(gòu)建包裝表達(dá)BDNF的重組腺相關(guān)病毒
克隆BDNF cDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_T Easy/BDNF轉(zhuǎn)化受體菌五Colim^ α，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定；酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帶穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT，重組質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT 經(jīng) EcoRI 和 BamHI 酶切制備BDNF-HA2TAT片段并連接到PUC19質(zhì)粒中測(cè)序；在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒 Psscmv-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒prei40三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，制備表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒，純化病毒，滴定效價(jià)。一、重組載體的構(gòu)建 (一)實(shí)驗(yàn)材料
1.主要試劑 dNTPs IOmM
Tap DNA聚合酶天根公司
T4 DNA連接酶promaga公司
限制性內(nèi)切酶EcoR IMBI公司KpnI BamHI 瓊脂糖胰蛋白胨酵母提取物 SYPR Green Kit 2.重要試劑配制 (I)TE緩沖液
IM Tirs-HCl Iml (PH8. 0),0. 5M EDTA 0.2ml (PH8. 0)，ddH20 定容至 100ml。(2) 2. 5M CaCl2
稱取無水CaCl2 55. 5g，ddH20定容至200ml，高壓滅菌，4°C保存。(3 )制備固體含氨芐青霉素(Amp )的LB平板培養(yǎng)基
IOg胰蛋白胨；5g酵母提取物；IOg NaCl ； 12g瓊脂或瓊脂糖；加蒸餾水定容至 1000ml，使其充分溶解，1 mol/L NaOH調(diào)PH至7. 0，高壓滅菌25min，常溫保存?zhèn)溆?。制備LB固體平板時(shí)，取無抗菌素固體LB，在微波爐內(nèi)加熱融化，自然冷卻至約 50°C時(shí)，加入Amp IOml (1 200)，混均后倒入無菌平皿中，每個(gè)平板導(dǎo)入32_40ml，常溫凝固，4°C保存。(4)堿裂解法提取質(zhì)粒所需液體
溶液 I: IM Tris-HCl 12. 5ml, 0. 5M EDTA (PH 8.0) 10ml，葡萄糖 4. 730g，加 ddH20 至500ml。115°C高壓滅菌15min后，4°C保存。溶液II 10% SDS 10ml, IOM NaOH 2ml，加 ddH20 至 100ml。使用時(shí)臨時(shí)配制。溶液III :5M 醋酸鉀 300ml，冰醋酸 57. 5ml，ddH20 定容至 500ml。4°C保存。(5) 0· 25%胰酶
稱取胰酶2. 5g，D-Hank’ s液定容至1000ml，振蕩溶解，濾菌后_20°C保存。3.質(zhì)粒和菌株
F BDNF質(zhì)粒，pGEM-T Easy質(zhì)粒(50 μ g/μ l，promaga公司)，pSSCMV_HA2TAT質(zhì)粒，PUC19 質(zhì)粒，pAAV/Ad質(zhì)粒，pFG140質(zhì)粒，大腸桿菌iTop 10，HEK293細(xì)胞。4.實(shí)驗(yàn)儀器
PCR儀，低壓電泳儀，水平電泳槽，紫外線透射儀，數(shù)碼相機(jī)，高壓滅菌鍋，電熱恒溫水浴箱，搖床，低溫高速離心機(jī)，水平式離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，顯微鏡 (二)實(shí)驗(yàn)方法 1.目的基因BDNF的克隆 (1)設(shè)計(jì)合成引物
以F BDNF質(zhì)粒為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增獲得刪除了終止序列的BDNF片段，目的基因BDNF的cDNA核苷酸序列見SEQ ID NO. 1。在其上游和下游分別加入限制性內(nèi)切酶EcoRI 和KpnI位點(diǎn)。所需引物如下
上游引物 F (50pmol/y 1) :5，-CG GAA TTC ATG ACC ATC CTT TTC CTT AC-3，(SEQ ID NO. 2)；
下游引物 R (50pmol/y 1) :5，-C GGT ACC TCT TCC CCT TTT AAT GGT C_3，(SEQ ID
MBI公司 MBI公司
6NO. 3)。 (2 ) BDNF基因的擴(kuò)增
1)建立PCR反應(yīng)體系(0.5ml離心管)
10XPCR buffer dNTPmix
10 μ 1 2μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 6 μ 1 100 μ 1
上游引物F 下游引物R 模版
Taq DNA聚合酶
MgCl2 (25mM) 加ddH20至
011石蠟油50 μ 1覆蓋表面；
2)PCR反應(yīng) 940C 5min,
94°C lmin，48°C lmin，72°C 90s，共 30 個(gè)循環(huán)， 72 0C 5min ；
3)制備瓊脂糖凝膠，待PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μ 1反應(yīng)產(chǎn)物加樣、電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠；
4)收集從電泳凝膠下切下的含DNA片段的瓊脂糖凝膠至1.5ml離心管內(nèi)，稱重確定體積(每IOOmg瓊脂糖凝膠相當(dāng)于100 μ 1體積)；
5)加入等體積的酚/氯仿抽提，輕輕混勻，離心12000r/minX5min，取上清；
6)加入1/10體積的3M醋酸鈉，2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻；
7)-20°C放置30min，4°C離心 12000r/minX lOmin，棄上清；
8)70%乙醇洗離心物沉淀一次，離心12000r/minX5min，棄上清；
9)37°C干燥后，加50μ1 TE溶解沉淀，定量，4°C備用。(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接建立連接反應(yīng)體系(0. 5ml離心管)
pGEM-T Easy 質(zhì)粒1 μ 1
PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 0. 1 μ g/ μ 12 μ 1
T4DNA連接酶1 μ 1
10 X T4DNA連接酶緩沖液2. 5 μ 1
力口 ddH20 至25 μ 1
混勻，23 °C過夜。(4)受體菌制備
1)取一單菌落ToplO菌種于5mlLB培養(yǎng)液的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)4h;
2)取1.5ml入離心管中，離心lOOOOr/minXlOmin，棄上清；
3)沉淀用冰冷的IOOmMCaCl2洗一次，離心12000r/minX lOmin，棄上清；
4)再用冰冷的IOOmMCaCl2將細(xì)菌懸起，4°C備用。(5) pGEM-T Easy/BDNF 轉(zhuǎn)化 iTop 10 菌1)取連接產(chǎn)物pGEM-TEasy/BDNF 10 μ 1加入含100 μ 1 ToplO菌的離心管中，混勻；
2)冰上放置30min，42°C熱休克90s，冰上放置2min；
3)加入0.4ml LB培養(yǎng)液，37°C水浴2h ；
4)將LB(含1. 2%瓊脂)用微波爐融化后，自然放冷致50°C左右，加入Amp，倒入無菌培養(yǎng)皿中，4°C備用；
5)水浴池后的轉(zhuǎn)化菌離心8000r/minX10min，將上清棄到僅余100μ 1，全部涂于上一步制備的LB培養(yǎng)皿中；
6)平皿在室溫下正向放置15min后，37°C倒置過夜；
7)第二天可見平皿中有百個(gè)菌落生成，挑取其中6個(gè)菌落種于5ml含Amp的LB中，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜。(6)小量提取重組質(zhì)粒DNA——堿裂解法
1)每個(gè)樣本取1.5ml菌液，離心12000r/minX5min，將液體倒盡；
2)將細(xì)菌重懸于預(yù)冷的100μ 1溶液I，劇烈震蕩；
3)加入200μ 1新鮮配制的溶液II懸浮，顛倒混勻；
4)加入150μ 1預(yù)冷的溶液III，顛倒混勻；
5)加入450μ1酚/氯仿抽提一次，離心12000r/minX10min ；
6)將上清移入新離心管中，用2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀，4°C離心120001·/ minX IOmin,棄上清；
7)沉淀用Iml70%乙醇洗一次，離心12000r/minX5min，棄上清；
8)37°C干燥30min后，用含RNase的TE 50 μ 1溶解沉淀，4°C備用。(7)提取的重組質(zhì)粒DNA酶切鑒定
1)建立酶切體系
質(zhì)粒6個(gè)(OJyg/個(gè))
EcoRI1 μ 1
Buffer6 μ 1
力口 ddH20 至60 μ 1
先將ddH20，Buffer, EcoRI混勻后分裝6管，再加入樣本。37°C溫浴Ih ；
2)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠。(8)大量提取重組質(zhì)粒DNA——堿裂解法
1)大搖酶切鑒定陽性的細(xì)菌，4°C離心5000r/minX10min，棄上清；
2)用預(yù)冷的STE洗一次細(xì)菌，4°C離心5000r/minXlOmin，棄上清；
3)將細(xì)菌沉淀物重懸于3ml溶液I中；
4)加溶液新鮮配制的II6ml;
5)加預(yù)冷的溶液III4. 5ml，搖勻，4°C離心5000r/minX10min，上清移入新管內(nèi)；
6)用等體積的異丙醇沉淀，離心7000r/minXlOmin，棄上清；
7)37°C干燥 30min 后，用 anl TE 和 20 μ 1 RNase 溶解，37°C溫浴 2h ；
8)等體積的酚/氯仿抽提后，無水乙醇沉淀，-20°C過夜；
9)離心12000r/minX10min，沉淀干燥后，用750μ 1 TE溶解；
10)加入750 μ 1 14% 的 PEG8000,1. 6Μ NaCl 沉淀 DNA,離心 12000r/minX lOmin,棄除液相RNA，干燥后，用400 μ 1 TE溶解；
11)重復(fù)一次步驟8；
12)沉淀用70%乙醇洗一次，離心12000r/minX10min，棄上清，干燥后，用200μ1 TE 溶解，-20°C備用。2. 融合基因BDNF-HA2TAT的克隆 (ι)制備 bdnf 和 psscmv-ha2tat 載體
此處應(yīng)用EcoRI和KpnI酶切，因?yàn)镵pnI的緩沖液是無鹽的Buffer，所以要分兩次消化，先消化KpnI，再補(bǔ)齊NaCl后消化EcoRI。第一步消化KpnI:
1)T-BDNF 大提質(zhì)粒 lyg/μ 5μ g (5μ 1) KpnI1 μ 1
KpnI緩沖液2 μ 1
加 ddH20 至20 μ 1
充分混勻，37 °C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2) psscmv-ha2tat ι μ g/ μ ι2 μ ι
KpnI0· 5 μ 1
KpnI緩沖液2 μ 1
力口 ddH20 至20 μ 1
充分混勻，37 °C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。第二步消化EcoRI
1) T-BDNF/ KpnI19 μ 1
EcoRI4μ 1
EcoRI緩沖液5 μ 1
加 ddH20 至50 μ 1
充分混勻，37°C 2h。制備1%瓊脂糖凝膠，電泳，膠回收片段，-20°C備用。2) pSSCMV_HA2TAT/ KpnI19 μ 1 EcoRI0. 5μ 1 EcoRI緩沖液3 μ 1 加 ddH20 至30 μ 1
充分混勻，37°C 2h。制備1%瓊脂糖凝膠，電泳，膠回收片段，-20°C備用。
(2)目的基因片段與PSSCMV-HA2TAT載體連接建立連接反應(yīng)體系
T-BDNF
psscmv-ha2tat ο.
0. 1 μ g/ μ 0. 05μ g/μ 1
1 μ 1 1 μ 1
IOXbuffer t4dna連接酶加ddH20至
2. 5μ 1
1 μ 1 25 μ 1
充分混勻，23 °C過夜。 (3) pSSCMV-BDNF-HA2TAT 轉(zhuǎn)化 iTop 10 菌方法同步驟1中(5) pGEM-T Easy/BDNF轉(zhuǎn)化iTop 10菌。(4)小提重組質(zhì)粒以及酶切鑒定
方法同步驟1中(6) pGEM-T Easy/BDNF重組質(zhì)粒的小提以及(7)酶切鑒定。酶切鑒定時(shí)用EcoRI和BamHI
37°C溫浴lh。1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠。(5)大提質(zhì)粒
方法同步驟1中(8) pGEM-T Easy/BDNF重組質(zhì)粒的大提。定量，_20°C備用。(6)制備BDNF-HA2TAT片段并連接到PUC19質(zhì)粒中測(cè)序 1) BDNF-HA2TAT片段和PUC19載體的制備 Psscmv-BDNF-HA2TAT5 μ 1
EcoRI0. 5μ 1
BamHI0. 5 μ 1
2 XbufferT10 μ 1
加 ddH20 至50 μ 1
充分混勻，37°C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收片段。PUC192 μ 1 EcoRI 0. 75μ 1 BamHI 0. 75 μ 1 2 XbufferT 10 μ 1 加 ddH20 至 50 μ 1
充分混勻，37°C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收片段。定量。2) BDNF-HA2TAT 片段連接到 PUC19 質(zhì)粒 BDNf-HA2TAT1 μ 1 PUC19 1 μ 1 T4DNA連接酶 1 μ 1 IOXbuffer 2. 5 μ 1
加 ddH20 至25 μ 1
充分混勻，23 °C過夜。(7)基因重組產(chǎn)物的篩選、鑒定
1)應(yīng)用步驟1(4)中的CaCl2法制備ToplO感受菌；
2)應(yīng)用步驟1(5)中pGEM-T Easy/BDNF轉(zhuǎn)化"ΓορΙΟ菌的方法轉(zhuǎn)化細(xì)菌；
3)應(yīng)用步驟1(6)中的方法小提重組質(zhì)粒；
4)應(yīng)用步驟1(7)中的方法對(duì)小提重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；
psscmv-bdnf-ha2tat
EcoRI BamHI
IOXbufferI 加ddH20至
4個(gè) 0. 2μ 1 0. 2μ 1
4μ 1 40 μ 1PUC19- BDNF-HA2TAT
EcoRI
BamHI
2 XbufferT 加ddH20至
5 μ 1 0. 3μ 1 0. 3μ 1 10 μ 1 50 μ 1
37°C溫浴lh。1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠； 5)選電泳結(jié)果正確者進(jìn)行測(cè)序。二、病毒包裝 1.病毒包裝 (1)轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備
1)復(fù)蘇HEK293細(xì)胞取出凍存的HEK293細(xì)胞，37°C溫浴約Imin融化。吸出細(xì)胞懸液， 離心1200rpmX5min，留取細(xì)胞沉淀。用19%胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴(kuò)增細(xì)胞至直徑15cm的平皿中，待細(xì)胞70-80%成片時(shí)開始轉(zhuǎn)染。2)準(zhǔn)備輔助質(zhì)粒
pAAV/Ad 質(zhì)粒(lyg/μ 1) 375μ 1 ；
pAAV/Ad 質(zhì)粒輔助子(PTO140) (1μ g/μ 1) 375μ 1 ； pSSCMV-BDNF-HA2TAT(1 μ g/ μ 1) 375 μ 1。3)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑
陽離子轉(zhuǎn)染試劑PEL 9ml (8 μ 1/ μ g DNA)； 質(zhì)粒稀釋液45ml ； 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液36ml。(2)轉(zhuǎn)染和收獲重組腺相關(guān)病毒AAV/BDNF_HA2TAT
1)將質(zhì)粒3種依次加入45ml質(zhì)粒稀釋液中；
2)將轉(zhuǎn)染試劑9ml加入36ml轉(zhuǎn)染試劑稀釋液中；
3)將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑加入質(zhì)粒稀釋液中，室溫IOmin；
4)每個(gè)平皿的293細(xì)胞中加入3ml質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合液；
5)72h后取細(xì)胞，將細(xì)胞懸存于30ml HEPES buffer中，凍容3次；
6)超聲粉碎細(xì)胞，離心10000r/minX20min，留上清，加等體積上的飽和(NH4)2SO4沉
淀；
7)4°C過夜，離心12000r/minX20min，取沉淀，容在含Ca、Mg的PBS中，透析三天；
8)離心，除殘?jiān)?，過膜除菌，加保護(hù)液分裝，_20°C保存。2.病毒定量——熒光定量PCR
1)取病毒液0. Iml JnADNasel 100μ 1，37°C溫浴 Ih ；
2)加等體積的蛋白酶K 消化液(20mM Tris HCl PH8. 0, 20mMEDTA, 0. 1%SDS)，37°C溫浴
Ih ；
3)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，純化核酸備用；
4)建立PCR反應(yīng)體系
2XSYPR Green Mix10 μ 1
F引物1μ 1R引物模板
加ddH20至
1 μ 1 1 μ 1 20 μ 1
PCR 反應(yīng)引物為上游引物 F :5，-AAGTCCCGTTGTTGATTTTGGTG-3，(SEQ ID NO. 4);下游引物 R :5，-CAAGTACGCCCCCTATTGAC-3，(SEQ ID NO. 5)。5) pcr 反應(yīng)預(yù)變性940C 3min ；
變性94°C lmin，退火lmin，延伸68°C lmin，共40個(gè)循環(huán)； 再延伸68 0C 5min。3.免疫組織化學(xué)證實(shí)BDNF的表達(dá)
DHela細(xì)胞復(fù)蘇后用5%的牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基；
2)用6孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)1X 105/ml ；
3)過夜后，換成無血清培養(yǎng)液，加病毒液0.ImlJh后換成完全培養(yǎng)基，72 h后固定做免疫組化。三、結(jié)果
1.BDNF-HA2TAT融合基因的構(gòu)建和鑒定 (1)目的基因BDNF的克隆
采用PCR的方法，以F BDNF質(zhì)粒為模版，克隆出兩端分別帶有EcoRI和KpnI限制性內(nèi)切酶序列；PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體相連，應(yīng)用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒，陽性質(zhì)?？梢?60bp的目的片段(見圖1和圖2)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT
重組質(zhì)粒pgem-t Easy/BDNF和psscmv_ha2tat載體分別應(yīng)用EcoRI和KpnI酶切后， 將目的基因片段與psscmv-ha2tat載體連接，重組質(zhì)粒psscmv/bdnf-ha2tat經(jīng)EcoRi和 BamHI酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見的目的片段(見圖3和圖4)，證實(shí)融合基因成功插入載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。(3 )融合基因 BDNF-HA2TAT 測(cè)序
重組質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT經(jīng)EcoRl和BamHI酶切制備BDNf-HA2TAT片段并連接到PUC19質(zhì)粒中測(cè)序。采用Sanger單鏈末端終止法測(cè)出全部的核苷酸序列，應(yīng)用DNASIS 軟件分析比較該序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致(見圖5)
2.重組腺相關(guān)病毒的包裝和滴定
包裝分泌表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒
用3質(zhì)粒(pAAV/Ad質(zhì)粒、pAAV/Ad質(zhì)粒輔助子、pSSCMV -BDNF-HA2TAT)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)7 后，收獲病毒上清。應(yīng)用熒光定量PCR 測(cè)定病毒滴度為8. 32X 109/ml，應(yīng)用免疫組織化學(xué)證實(shí)BDNF的表達(dá)(見圖6)。實(shí)施例2表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的重組腺相關(guān)病毒經(jīng)鼻腦通路進(jìn)入大腦產(chǎn)生抗抑郁樣作用 C57 BL/6雌性和雄性成年小鼠各分為經(jīng)鼻滴入生理鹽水和BDNF-HA2TAT/AAV兩處理組， 兩處理又各分為Id給藥組，連續(xù)5天給藥組和連續(xù)10天給藥組；Id給藥組分別在給藥后 1，2，3天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試(強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST)和曠場(chǎng)探究實(shí)驗(yàn)(open-field exploration test, 0PF)，連續(xù)5天給藥組和連續(xù)10天給藥組分別在給藥后 1,3,7天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試(FST和OPF)。C57 BL/6 小鼠經(jīng)鼻給予 BDNF_HA2TAT/AAV :BDNF-HA2TAT/AAV 連續(xù)經(jīng)鼻給藥 5d 和 10d，各組小鼠分別在ld，3d，7d進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試早上為0PF，晚上為FST。(1) BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給5d，各組小鼠分別在ld，3d，7d后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試雌性和雄性C57 BL/6小鼠Id后測(cè)試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV會(huì)顯著減少FST 6min的不動(dòng)時(shí)間，同時(shí)均不會(huì)影響OPF的Ih總的活動(dòng)距離(見圖7和圖8)。(2)BDNF_HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給10d，各組小鼠分別在ld，3d，7d后行為學(xué)測(cè)試 雌性和雄性C57 BL/6小鼠Id后測(cè)試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV會(huì)顯著減少FST 6min 的不動(dòng)時(shí)間，同時(shí)均不會(huì)影響OPF的Ih總的活動(dòng)距離；雌性C57 BL/6小鼠7d后測(cè)試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV會(huì)顯著減少FST 6min的不動(dòng)時(shí)間，同時(shí)均不會(huì)影響OPF的Ih總的活動(dòng)距離，但是雄性C57 BL/6小鼠7d后測(cè)試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV在顯著減少 FST 6min的不動(dòng)時(shí)間的同時(shí)會(huì)增加OPF Ih總的活動(dòng)距離(見圖9和圖10)。結(jié)論分泌表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒可感染鼻粘膜細(xì)胞，經(jīng)鼻給藥達(dá)到一定劑量時(shí)在正常C57BL/6小鼠產(chǎn)生抗抑郁樣作用，其中雌鼠對(duì)這種給藥方式更敏感，效果也更持久。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒是由下列方法構(gòu)建得到的a、克隆BDNFcDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T fesy載體，獲得的pGEM_T Easy/BDNF轉(zhuǎn)化受體菌五Coli DH5 α，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA ；b、酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帶穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒 pSSCMV-HA2TAT，構(gòu)建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ；C、在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒PSSCMV-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒 PTO140三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒上清，即表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的BDNFcDNA具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的步驟a中BDNF基因擴(kuò)增的上游引物和下游引物分別具有SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒在制備治療抑郁癥疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒即可以分泌表達(dá)大分子蛋白BDNF，表達(dá)的BDNF又有穿過血腦屏障作用，同時(shí)將BDNF基因序列導(dǎo)入AAV載體，可以持續(xù)分泌表達(dá)BDNF，解決了BDNF需反復(fù)給藥的難題；通過抗抑郁效力篩選實(shí)驗(yàn)證明了可分泌表達(dá)BDNF-HA2TAT的重組腺相關(guān)病毒具有抗抑郁的作用，建立了一種有效預(yù)防和治療抑郁障礙和應(yīng)激障礙等精神疾病的手段和方法。
文檔編號(hào)A61P25/24GK102366631SQ201110332238
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者亢萬虎, 伏煒, 黨永輝, 李雅妹, 楊廣笑, 王崴, 馬明芳, 馬現(xiàn)倉, 高成閣 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院