專利名稱：亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法制備的病毒疫苗的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，具體涉及亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法制備的病毒疫苗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒感染引發(fā)的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等一直是危害人類健康的重要?dú)⑹?，每年用于治療的費(fèi)用高達(dá)萬億元。但由于病毒的嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生特性及病毒復(fù)制時(shí)依賴于宿主細(xì)胞的許多功能，使得具有能抑制病毒復(fù)制而不影響細(xì)胞功能的安全、特異、有效的抗病毒藥物非常缺乏。已有研究表明特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答在清除病毒感染中發(fā)揮重要作用。因此特異性細(xì)胞免疫成為治療病毒感染的一種重要策略。治療性疫苗通過將病原體的抗原成分或相應(yīng)組分接種機(jī)體，從而激發(fā)、增強(qiáng)和調(diào)控機(jī)體抗病原的特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而達(dá)到治療的目的。開發(fā)治療性疫苗的研究將具有重大的理論意義及潛在巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益，已經(jīng)受到世界范圍的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有技術(shù)的改造抗原、組建新的免疫原、改變抗原呈遞及加工過程，誘導(dǎo)生機(jī)體有效的免疫應(yīng)答的治療性疫苗的研究，在抗病毒治療中備受推崇。但疫苗從生產(chǎn)開始就已經(jīng)有了固定的抗原表位， 病毒持續(xù)性感染機(jī)制之一是出現(xiàn)編碼其中和性抗原決定簇的基因變異株，由于變異株能夠逃逸原有病毒已誘導(dǎo)的體液或細(xì)胞免疫，因此病毒的變異株不能被清除，從而使病毒持續(xù)存在，導(dǎo)致疾病的無法根治。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法制備的病毒疫苗在制備誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)并刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的制劑中的應(yīng)用。較優(yōu)的，所述細(xì)胞因子為腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素(IFN-γ)，本發(fā)明的病毒疫苗能刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，提高患者體內(nèi)TNF-α和IFN-Y的含量。較優(yōu)的，所述病毒疫苗是采用亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法滅活含病毒的血漿后獲得的。更優(yōu)的，所述含病毒的血漿來源于患者。較優(yōu)的，所述病毒選自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒1型、人類免疫缺陷病毒2型、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒或T淋巴細(xì)胞白血病病毒等多種RNA和DNA病較優(yōu)的，本發(fā)明的病毒疫苗的使用方法選自以下任一方法一應(yīng)用血漿單采儀，分離血漿并對血漿進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活處理，將處理后的血漿回輸給患者，為一次療程。更優(yōu)的，該方法一個(gè)過程可針對全部血液循環(huán)中的血漿進(jìn)行滅活，處理血漿中的亞甲藍(lán)可以濾除也可以不濾除?？梢愿鶕?jù)實(shí)際需要，在不同時(shí)間點(diǎn)再次進(jìn)行滅活，以鞏固、加強(qiáng)治療效果。方法二 1)首次分離血漿200 400ml，并進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活處理，滅活處理結(jié)束后濾除亞甲藍(lán)，冷凍保存；2)1 4周后再次分離血漿，所分離的血漿量為上次分離血漿量的1 2倍，血漿的處理方法與首次分離的血漿方法相同，同時(shí)將上次病毒滅活處理后保存的血漿進(jìn)行回輸；幻重復(fù)步驟幻，直至置換血漿量為觀00 3200ml，即全部血漿
量，為一次療程。更優(yōu)的，方法二的冷凍保存溫度為-20°C。較優(yōu)的，所述亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法為向5 IOOOml含病毒的血漿或溶液中加入亞甲藍(lán)并調(diào)整終濃度為ι. O lOOymol/L，密封條件下，4 37°C震蕩，30000 35000Lux可見光照射處理30 45min。本發(fā)明的病毒疫苗通過亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法滅活含病毒的血漿，并且含病毒的血漿在進(jìn)行前述亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活前，要加入常用劑量的抗凝劑，防止滅活過程中血液的凝固。本發(fā)明的病毒疫苗的抗原物質(zhì)來源于患者體內(nèi)的病毒，因此本發(fā)明的疫苗具有針對于不同患者的特異性和針對性，這要優(yōu)于由固定抗原、抗體構(gòu)成的疫苗。疫苗由亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活方法制備獲得后，具有抗原性和免疫原性，可有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)與抗病毒作用密切相關(guān)的Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有著良好的抗病毒應(yīng)用前景。亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活技術(shù)，可對多種DNA和RNA病毒都具有滅活作用。因此由亞甲藍(lán)等光化學(xué)滅活方法制備的疫苗可用于乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(HCMV)、人嗜T細(xì)胞病毒(HTLV)等多種病毒性疾病患者的治療。本發(fā)明的有益效果為亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活技術(shù)在很多血站已廣為應(yīng)用，該方法操作簡單、安全、不需要昂貴的藥物，若結(jié)合單采血漿技術(shù)，即能一次實(shí)現(xiàn)全部外周血中的病毒滅活，可產(chǎn)生大量被滅活的病毒，而該項(xiàng)操作可反復(fù)進(jìn)行，不斷加強(qiáng)、鞏固免疫效果，臨床治療實(shí)踐中可針對每個(gè)患者體內(nèi)不同的病毒株，發(fā)揮特異性免疫調(diào)節(jié)作用，有著良好的抗病毒應(yīng)用前景。


圖1乙型肝炎病毒表面抗原含量的變化
圖2對共刺激分子mRNA水平表達(dá)的影響
圖3對細(xì)胞間粘附分子mRNA水平表達(dá)的影響
圖4對淋巴細(xì)胞TNF- α分泌水平的影響
圖5對淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平的影響
圖6對淋巴細(xì)胞IL-2分泌水平的影響
圖7對淋巴細(xì)胞IL-4分泌水平的影響
圖8對淋巴細(xì)胞IL-10分泌水平的影響
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1病毒疫苗的制備(1)向含有乙型肝炎病毒的血漿IOOOml中加入亞甲藍(lán)并調(diào)整終濃度為50μπιΟ1/L，密封條件下，4°C震蕩，用32000LUX可見光照射處理45min，制備得到病毒疫苗。(2)向含有乙型肝炎病毒的血漿500ml中加入亞甲藍(lán)并調(diào)整終濃度為1. Oymol/ L，密封條件下，37°C震蕩，用30000LUX可見光照射處理30min，制備得到病毒疫苗。(3)向含有乙型肝炎病毒的血漿5m中加入亞甲藍(lán)并調(diào)整終濃度為lOOymol/L，密封條件下，20°C震蕩，用35000LUX可見光照射處理35min，制備成病毒疫苗。(4)向含有丙型肝炎病毒的血漿300ml中，加入亞甲藍(lán)調(diào)整終濃度為60. Oymol/ L，密封條件下，4°C震蕩，用31000LUX可見光照射30min，制備得到病毒疫苗。(5)向含人類免疫缺陷病毒1型的病毒血漿600ml中，加入亞甲藍(lán)調(diào)整終濃度為 40μπκ)1/1，密封條件下37°C震蕩，用35000LUX可見光照射32min，制備成病毒疫苗。實(shí)施例2病毒疫苗的抗原性實(shí)驗(yàn)1.按照實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)(1)方法制備亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理的乙型肝炎病毒疫苗。2.檢測制備的乙型肝炎病毒疫苗的抗原性，實(shí)驗(yàn)方法如下1)制備淋巴細(xì)胞隨機(jī)選取采集后Mi內(nèi)的6份健康獻(xiàn)血者的A⑶全血，制備濃縮白細(xì)胞，應(yīng)用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法參照產(chǎn)品操作手冊，分離淋巴細(xì)胞。用 PBS (含0. 25mM EDTA)洗滌2次，再用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次，棄盡上清后，將細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液(90% RPMI1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清)中，調(diào)整細(xì)胞濃度為IlXlO6個(gè)細(xì)胞/ml。2)抗原性檢測取濃度為11 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的淋巴細(xì)胞2700 μ 1接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。取含HBV的血漿和滅活處理之后的病毒疫苗各300μ 1，分別接種于培養(yǎng)細(xì)胞中；其中，未經(jīng)滅活處理的含HBV的血漿與淋巴細(xì)胞共孵育組設(shè)為陽性對照組，亞甲藍(lán)滅活處理的病毒疫苗與淋巴細(xì)胞共孵育組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)Mh、72h。利用ELISA試劑盒(購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)檢測血漿滅活之前和滅活之后0、對、7池上清中HBsAg。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組的HBsAg含量分別與未處理的原血漿中HBsAg含量的比值，得到乙型肝炎病毒表面抗原的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見說明書附1，結(jié)果顯示無顯著性差異(P > 0. 05)，并且疫苗在孵育24h、7 i進(jìn)行ELISA檢測時(shí)，HBsAg也并沒有隨著孵育時(shí)間的延長而發(fā)生顯著變化(P >0.05)。數(shù)值為重復(fù)三次檢測結(jié)果的平均值，證明疫苗具有良好的抗原性。實(shí)施例3病毒疫苗的抗原遞呈性實(shí)驗(yàn)1.按照實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)(2)方法制備亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理的乙型肝炎病毒疫苗。2.檢測制備的乙型肝炎病毒疫苗抗原的遞呈性，實(shí)驗(yàn)方法如下1)制備淋巴細(xì)胞隨機(jī)選取采集后Mi內(nèi)的6份健康獻(xiàn)血者的A⑶全血，制備濃縮白細(xì)胞，應(yīng)用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法參照產(chǎn)品操作手冊，分離淋巴細(xì)胞。用 PBS (含0. 25mM EDTA)洗滌2次，再用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次，棄盡上清后，將細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液(90% RPMI1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清)中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1. IX IO6個(gè)細(xì)胞/ml。檢測淋巴細(xì)胞活化相關(guān)共刺激分子⑶80、⑶86和細(xì)胞粘附分子ICAM2、ICAM3、 LFA3的mRNA水平的表達(dá)取濃度為1. 1 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的淋巴細(xì)胞2700 μ 1接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。取含HBV的血漿和滅活處理之后的病毒疫苗各300μ 1，分別接種于培養(yǎng)細(xì)胞中， 未經(jīng)滅活處理的HBV與淋巴細(xì)胞共孵育組設(shè)為陽性對照組，亞甲藍(lán)滅活處理的病毒疫苗與淋巴細(xì)胞共孵育組分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，不加任何刺激的淋巴細(xì)胞設(shè)為陰性對照組，GAPDH選自看家基因，作為RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的內(nèi)參，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。200(^，511^11離心收集淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞中加入30(^1111^201，應(yīng)用 RT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平，具體步驟如下1)抽提 RNA離心收集淋巴細(xì)胞，加入300ul Trizol試劑，用漩渦振蕩儀，強(qiáng)烈振蕩混勻15s， 充分混勻，室溫靜置5分鐘后，按下述方法操作A.加入氯仿80ml，強(qiáng)烈振蕩15s，充分混勻，室溫靜置5分鐘。B. 40C, 12000rpm,離心 15min。C.離心結(jié)束后，溶液分層，小心吸取上層水相200ul，加入等體積異丙醇。D.顛倒混勻10次后，室溫10分鐘。E. 40C, 14000rpm,離心 15min。F.棄上清，75%預(yù)冷酒精，400ul洗滌，顛倒1次。G. 40C, 14000rpm,離心 5min。H.棄上清，4°C，14000rpm，離心5min，用吸管小心吸棄剩余少量上清，自然揮發(fā)干
ο2)逆轉(zhuǎn)錄A.去除基因組DNA
權(quán)利要求
1.一種亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法制備的病毒疫苗在制備誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)并刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的制劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子為腫瘤壞死因子和干擾素。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒疫苗是采用亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法滅活含病毒的血漿后獲得的。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述含病毒的血漿來源于患者。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒選自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒1型、人類免疫缺陷病毒2型、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒或T淋巴細(xì)胞白血病病毒。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒疫苗的使用方法選自以下兩種方法任一方法一應(yīng)用血漿單采儀，分離血漿并對血漿進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活處理，將處理后的血漿回輸給患者，為一次療程；方法二 1)首次分離血漿200 400ml，并進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活處理，滅活處理結(jié)束后濾除亞甲藍(lán)，冷凍保存；2) 1 4周后再次分離血漿，所分離的血漿量為上次分離血漿量的1 2倍，血漿的處理方法與首次分離的血漿方法相同，同時(shí)將上次病毒滅活處理后保存的血漿進(jìn)行回輸；幻重復(fù)步驟2、，直至置換血漿量為觀00 3200ml，為一次療程。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，方法一的一次療程針對全部血液循環(huán)中的血漿進(jìn)行滅活。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，方法一中經(jīng)過亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活處理的血漿中的亞甲藍(lán)在回輸給患者前濾除或者不濾除。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，方法二中所述的冷凍保存溫度為-20°C。
10.如權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，所述亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法為向5 IOOOml含病毒的血漿或溶液中加入亞甲藍(lán)并調(diào)整終濃度為1. 0 100μ mol/L，密封條件下，4 37°C震蕩，30000 35000Lux可見光照射處理30 45min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活方法制備的病毒疫苗在制備誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)并刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的制劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的有益效果為該病毒疫苗能有效調(diào)節(jié)在抗病毒中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提高患者體內(nèi)腫瘤壞死因子和干擾素的含量，并且由于制備病毒疫苗的抗原物質(zhì)來源于患者體內(nèi)，因此本發(fā)明的病毒疫苗具有針對于不同患者的特異性和針對性的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于現(xiàn)有的由固定抗原、抗體構(gòu)成的疫苗。
文檔編號A61K39/21GK102397538SQ20111033224
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者劉曉穎, 張敬敬, 邵俊杰, 錢開誠, 黃宇聞 申請人:上海市血液中心