專利名稱：米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于 醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性神經(jīng)退行性疾病的藥物。。
背景技術(shù)：
人類(lèi)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病如腦缺血、癲癇、帕金森氏癥、老年性癡呆等，其主要的病理改變即神經(jīng)細(xì)胞的損傷、丟失、壞死和凋亡。近來(lái)越來(lái)越多的研究證明，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷最終原因是氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)，所謂氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species, R0S)超出體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)氧自由基的清除能力，最終氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致組織損傷。自由基導(dǎo)致的細(xì)胞DNA氧化性損傷引發(fā)細(xì)胞凋亡。由于神經(jīng)系統(tǒng)具有代謝率高以及抗氧化防御機(jī)制相對(duì)缺乏的特點(diǎn)，產(chǎn)生活性氧簇(ROS)多且更容易遭受氧化損傷導(dǎo)致疾病。抗氧化治療主要是應(yīng)用抗氧化劑，目前抗氧化劑包括天然抗氧化劑(維生素E、維生素C、β胡蘿卜素、谷胱甘肽等)和合成抗氧化藥物，如普羅布考等。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗氧化劑能通過(guò)清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，臨床研究已取得一些可喜結(jié)果。但是，一些研究結(jié)果仍然令人困惑，如同一抗氧化劑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效，而臨床試驗(yàn)往往無(wú)效。目前有關(guān)此類(lèi)藥物治療的研究主要集中在兩個(gè)方面一是開(kāi)發(fā)具有多重作用機(jī)制的自由基清除劑； 二是鑒于自由基清除劑與抗炎藥聯(lián)合使用時(shí)效果更好，因此尋找具有自由基清除作用同時(shí)具有抗炎成為一個(gè)熱點(diǎn)。在這一領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)還有待進(jìn)一步提高，研發(fā)新的抗氧化劑及其在臨床上的應(yīng)用將為神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的治療提供更廣闊的前景。具有極其重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。多糖是生物體內(nèi)普遍存在的一類(lèi)大分子物質(zhì)，作為生命物質(zhì)的組成成分之一，廣泛參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，特別在細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能方面新的認(rèn)識(shí)廣泛引起人們的重視。近年來(lái)大量研究證實(shí)，許多多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗凝血、抗炎、抗衰老及抗氧化等重要藥理活性，已引起藥理學(xué)家的極大關(guān)注，所以多糖也逐漸成為當(dāng)今新藥開(kāi)發(fā)的重要方向之一。因?yàn)槎嗵莵?lái)源廣泛，而生物活性顯著，毒副作用小，所以在醫(yī)藥方面具有廣闊的開(kāi)發(fā)和利用前景。有人預(yù)言“21世紀(jì)將是多糖的世紀(jì)”。仙人掌(Opuntia dillenii Haw)作為地球上生命力最強(qiáng)盛的植物之一，已生存了兩萬(wàn)多年。其藥用價(jià)值在幾千年前就被人類(lèi)認(rèn)識(shí)和利用，在我國(guó)作為藥用首載于清代趙學(xué)敏所著的《本草綱目拾遺》。據(jù)該書(shū)記載，仙人掌味淡性寒，行氣活血、清熱解毒、消腫止痛、 健脾止瀉、安神利尿，可內(nèi)服外用治療多種疾病。清代劉善術(shù)著的《草木便方》中記載，仙人掌苦澀性寒，五痔瀉血治不難，小兒白禿麻油擦，蟲(chóng)瘡疥癩洗安然。另有《本草求原》、《陸川本草》、《嶺南采藥錄》、《閩南民間草藥》、《閩東本草》、《湖南藥物志》、《中@國(guó)藥植圖鑒》、《分類(lèi)草藥性》、《貴州民間方藥集》、《廣西中草藥》等也有論述。從資料記載可以看出，仙人掌除用于痢疾、哮喘、胃痛、腸痔瀉血外，還用于腎炎、糖尿病、心悸失眠、動(dòng)脈硬化、高血壓、月巴胖癥及肝病的輔助治療。進(jìn)入21世紀(jì)后，醫(yī)學(xué)界和食品科學(xué)研究部門(mén)又發(fā)現(xiàn)了它具有降血糖、降血脂和抗氧化等功效。隨著近年深入研究，發(fā)現(xiàn)仙人掌可促進(jìn)新陳代謝，提高人體免疫力，除對(duì)糖尿病、高血脂、高血壓等有療效外，特別是抗氧化作用，已作為一種天然抗氧化劑用于食品科學(xué)。米邦塔仙人掌(Opuntia ficus-indica Milpa Alta)，是20世紀(jì)40年代墨西哥專家從植物仙桃(Opuntia ficus-indica)中選育出來(lái)、可作為果蔬食用的少刺的仙人掌品種，1998年我國(guó)農(nóng)業(yè)部從墨西哥引進(jìn)，現(xiàn)已大面積栽培成功，該仙人掌具有耐旱、耐瘠薄、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、病蟲(chóng)害較少、栽培管理容易等特點(diǎn)。米邦塔仙人掌含有18種人體必需氨基酸、多種維生素、微量元素和玉芙蓉、果仙纖維素、角蒂仙、多糖、留醇、黃酮、亞油酸、SOD等降血脂、降血糖、免疫增強(qiáng)、抗衰老及防癌等藥理活性成分。其中仙人掌多糖 (cactuspolysaccharides,CP)為仙人掌所含主要有效成分之一，其含量高，藥理活性強(qiáng)，對(duì)生物體毒副作用小，因此受到醫(yī)藥研究者的高度關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)我國(guó)栽培的米幫塔仙人掌莖進(jìn)行提取，將米邦塔仙人掌莖用水浸醇沉法進(jìn)行多糖的粗提，用乙醇，丙酮，乙醚除雜及除蛋白質(zhì)后，用苯酚一硫酸法檢測(cè)多糖的含量，進(jìn)一步純化得到米幫塔仙人掌多糖，新鮮植物得糖率約7. 3 %。所得米幫塔仙人掌多糖， 主要含半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖以及阿拉伯糖，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致。藥效研究發(fā)現(xiàn) 在整體大鼠局灶性腦缺血及缺血復(fù)灌實(shí)驗(yàn)，米邦塔仙人掌多糖可改善大鼠神經(jīng)行為障礙， 減少腦梗死體積和皮層及海馬神經(jīng)元丟失。在離體培養(yǎng)腦片及培養(yǎng)PC12細(xì)胞以及原代培養(yǎng)大鼠皮層、海馬神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)多種方式氧糖剝奪損傷，米邦塔仙人掌多糖均可減少細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生，具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示米邦塔仙人掌多糖經(jīng)消化道給予可以緩解大鼠局灶性腦缺血，及缺血復(fù)灌后神經(jīng)癥狀，減少腦梗死體積；病理組織切片顯示可顯著減少腦缺血-再灌注皮層及海馬神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)損傷。離體腦片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示米邦塔仙人掌多糖對(duì)物理性氧糖剝奪損傷、過(guò)氧化物H2O2誘導(dǎo)的大鼠海馬及皮層神經(jīng)元損傷，具有明顯的保護(hù)作用。離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(1)離體培養(yǎng)PC12細(xì)胞以過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，米幫塔仙人掌多糖可明顯減少細(xì)胞死亡，并對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用。(2)原代培養(yǎng)大鼠皮層、海馬神經(jīng)元，用化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪損傷；米幫塔仙人掌多糖可保護(hù)細(xì)胞免遭其損傷，明顯減少細(xì)胞死亡。本發(fā)明揭示米幫塔仙人掌多糖無(wú)論對(duì)整體動(dòng)物，還是離體培養(yǎng)腦片或神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)物理和化學(xué)性所致神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷均具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧及自由基的生成，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性，加速活性氧與自由基的清除等作用有關(guān)，米幫塔仙人掌多糖可以作為預(yù)防和治療慢性神經(jīng)退行性疾病如腦缺血_再灌注損傷，老年性癡呆、帕金森氏癥等神經(jīng)退行性變的藥物。本發(fā)明實(shí)施例提供了一種優(yōu)化的米幫塔仙人掌多糖的提取、分離與純化方法。本發(fā)明提供的優(yōu)化的米幫塔仙人掌多糖提取工藝，方便簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)適用，得糖率較高，適合火批量提取。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)資料一、整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)米邦塔仙人掌多糖對(duì)整體大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague & Dawley大鼠，體重200_250g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)Hitachi Koki Co,Ltd. Tokyo JapanDYY-SC型電泳儀(北京市六一儀器廠出產(chǎn))。大鼠腦缺血模型制備采用Zea Longa方法并予改良的大腦中動(dòng)脈線栓法 (middle cerebralartery occlusion, MCA0)制備大鼠持續(xù)性局灶性腦缺血模型。大鼠水合氯醛麻醉(350mg/kg，IP)，依次分離右側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸外動(dòng)脈，在靠近頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處由頸總動(dòng)脈沿頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入預(yù) 先被多聚酪氨酸包被的直徑 0. 26-0. 28mm的尼龍栓線，深度約為1. 8-2. 2cm。假手術(shù)組栓線插入深度為1. Ocm，其余步驟同模型組。動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙即為模型成功。持續(xù)觀察8h。對(duì)于缺血-復(fù)灌所致的短暫性腦缺血(tMCAO)模型，在MCAO 2h后抽出大鼠頸內(nèi)細(xì)線以進(jìn)行復(fù)灌，并持續(xù)觀察22h。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組、生理鹽水組、仙人掌多糖治療組(200mg/kg/d)。 生理鹽水組給與等體積生理鹽水。仙人掌多糖治療組在手術(shù)前每天靜脈注射仙人掌多糖 200mg/kg，連續(xù)3天，術(shù)后15min再給予一次。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分參考Zea Longa的6級(jí)評(píng)分法在術(shù)后3h、6h、8h進(jìn)行評(píng)分0分， 無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向栓塞對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈3分，向?qū)?cè)傾倒4 分，不能自發(fā)行走，昏迷5分，死亡。腦梗死體積測(cè)定所有動(dòng)物在栓塞后8h斷頭取腦。大鼠用10%水合氯醛1. 5mL深度麻醉后處死，迅速取腦，-20°C凍lOmin，從視交叉處取冠狀面均勻切成1-1. 5mm厚腦片， 放入2%TTC溶液(37°C)中染色30min，然后用4%多聚甲醛固定。24h后拍照并輸入計(jì)算機(jī)，采用AUTOCAD圖像處理軟件計(jì)算梗死面積(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū))， 各腦片梗死面積之和乘以厚度(1.5mm)為總的梗死體積，以梗死體積/全腦體積比作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。形態(tài)學(xué)檢測(cè)缺血2h再?gòu)?fù)灌注22h深度麻醉大鼠，透心灌注取腦(冰冷的生理鹽水及4%多聚甲醛)，4%多聚甲醛4°C固定過(guò)夜，脫水后石蠟包埋，選擇前囟后3和4. 5mm處作等距離的冠狀切片，片厚5 μ m，HE染色后于光鏡下觀察。免疫組織化學(xué)分析將如上所述切好的腦片用0. IM PBS清洗，脫蠟，酒精梯度洗脫，室溫于10% H2O2中浸泡IOmin去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS漂洗三遍后，10%正常山羊血清37°C孵育30min，加入一抗兔抗小鼠iNOS單克隆抗體(1 100) 37°C孵育2h ；PBS清洗后加入生物素化羊抗兔IgG(l 100) 二抗37°C孵育lh;PBS清洗后加入SABC 37°C孵育 Ih ；0. 5g/LDAB顯色5-lOmin。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，其余步驟相同。蛋白質(zhì)印跡分析暫時(shí)性腦缺血復(fù)灌注22h后，分別取每組大鼠各4只斷頭取腦，迅速于冰上分離右側(cè)海馬和皮層。將腦組織用0.4ml冰冷勻漿緩沖液(Tris-HCl 50mmol/L, PH7. 4, NaCl 150mmol/L,0.5 % Triton X-100，二胺四乙酸 lmmol/L， phenylmethylsulfony fluoride lmol/L,抑肽酶 5mg/L)，在冰浴下制成勻菜，14，OOOXg 4°C離心30min。收集上清用作總蛋白測(cè)定。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為8%， PH 8. 8，濃縮膠濃度為4%，pH 6.8。每泳道上樣量皮層7 μ 1，海馬10 μ 1。電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜。將NC膜置于含5%牛奶的TBS緩沖液中4°C 過(guò)夜，加入iNOS單克隆兔抗鼠抗體(1 500)。TBS洗膜后，將膜用羊抗兔二抗室溫下孵育 Ih.膠片上電泳蛋白條帶掃描并用軟件(Gel-ProAnalyzer 4.0)定量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11. 5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值用(S)表示，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)(Marm-Whitney)方法做秩禾檢驗(yàn)，其他組間比較采用單因素方差分析 (ONEffAY-ANOVA)和PLSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)， ρ < 0. 05有顯著意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1).米邦塔仙人掌多糖對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦梗死體積的影響 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示，局灶性腦缺血3h后，仙人掌多糖治療組、生理鹽水組及假手術(shù)組動(dòng)物均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，但各組間損傷程度比較未見(jiàn)顯著性差異。缺血6h及8h 后給藥組與生理鹽水組行為學(xué)評(píng)分比較有顯著差異(P < 0. 05)。缺血組及生理鹽水組的損傷程度相當(dāng)，沒(méi)有明顯差異(ρ >0.05)。腦梗死8h后大鼠腦片經(jīng)TTC染色，梗死區(qū)域呈蒼白色，非梗死區(qū)呈紅色。缺血組及米邦塔仙人掌多糖治療組大鼠缺血側(cè)部分皮質(zhì)及紋狀體出現(xiàn)梗死，非缺血側(cè)無(wú)梗死，與MCA支配的腦區(qū)一致，說(shuō)明模型成功。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死灶； 缺血組及生理鹽水組出現(xiàn)大面積的白色梗死區(qū)域，米邦塔仙人掌多糖治療組腦梗死體積較缺血模型組及生理鹽水組明顯減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P < 0. 05)。與神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的結(jié)果一致，見(jiàn)

圖1。(2)米邦塔仙人掌多糖對(duì)大鼠缺血-再灌注損傷皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響大鼠腦缺血_再灌注后，腦組織病理切片HE染色后于光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)。腦缺血模型組大鼠皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞均可見(jiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化神經(jīng)細(xì)胞丟失、核固縮、核深染等。米邦塔仙人掌多糖(200mg/kg)治療組大鼠皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化得到顯著改善，神經(jīng)細(xì)胞丟失減少，核固縮、核深染減輕，表明其對(duì)腦缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用，見(jiàn)圖2。(3).米邦塔仙人掌多糖對(duì)缺血-再灌注損傷大鼠腦組織中iNOS表達(dá)及活性的影響免疫組織化學(xué)染色后光鏡下iNOS在皮層及海馬神經(jīng)元表達(dá)的結(jié)果顯示， 缺血側(cè)腦組織DAB染色后iNOS陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈深棕色，假手術(shù)組中，未見(jiàn)胞漿內(nèi)iNOS明顯表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)完整。與假手術(shù)組相比，缺血模型組陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞明顯增加，米邦塔仙人掌多糖(200mg/kg)治療組胞漿iNOS陽(yáng)性細(xì)胞，與缺血組相比，表達(dá)明顯減少，結(jié)果見(jiàn)圖3。二、離體腦片實(shí)驗(yàn)米邦塔仙人掌多糖對(duì)離體腦片氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)一對(duì)離體腦片氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體重為200 300g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑2，3，5-三苯基氯化四氮唑，同第一部分，人工腦脊液組成(mmol·!/1: NaCl 126，KC13. 5，NaH2PO4 1. 2，MgCl2 1. 3，CaCl2 2. 0，葡萄糖 11，NaHCO3 25，pH 7. 4)， 避光保存；碘化丙啶(propidium iodide, PI)，Sigma公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，乳酸脫氫酶)、一氧化氮合酶(N0S，分型)、一氧化氮(N0)、考馬氏亮藍(lán)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物制品有限公司)，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)儀器腦片切片機(jī)(美國(guó)生產(chǎn))，酶標(biāo)儀TECANA-5082 (奧地利生產(chǎn))。激光共聚焦顯微鏡=Leica, TCS-SP (德國(guó)生產(chǎn))。皮層和海馬腦片的制備成年SD大鼠快速斷頭，迅速將全腦取出，立即浸入冰冷的預(yù)先飽和混合氧氣(95% 02+5% C02)的人工腦脊液中，將小腦和腦干棄去，分離海馬與皮質(zhì)，.分別用切片機(jī)沿縱軸切成400 μ m厚腦片.用人工腦脊液漂洗兩次后放置培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) (瓶?jī)?nèi)盛3ml人工腦脊液，(35士0. 5) °C，持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣，進(jìn)行孵育。腦片損傷模型的建立腦片在35 °C ACSF中孵育30min后，實(shí)施氧糖剝奪 (oxygen-glucose deprivation, 0GD)損傷，用預(yù)先飽和混合氮?dú)?95 % N2 禾口 5 % CO2) 的無(wú)糖腦脊液(以IOmmol ^L-1的蔗糖代替ACSF中的葡萄糖)置換瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，分別持續(xù)通95% N2+5% 02各5、10、15、20、25、30min，再恢復(fù)含氧、含糖孵育條件正常孵育2h (reoxygenation, REO)，孵育結(jié)束后，所有腦片進(jìn)行TTC染色，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處光密度(OD)值。計(jì)算不同時(shí)間氧糖剝奪損傷后的腦組織與對(duì)照組的損傷百分率(％ )，以確定損傷模型所需的最佳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)分為①正?？瞻讓?duì)照組腦片在孵育過(guò)程中不作任何處理②損傷模型組腦片在ACSF中孵育30min后，氧糖剝奪15min，隨后恢復(fù)正常ACSF孵育2h。③米幫塔仙人掌多糖處理組分為3個(gè)濃度組，在損傷前30min分別加入0. 2mg · Γ1 Umg · L—1、 2mg · Γ1米幫塔仙人掌多糖。TTC染色腦 片與2 % TTC (用ACSF稀釋)35 V條件下避光孵育30min，隨后取出， 生理鹽水漂洗，吸去表面水分，稱濕重，以Ig腦片20ml比例加入抽提液(乙醇二甲亞砜=1 1)，避光24h，按皮層腦片200μ 1/孔，海馬腦片100μ 1/孔的量加至96孔板， 酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm處吸光度值(A490)。組織損傷百分率=(1-A490損傷/A490對(duì)照)X100%o激光共聚焦檢測(cè)大鼠腦片細(xì)胞內(nèi)PI熒光強(qiáng)度以二甲基亞砜為溶劑，將PI配制成 lmmol/L濃度，以2 μ 1/ml加入腦片孵育杯中，混勻，將各組孵育后的腦片移至含有2 μ 1/ml PI的人工腦脊液中，35°C下避光負(fù)載30min，持續(xù)通氧，人工腦脊液漂洗3次，隨后進(jìn)行激光共聚焦檢測(cè)，觀察并記錄腦片組織的損傷情況即平均熒光強(qiáng)度。激光共聚焦工作條件為 Power 200mM ；Zoom2，光切厚度10 μ m,中速掃描，激發(fā)波長(zhǎng)490nm，發(fā)射波長(zhǎng)650nm，10倍光學(xué)顯微鏡頭進(jìn)行觀察。因PI可以透過(guò)損傷的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，和DNA結(jié)合后發(fā)出熒光， 熒光愈強(qiáng)，表明損傷愈嚴(yán)重。腦片孵育液生化指標(biāo)檢測(cè)分別收集氧糖剝奪15min及復(fù)氧復(fù)糖2h后的腦片孵育上清液，按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)孵育液中乳酸脫氫酶含量；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各組腦片組織進(jìn)行勻漿，檢測(cè)組織中NO含量和iNOS活性變化。并進(jìn)行組織蛋白含量測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11. 5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值用(S)表示，組間比較采用單因素方差分析(0NEWAY-AN0VA)和PLSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，ρ < 0. 05有顯著意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)米邦塔仙人掌多糖對(duì)氧糖剝奪損傷腦片活性的影響米邦塔仙人掌多糖對(duì)腦片TTC染色的影響將0. 2mg · L-1Umg · Γ1及2mg · Γ1的仙人掌多糖與大鼠皮層和海馬腦片在正常條件共同孵育3h，對(duì)腦片TTC染色無(wú)影響。各組A490值之間差異無(wú)顯著意義。氧糖剝奪損傷后大鼠皮層和海馬腦片TTC染色A490值較正常對(duì)照組顯降低，P < 0. 01 (組織損傷百分率皮層36. 36% ’海馬52. 38% )0損傷前給與不同劑量仙人掌多糖均能明顯逆轉(zhuǎn)腦片TTC染色A490值的降低，與損傷組相比，P<0.05。且其保護(hù)作用與劑量呈正相關(guān)，具有明顯劑量依耐性。結(jié)果見(jiàn)圖4。(2)米邦塔仙人掌多糖對(duì)腦片PI染色的影響大鼠皮層、海馬腦片負(fù)載PI后均能在激光共聚焦下顯示出清晰的熒光圖像，損傷區(qū)壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。結(jié)果表明，氧糖剝奪損傷后，其PI平均熒光強(qiáng)度明顯增加，分別為 323. 89士35. 69和189. 76士20. 06與對(duì)照組相比，P < 0. 01。米邦塔仙人掌多糖lmg/L及 2mg/L處理后能顯著減弱氧糖剝奪損傷后腦片PI熒光強(qiáng)度，表明壞死細(xì)胞減少，進(jìn)一步證明對(duì)腦組織氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)圖5。(3)米邦塔仙人掌多糖對(duì)乳酸脫氫酶釋放的影響氧糖剝奪損傷15min，乳酸脫氫酶的釋放輕度增加，與正常對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P >0.05)。如腦片氧糖剝奪損傷15min再?gòu)?fù)氧復(fù)糖孵育2h后，皮層、海馬腦片孵育液中乳酸脫氫酶量顯著增加，與正常對(duì)照組比較(P < 0.01)，米幫塔仙人掌多糖0. 2mg/L、lmg/L和2mg/L處理后能顯著減弱復(fù)氧復(fù)糖孵育2h后海馬、皮層乳酸脫氫酶的釋放，與損傷模型組比較差異有顯著意義(P <0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖6。(4)米邦塔仙人掌多糖對(duì)腦片NO/iNOS釋放的影響氧糖剝奪傷孵育15min后，皮層、海馬腦片組織中NO含量明顯增加，iNOS活性均顯著增加，與對(duì)照組比較，P <0.01 ；米幫塔仙人掌多糖0. 2mg/L、lmg/L、 2mg/L處理后均能不同程度降低海馬、皮層腦片的NO的含量和減弱iNOS活性，與模型損傷組比較，P < 0. 05，結(jié)果見(jiàn)圖7。

實(shí)驗(yàn)二 米 邦塔仙人掌多糖對(duì)H2O2所致大鼠離體腦片損傷保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體重為200 300g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑2，3，5_ 三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC)，仙人掌多糖，同第二部分；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,乳酸脫氫酶)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutashSOD)、谷胱甘肽(glutathion，谷胱甘肽還原酶)、總抗氧化能力(total antioxidationcapability)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物制品有限公司。其余試劑均為分析純。3.實(shí)驗(yàn)儀器切片機(jī)和酶標(biāo)儀同前；4.皮層和海馬腦片的制備 同前。H2O2致腦片氧化應(yīng)激損傷模型的建立腦片在35°C人工腦脊液中孵育30min后，分別用1，2和4mmol/L H2O2繼續(xù)孵育30min，隨后恢復(fù)正常人工腦脊液孵育2h。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)步驟同損傷組，但孵育液中不含H202。TTC染色，計(jì)算不同濃度H2O2的腦組織損傷百分率，以確定損傷模型所需H2O2的最佳濃度。實(shí)驗(yàn)分組腦片在35°C人工腦脊液中孵育30min，隨機(jī)分為對(duì)照組繼續(xù)正常孵育；模型組用含2mmol/L H2O2人工腦脊液孵育30min，隨后恢復(fù)正常人工腦脊液孵育2h ； 米幫塔仙人掌多糖處理組在損傷前30min，分別用0. 333和1. 67mg/L米幫塔仙人掌多糖預(yù)孵育，用含2mmol/L H2O2人工腦脊液孵育30min，恢復(fù)正常孵育2h后，將腦片進(jìn)行TTC染色。7.TTC染色同前。8.腦片孵育液生化指標(biāo)檢測(cè)孵育結(jié)束，取出培養(yǎng)腦片，濾紙吸干表面水分后稱取濕重。將收集的人工腦脊液分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行乳酸脫氫酶、SOD活性，谷胱甘肽還原酶含量和總抗氧化能力檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果除以相應(yīng)培養(yǎng)腦片組織濕重，以每克組織的檢測(cè)量為單位。亞硝酸法測(cè)定SOD活性，SOD活性表示為試劑盒對(duì)照管與樣品管間亞硝酸鹽量的差值(Δ)。亞硝酸鹽量根據(jù)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y = a+bX)計(jì)算得出，Y代表吸光度值，X代表亞硝酸鹽濃度。9.統(tǒng)計(jì)采用SPSSl 1.5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值用 (x± s)表示，組間比較采用單因素方差分析(0NEWAY-AN0VA)和PLSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，p<0. 05有顯著意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.米邦塔仙人掌多糖對(duì)H2O2損傷腦片活性的影響用含1，2和 4mmol · L4H2O2的人工腦脊液孵育腦片30min均可降低大腦皮層和海馬腦片TTC染色A49tlnm 值，表明H2O2對(duì)大鼠腦片可造成不同程度損傷(見(jiàn)圖1)。其中2mmol/L H2O2損傷強(qiáng)度適中， 組織損傷百分率皮層(42士3)%，海馬(53士3)%，可以確定為本實(shí)驗(yàn)比較理想的造模濃度。損傷前或損傷同時(shí)給予米幫塔仙人掌多糖能逆轉(zhuǎn)腦片A49tlnm值降低，表明其對(duì)H2O2所致腦片損傷具有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間給藥所表現(xiàn)的效應(yīng)不同，損傷前給藥的腦組織保護(hù)作用優(yōu)于損傷同時(shí)給藥，如在損傷30min后給予則無(wú)明顯保護(hù)作用(P>0. 05)。 另外，其保護(hù)作用還與濃度相關(guān)，1. 67mg .L-1的保護(hù)作用強(qiáng)于0. 333mg ·Ι^(Ρ < 0. 01)。結(jié)果見(jiàn)表1.
表1米幫塔仙人掌多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠皮層及海馬腦片損傷的保護(hù)作用
權(quán)利要求
1. 一種制備米幫塔仙人掌多糖的方法，包括以下步驟a .米幫塔仙人掌粗多糖的制備將新鮮購(gòu)置的米邦塔仙人掌莖清水洗凈去皮后切成碎片，干燥，取干燥米邦塔仙人掌莖碎片投入雙蒸水中，米邦塔仙人掌莖碎片與雙蒸水的重量/體積比為0. 1 :1，于95°C攪拌3h過(guò)濾，去濾液，在殘?jiān)性俅渭尤?倍的雙蒸水95°C 攪拌2h，再次去濾液，將2次提取的濾液充分?jǐn)嚢韬蟪闉V，然后將抽濾后的濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的10%，再加入適量的氯仿萃取4-5次，然后將上層液體移至另一容器中，按體積比1 :4加入無(wú)水乙醇至終濃度為80%，4°C過(guò)夜，常溫抽濾，留沉淀物，依次用無(wú)水乙醇，丙酮，乙醚分別將沉淀清洗3次，去雜質(zhì)后進(jìn)行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末；b .米邦塔仙人掌粗糖分離純化用纖維素DEAE-52分離柱進(jìn)行分離純化首先用如下方法將上柱預(yù)處理(1)將干粉的纖維素浸泡在蒸餾水中，約3小時(shí)左右，去除雜質(zhì)，抽干；(2)用0. 5mol/L的HCl溶液浸泡2小時(shí)，用去離子水洗凈至PH中性，并抽干；(3)將抽干的纖維素再浸泡在0. 5mol/L的NaOH溶液中2小時(shí)，用去離子水洗至中性，抽干，將粗糖粉末與45°C雙蒸水按重量與體積之比為1 :4的比例溶解，將此溶解液分別用雙蒸水及0. 5M的NaOH溶液緩沖液，用上述處理后的分離柱進(jìn)行洗脫，流速3ml/5min，然后將洗脫液用苯酚-硫酸法檢測(cè)糖的出現(xiàn)，最后收集含糖洗脫液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，轉(zhuǎn)速為 50-80/3min，溫度60°C，蒸發(fā)至稠狀液體，進(jìn)行真空干燥得純化米邦塔仙人掌多糖粉末。
全文摘要
本發(fā)明揭示了米邦塔仙人掌多糖可改善大鼠神經(jīng)行為障礙，減少腦梗死體積和皮層及海馬神經(jīng)元丟失，可減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用，可作為預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性神經(jīng)退行性疾病的藥物，用于預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性神經(jīng)退行性疾病。本發(fā)明還提供了優(yōu)化的米幫塔仙人掌多糖提取工藝，該提取工藝具有方便簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)適用，得糖率較高和適合大批量提取等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102432690SQ20111033497
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者呂青, 徐旭林, 湛進(jìn)進(jìn), 趙博, 郭蓮軍, 陳建國(guó), 陳揚(yáng), 黃先菊 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)