專利名稱：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌Apx I C基因缺失突變株、構(gòu)建方法、疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌Apx I C基因缺失突變株、構(gòu)建方法、疫苗及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的一種豬的高度傳染性和致死性呼吸道疾病。廣泛存在于全世界所有的養(yǎng)豬國(guó)家，尤以歐美各國(guó)流行嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重地阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。由于胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，且各個(gè)國(guó)家及地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型各不相同，給該病的防制帶來(lái)了極大的困難。目前該病在我國(guó)發(fā)病率仍逐年增長(zhǎng)，有的豬場(chǎng)陽(yáng)性率已達(dá)到70%以上，已經(jīng)成為集約化豬場(chǎng)的主要傳染病之一，嚴(yán)重危害到我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)。胸膜肺炎放線桿菌于1957年由Pattison等首次報(bào)道，最早分離于1961年，隨后在1963年和1964年相繼報(bào)道了該病原菌的分離，1990年我國(guó)的楊旭夫首次正式確認(rèn)了國(guó)內(nèi)大型集約化養(yǎng)豬場(chǎng)存在PCP，同時(shí)分離出致病菌株并確定了血清型。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌屬于巴氏桿菌科，放線桿菌屬，為革蘭氏陰性多形態(tài)小球桿菌，兼性厭氧，有莢膜和菌毛，不形成芽抱，能產(chǎn)生4種RTX毒素。新鮮病料中的APP呈兩極染色。多數(shù)菌株在綿羊鮮血平板上呈β溶血，它在金黃色葡萄球菌劃線兩側(cè)，產(chǎn)生一種寬的加重溶血區(qū)(cAMP)和“衛(wèi)星”現(xiàn)象。本菌需要的營(yíng)養(yǎng)條件必須豐富，否則即使加入NAD也生長(zhǎng)不出典型菌落。但經(jīng)多次傳代后在LB培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)。在巧克力瓊脂上培養(yǎng)24 48小時(shí)，可形成直徑I 2mm，光滑、濕潤(rùn)、用鉬耳觸之有粘性感的不透明淡灰色菌落。APP專性寄生于豬的呼吸道，但也有從羔羊體內(nèi)分離到的報(bào)道。APP是一種多毒力因子病原，如動(dòng)物機(jī)體的免疫狀況、病原的數(shù)量、病原的毒力因子及外界環(huán)境的影響等，其中病原的毒力因子在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著舉足輕重的作用。多年來(lái)，毒力因子與致病力之間的關(guān)系亦是國(guó)內(nèi)外學(xué)者最為關(guān)注的問(wèn)題，Bosse等(2002)詳細(xì)地闡述APP感染的病理學(xué)及致病機(jī)理。APP的毒力因子主要包括溶血外毒素、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、蛋白酶、脲酶等，其中溶血外毒素是引起豬發(fā)病最重要的毒力因子。溶血外毒素也稱為Apx毒素。APP產(chǎn)生的溶血外毒素(Apx)被認(rèn)為是APP最重要的一個(gè)毒力因子。Devenish等(1990)研究發(fā)現(xiàn)Apx也是一種重要的免疫原，Apx刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平和保護(hù)力呈正相關(guān)。全部15個(gè)APP血清型中共分泌4種Apx毒素，分別為Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV,四者都屬于細(xì)胞孔形成毒素。前3種Apx毒素既是APP致病的主要毒力因子，又是APP主要的保護(hù)性抗原。Jansen R等(1995)發(fā)現(xiàn)不分泌或缺失Apx的APP菌株對(duì)小鼠和豬均不致病，缺失株補(bǔ)充了 Apx的結(jié)構(gòu)基因和分泌基因后可恢復(fù)原來(lái)的毒力，而且氣管灌注可以直接引起動(dòng)物的臨診癥狀和肺部病變。感染耐過(guò)豬可以抵抗其他血清型的再次感染，許多能產(chǎn)生毒素的弱毒活苗都具有交叉保護(hù)力，均是由于Apx毒素能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗毒素的抗體。Apx I 由 Apx I 操縱子編碼,該操縱子包 Apx I C、Apx I A、Apx I B、Apx I D 4個(gè)基因，A基因編碼無(wú)活性的前體結(jié)構(gòu)蛋白，C基因編碼毒素激活蛋白，負(fù)責(zé)對(duì)毒素進(jìn)行?；せ?，B、D基因的翻譯后蛋白產(chǎn)物形成跨膜通道，負(fù)責(zé)毒素由細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的分泌。Apx I C、Apx I A、Apx I B、Apx I D基因的核甘酸序列在各種血清型中有高度相似性。Apx II由Apx II操縱子所編碼，該操縱子僅包括結(jié)構(gòu)基因Apx II A和激活基因Apx I C，而無(wú)分泌基因。Apx III由Apx III操縱子所編碼，與Apx I—樣具有完整的操縱子。Apx III雖然沒(méi)有溶血活性，但與Apx I和Apx II 一樣，都具有協(xié)同溶血活性。Apx IV毒素Apx IV毒素是近幾年在研究豬胸膜肺炎放線桿菌分泌的毒素中發(fā)現(xiàn)的，它在整個(gè)致病過(guò)程中的作用尚不清楚，因?yàn)槿鄙貯px I ,Apx ΙΙ,Αρχ III但仍能產(chǎn)生Apx IV的菌株不能引起病變或發(fā)病。研究表明，所有血清型的APP在體內(nèi)均可產(chǎn)生Apx IV毒素。當(dāng)前，用于預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎的商品化疫苗主要是傳統(tǒng)細(xì)菌滅活疫苗和亞單位疫苗。滅活疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但這種免疫反應(yīng)不能保護(hù)動(dòng)物免受APP的再次攻擊和阻止慢性胸膜肺炎的發(fā)生。亞單位疫苗雖然具有較好的免疫效果，然而亞單位疫苗僅含單一或幾種免疫原，因而免疫保護(hù)力也十分有限，而且需要多次注射。另外，通過(guò)物理或化學(xué)方法提取、純化來(lái)制備亞單位疫苗成本高，疫苗的價(jià)格昂貴，使亞單位疫苗難以在臨床上得到廣泛應(yīng)用。豬傳染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一種新型疫苗，它可以激發(fā)良好的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫，具有良好的抗體反應(yīng)和不同血清型菌感染的交叉保護(hù)，而且使用方便、成本低，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。而通過(guò)抗性標(biāo)記基因插入目的基因后通過(guò)同源重組方法來(lái)構(gòu)建弱毒突變株，雖然很容易在抗性選擇性培養(yǎng)基篩選到突變株，但是這些突變株由于含有抗性標(biāo)記，不符合生物安全要求，因此不能用于疫苗生產(chǎn)而只適合基礎(chǔ)研究。在過(guò)去的幾十年里對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)病機(jī)理和與之有關(guān)毒力因子的研究越來(lái)越深入，但直到現(xiàn)在仍然沒(méi)有一種安全、可靠并能夠提供有效的交叉保護(hù)的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供基因缺失突變株、構(gòu)建方法、疫苗及應(yīng)用。一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌Apx I C基因缺失突變株的構(gòu)建方法，該疫苗候選株的株號(hào)為SWl Λ I C，于2011年8月31日保藏在中國(guó)武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NO Μ 2011300 ;分類命名為豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型SWlA I C(Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 5 Sffl Δ I C);包括以下步驟步驟A :構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Δ IC ;所述步驟A具體操作如下步驟A :構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Δ IC ;所述步驟A具體操作如下Al，構(gòu)建APP正負(fù)篩選表達(dá)盒，操作步驟如下 All, APP外膜蛋白啟動(dòng)子序列(OmlaP)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, NC_009053)設(shè)計(jì)引物Po-I和Po_2，以APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Omla基團(tuán)上游的266bp啟動(dòng)子序列；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19-0mlaP ；A12，果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, NC_000964)設(shè)計(jì)引物Ps-I和Ps_2，以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增sacB基團(tuán)；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_sacB ；A13，卡那霉素抗性基因(KarO的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, U55763. I)設(shè)計(jì)引物 Pk-I 和 Pk_2，以質(zhì)粒 pEGFP-NlDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 Kanr 基團(tuán)；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19-Kanr ；A14,正負(fù)篩選表達(dá)盒(OSK)在pBluescript II SK+載體中的構(gòu)建pVAX_0mlaP的構(gòu)建pVAXl經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后回收大片段，pMD19_0mlaP經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Po-1、Po-2為引物進(jìn)行PCR鑒定正確，再用Xho I和EcoR I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為 pVAX-OmlaP ；A15，pVAX-OK的構(gòu)建pVAX_OmlaP經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后回收大片段，pMD19-Kanr經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Pk-1、Pk-2進(jìn)行PCR鑒定，再BamH I和Kpn I酶切鑒定。PCR和酶切鑒定正確的命名為pVAX-OK ；A16, pBS-OK 的構(gòu)建pBluescript II SK+經(jīng) Xho I 和 Kpn I 酶切后回收大片段，pVAX-OK經(jīng)Xho I和Kpn I酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Po-1、Pk-2進(jìn)行PCR鑒定，再用Xho I和Kpn I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定正確的命名為pBS-ΟΚ ；A17，pBS-OSX的構(gòu)建pBS_0K經(jīng)Hind III和Spe I雙酶切后回收大片段，PVAXl經(jīng)Hind III和Spe I雙酶切后回收大小為662bp的小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，用HindIII和SpeI酶切鑒定；將酶切鑒定正確的命名為pBS-ΟΚΧ，連入此片段的目的是利用PVAXl上的小段消除pBS-OK載體多克隆位點(diǎn)上Hind III到Spe I之間的BamH I位點(diǎn)，以方便sacB連接到載體上，該片段將在后面連入右同源臂時(shí)被替換出去；A18，pBS-OSK的構(gòu)建pBS_0KX經(jīng)Bgl II和BamH I雙酶切后回收大片段，由于Bgl II和BamH I是同尾酶,連時(shí)會(huì)發(fā)生自載體身連接,載體酶后用去磷酸酶AlkalinePhosphatase (CIAP)處理，同時(shí)pMD19_sacB經(jīng)Bgl II和BamH I雙酶切后回收小片段；回收的兩個(gè)片段連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Ps-1、Ps-2進(jìn)行PCR鑒定，再Bgl II和BamH I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定正確的命名為pBS_0SK，載體上的OmlaP、sacB、Kanr三個(gè)片段結(jié)合在一起形成正負(fù)篩選表達(dá)盒；A2，構(gòu)建左同源臂和右同源臂，具體操作如下A21，左同源臂的擴(kuò)增及TA克隆根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank，NC_009053)設(shè)計(jì)引物Pl-I和P1-2，以APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Apx I C基團(tuán)上游的2895bp序列；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_L ；A22，右同源臂(R)的擴(kuò)增及TA克隆根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank，NC_009053)設(shè)計(jì)引物Pr-I和P1-2，以 APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Apx I A基團(tuán)上游的1434bp序列；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_R ；A23，左右同源臂連接到pBS-OSK載體中，構(gòu)建最終載體pBOSK Λ I C
pBOSKR的構(gòu)建pBS_OSK經(jīng)Spe I和Sal I雙酶切后回收大片段，pMD19_R經(jīng)Spe I和Sal I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Pr-I、Pr-2為進(jìn)行PCR鑒定；再用Spe I和Sal I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為PBOSKR ；載體pBOSKR中氨芐抗性基因的消除用DNAMAN分析發(fā)現(xiàn)載體上卡那霉素抗性基因的兩端各有一個(gè)Pvu I酶切位點(diǎn)，用Pvu I酶切可以將載體切成兩段，大小分別約為5869bp和1045bp回收大片段，經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，挑選在含有卡那霉素的LB平板生長(zhǎng)，不能在含有氨芐的LB平板生長(zhǎng)的菌落在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用PvuI酶切鑒定；將酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSKR(A_)；pBOSKΔ I C的構(gòu)建pB0SKR(A0經(jīng)Sac I和Spe I雙酶切后回收大片段，pMD19_L先用Pvu I酶切后回收大片段后再用Sac I和Spe I雙酶切后回2895片段，將回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物P1-UP1-2為引物進(jìn)行PCR鑒定，再用Sac I和Spe I酶切鑒定。PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSK Λ I C；A3，重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Λ I C的測(cè)序鑒定步驟B:構(gòu)建APP Apx I C基因缺失株，具體操作如下BI，重組菌的正向篩選將重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Δ I C電轉(zhuǎn)化到APP血清5型SWl，在含有Kan的TSA平板上篩選Kan抗性菌落，將Kan抗性菌落轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的TSA平板上證實(shí)菌落對(duì)蔗糖的敏感性，篩選對(duì)Kan抗性、蔗糖敏感的菌落做PCR鑒定；B2，重組菌的負(fù)向篩選從步驟BI鑒定正確的一個(gè)對(duì)Kan抗性、蔗糖敏感的菌落在沒(méi)有抗性的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，促進(jìn)第二次同源重組；培養(yǎng)液然后以大約每個(gè)平板長(zhǎng)出100個(gè)菌落的濃度把過(guò)夜培養(yǎng)液涂布到含有10%蔗糖TSA平板上，篩選蔗糖抗性菌落。再將具有蔗糖抗性的菌落轉(zhuǎn)印到含有Kan的TSA的平板，鑒定對(duì)Kan的敏感性。篩選對(duì)Kan敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鑒定。根據(jù)上述的構(gòu)建方法獲得的SWl Λ I C基因缺失突變株。所述的基因缺失突變株，該菌株通過(guò)同源重組，成功缺失了溶血外毒素Apx I C基因上475bp的片段，從而使該毒素的毒力喪失，但仍具有免疫原性。所述的基因缺失突變株，該菌株為不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型基因缺失株。所述的基因缺失突變株在制備豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型基因缺失弱毒疫苗中的應(yīng)用。應(yīng)用所述基因缺失突變株制備弱毒疫苗。本發(fā)明是用本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型(SWl)作為親本株，利用基因工程手段將毒素Apx I的激活基因C缺失，缺失的片段大小為475bp。該基因缺失后毒素Apx的蛋白前體不能被正常激活，因而無(wú)法發(fā)揮其毒性作用，對(duì)豬的致病性大大降低，但與此同時(shí)該毒素蛋白前體仍保持著原有的免疫原性。 細(xì)胞毒性和溶血活性實(shí)驗(yàn)表明該缺失株不再具有細(xì)胞毒性和溶血活性，證明其毒力已經(jīng)大大降低。
小白鼠毒力試驗(yàn)表明，該突變株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD5tl)為2 X IO8CFU,而親本株對(duì)小鼠的LD5tl為I. 38X IO7CFU,表明該突變株的毒力已大大降低。仔豬安全性試驗(yàn)表明，當(dāng)對(duì)45日齡的仔豬氣管內(nèi)接種I X IO9CFU該缺失株的凍干弱毒疫苗時(shí)，體溫升高不明顯，也沒(méi)有出現(xiàn)呼吸困難等癥狀，表明在該劑量免疫時(shí)是安全的。而親本株在該劑量下接種的仔豬(對(duì)照組)，第二天出現(xiàn)即出現(xiàn)體溫明顯升高(41. 5°C)，聲音撕?jiǎn)?，呼吸困難，喘氣等癥狀，持續(xù)三天后癥狀才逐漸緩解。小鼠、仔豬的免疫效力實(shí)驗(yàn)表明該突變株能誘導(dǎo)很好的免疫保護(hù)。


圖I :基因缺失突變株SWl Λ IC的構(gòu)建流程圖；圖2 omlA基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增結(jié)果，M為DNA Marker, 1、2為PCR擴(kuò)增結(jié)果 ；圖3 pMD19-0mlaP 的 PCR 和酶切鑒定結(jié)果，M1、M2 為 DNA Marker, 1、2 為 PCR 擴(kuò)增結(jié)果，3、4為酶切后鑒定結(jié)果(Xho I +EcoR I )；圖4 sacB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，M為DNA Marker, 1、2為PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖5 pMD19-sacB 的 PCR 和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2 為 DNA Marker, 1、2 為 PCR 擴(kuò)增結(jié)果，3、4為酶切(Bgl II和BamH I )后鑒定結(jié)果；圖6 =Kanr基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，M為DNA Marker, 1、2為PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖7 pMD19-Kanr的PCR和酶切鑒定結(jié)果，M為DNA Marker, 1、2為PCR擴(kuò)增結(jié)果，3、4為酶切(BamH I +Kpn I )后鑒定結(jié)果；圖8 pVAX-OmlaP 的 PCR 和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2 為 DNA Marker, 1、2 為質(zhì)粒pVAX-OmlaP的PCR鑒定結(jié)果，3為pVAX-OmlaP經(jīng)酶切(Xho I +EcoR I )后的鑒定結(jié)果；圖9 pVAX-OK的PCR和酶切鑒定結(jié)果，M為DNA Marker, I為質(zhì)粒pVAX-OK的PCR鑒定結(jié)果，2、3為pVAX-OK經(jīng)酶切(BamH I +Kpn I )后的鑒定結(jié)果；圖10 pBS-0K載體的PCR和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2為DNA Marker, I為重組質(zhì)粒pBS-OK的PCR鑒定結(jié)果，2、3為pBS-OK經(jīng)酶切(Xho I +Kpn I )后的鑒定結(jié)果；圖11 pBS-0KX的雙酶切鑒定結(jié)果，M為DNA Marker, I為pBS_0KX經(jīng)酶切(Hind III +Spe I )后的鑒定結(jié)果；圖12 pBS-0SK載體的PCR和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2為DNA Marker, I為重組質(zhì)粒pBS-OSK的PCR鑒定結(jié)果，2、3為pBS-OSK經(jīng)酶切(Bgl II +BamH I )后的鑒定結(jié)果；圖13 :左同源臂的PCR擴(kuò)增結(jié)果，M為DNA Marker, 1、2為PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖14 pMD19-L的PCR和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2為DNA Marker, 1、2為重組質(zhì)粒PMD19-L的PCR鑒定結(jié)果，3、4為pMD19-L經(jīng)酶切(Sac I +Spe I )后的鑒定結(jié)果；圖15 :右同源臂的PCR擴(kuò)增結(jié)果，M為DNA Marker, 1、2為PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖16 pMD19-R的PCR和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2為DNA Marker, 1、2為重組質(zhì)粒PMD19-R的PCR鑒定結(jié)果，3、4為pMD19-R經(jīng)酶切(Spe I +Sac I )后的鑒定結(jié)果；圖17 pB0SKR載體的PCR和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2為DNA Marker, 1、2重組質(zhì)粒pBOSKR的PCR鑒定結(jié)果，3、4為pBOSKR經(jīng)酶切(Spe I +Sac I )后的鑒定結(jié)果；圖18 pB0SKA I C載體的PCR和酶切鑒定結(jié)果，Ml、M2為DNA Marker, I為重組質(zhì)粒pBOSK Λ IC的PCR鑒定結(jié)果，2為pBOSK Λ IC經(jīng)酶切(Sac I +Spe I )后的鑒定結(jié)果；
圖19 :正向篩選的第一次突變株的PCR鑒定結(jié)果，M為DNA Marker，I為突變株sacB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為突變株Kanr基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，3為突變株Apx I C基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，4為親本株Apx I C基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖20 :負(fù)向篩選的第二次突變株的PCR鑒定結(jié)果，M為DNA Marker, I為第二次突變株sacB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為第二次突變株Kanr基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，3為第二次突變株Apx I C基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，4為親本株Apx I C基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖21:突變株SWl Λ I C和親本株SWl生長(zhǎng)曲線圖；圖22 :突變株的遺傳穩(wěn)定性鑒定(1-10代)，M為DNA Marker, 1-10為所傳10代細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果；圖23 :倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞-突變株上清接毒后顯微鏡觀察結(jié)果；圖24 :倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞-親本株上清接毒后顯微鏡觀察結(jié)果；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I基因缺失突變株SWl Λ IC的構(gòu)建大腸桿菌DH5a、BL21、枯草芽孢桿菌PKCOl株、傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型菌K17株和SWl株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。大腸桿菌在LB液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)不同的需要?jiǎng)e入終濃度為IOOyg/ml的氨芐青霉素(Amp)或卡那霉素(Kan);傳染性胸膜肺炎放線桿在TSB液體培養(yǎng)基或TSA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入終濃度為10 μ g/ml的NAD。pBluescript II SK+、pVAXl、PCR 產(chǎn)物克隆載體 pMD19_TSimple 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。Taq DNA聚合酶、DNA Marker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。各種限制性內(nèi)切酶、DNALigation KitVer. 2. O、IPTG、Xgl購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)購(gòu)自上海生工。氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)購(gòu)自AMRESC0公司。I、正負(fù)篩選表達(dá)盒的構(gòu)建正負(fù)篩選表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、果聚糖蔗糖酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(KarO，其中啟動(dòng)子的作用主要是轉(zhuǎn)錄后面的兩個(gè)基因，卡那霉素抗性基因(KarO用于第一次基因重組的正向篩選，在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)后具有卡那抗性；果聚糖蔗糖酶基因(sacB)用于第二次的負(fù)向篩選，sacB在APP中表達(dá)后細(xì)菌對(duì)蔗糖敏感，在含有10%蔗糖的平板上細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。(I)APP血清5型外膜蛋白啟動(dòng)子序列(OmlaP)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表的APP-5株序列(Genbank, NC_009053)利用Premier 5設(shè)計(jì)引物Po_l和Po-2，以APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Omla基團(tuán)上游的266bp啟動(dòng)子序列。其中上游引物Po-I含有Xho I位點(diǎn)，下游引物Po-2含有Bgl II和EcoR I位點(diǎn)，該引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下
Po-I :5’ -AAACTCGAGACTTTCAGTGCGTGCCTAT-3’ (Xho I )Po-2 :5，-GAATTCAGATCTCCTTATACTTAAAATACAATAAAT-3，(EcoR I and Bgl II )
擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性 5min ;94°C 30sec,55 °C 30sec,72 °C 20sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C 10min，4°C保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的片段大小約為266bp，與預(yù)期的大小相符(圖2)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T Simple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19-0mlaP。以重組質(zhì)粒為模板，用上述引物進(jìn)行PCR鑒定，再將用Xho I和EcoR I做酶切鑒定(圖3)。
(2)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, NC_000964)利用Premier 5設(shè)計(jì)引物Ps_l和Ps_2,其中上游引物Ps-I含有APP的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和Bgl II位點(diǎn)，下游引物Ps-2含有BamH I位點(diǎn)，以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增sacB基團(tuán)。該引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下Ps-I :5，-AGATCTTTAAGGAGACAACATGAACATCAAAAAGTTTGCA-3’ (Bgl II )Ps-2 :5’ -CCGGATCCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT-3’ (BamH I )擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min ；94°C 30sec，52°C 30sec，72°C I. 5min，31 個(gè)循環(huán)；72°C 10min，4°C保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的片段大小約為1422bp，與預(yù)期的大小相符(圖4)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T Simple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_sacB。以重組質(zhì)粒pMD19-sacB為模板進(jìn)行PCR鑒定，再用Bgl II和BamH I酶切鑒定(圖5)。(3)卡那霉素抗性基因(KarO的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank,U55763. I)利用Premier 5設(shè)計(jì)引物Pk-I和Pk_2,其中上游引物Pk-I含有APP的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和BamH I位點(diǎn)，下游引物Pk_2含有Kpn I位點(diǎn)，該引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成,弓I物序列如下Pk-I :5’ -GGATCCTAAGGAGACAACATGATTGAACAAGATGGATTG-3’ (BamH I )Pk-2 :5， -GGTACCTTAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’ (Kpn I )以質(zhì)粒pEGFP-Nl DNA為模板，PCR擴(kuò)增Kanlr基因，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min ;94°C 30sec,52°C 30sec,72°C 40sec，32 個(gè)循環(huán)；72°C 10min，4°C保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的片段大小約為795bp，與預(yù)期的大小相符(圖6)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到PMD19-T Simple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMDig-Kan1。以重組質(zhì)粒pMD19_TSimple為模板，以上述為引物進(jìn)行PCR鑒定，再用BamH I和Kpn I酶切鑒定產(chǎn)生了一條約為2700bp的條帶和一條約為795bp的條帶，酶切鑒定正確(圖7)。(4)正負(fù)篩選表達(dá)盒(OSK)在pBluescript II SK+載體中的構(gòu)建①pVAX-OmlaP的構(gòu)建pVAXl經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后回收大片段，pMD19-0mlAP經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，以Po-1、Po-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出了一條約為266bp的條帶，表明PCR鑒定正確(圖8)。用Xho I和EcoR I消化重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了一條約3000bp的條帶和一條266bp的條帶，表明酶切鑒定正確(圖8)。PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pVAX-OmlaP。②pVAX-OK的構(gòu)建pVAX-OmlaP經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后回收大片段，pMD19-Kanr經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Pk-1、Pk-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出了一條約為795bp的條帶，PCR鑒定正確(圖9)。用BamH I和Kpn I消化重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了一條約為3200bp的條帶和一條約為795bp的條帶，酶切鑒定正確(圖9)。將PCR和酶切鑒定均正確的質(zhì)粒命名為pVAX-OK。③pBS-OK的構(gòu)建pBluescript II SK+經(jīng)Xho I和Kpn I酶切后回收大片段，pVAX-OK經(jīng)Xho I和Kpn I酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Po-1、Pk-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增Kanlr和OmlaP，擴(kuò)增出了一條約為1060bp的條帶，PCR鑒定正確(圖10)。用Xho I和Kpn I消化重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了一條約為3000bp和1060bp的條帶，酶切鑒定正確(圖10)。將PCR鑒定和酶切鑒定都正確的重組質(zhì)粒命名為pBS-OK。④pBS-OKX的構(gòu)建pBS-0K經(jīng)Hind III和Spe I雙酶切后回收大片段，PVAXl經(jīng)Hind III和Spe I雙酶切后回收大小為662bp的小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，用Hind III和Spe I進(jìn)行酶切鑒定(圖11)。將酶切鑒定正確的命名為pBS_0KX，連入此片段的目的是利用PVAX I上的小段消除pBS-OK載體多克隆位點(diǎn)上Hind III到Spe I之間的BamH I位點(diǎn)，以方便sacB連接到載體上，該片段將在后面連入右同源臂時(shí)被替換出去。⑤pBS-OSK的構(gòu)建pBS-0KX經(jīng)Bgl II和BamH I雙酶切后回收大片段，由于Bgl II和BamH I是同尾酶，連時(shí)會(huì)發(fā)生自載體身連接，載體酶后用去磷酸酶AlkalinePhosphatase (CIAP)處理，同時(shí)pMD19_sacB經(jīng)Bgl II和BamH I雙酶切后回收小片段。回收的兩個(gè)片段連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α中，以重組質(zhì)粒為模板，以Ps-1、Ps-2為引物，PCR擴(kuò)增sacB基因，結(jié)果擴(kuò)增出一條大小約為1422bp的條帶，提示PCR鑒定正確(圖12)。用Bgl II和BamH I消化重組質(zhì)粒，產(chǎn)生一條大小約為4000bp的條帶和一條大小約為1422bp的條帶，提示酶切鑒定正確(圖12)。將PCR鑒定和酶切鑒定正確的命名為pBS-OSK，載體上的OmlaP、sacB> Kanr三個(gè)片段結(jié)合在一起形成正負(fù)篩選表達(dá)盒。2、左同源臂和右同源臂的構(gòu)建(1)左同源臂(L)的擴(kuò)增及TA克隆根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, NC_009053)利用Premier 5設(shè)計(jì)引物P1-1和P1-2,其中上游引物Pl-I含有Sac I位點(diǎn)，下游引物P1-2含有Spe I位點(diǎn)，該引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下Pl-I :5，-GTCAGAGCTCCCGAATAACATCGCATAGT-3，(Sac I )P1-2 :5， -CCCACTAGTCTCTCCTAAAACCTCAAATCCA-3’ (Spe I )以APP血清5型株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Apx I C基團(tuán)上游的2895bp序列。擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性 5min ；94°C 45sec，55°C 30sec，72°C 3min，28 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin,4°C保存。將PCR擴(kuò)增結(jié)束后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小約為2895bp，與預(yù)期的大小相符(圖13)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T Simple載體上，獲得重組質(zhì)粒PMD19-L。以重組質(zhì)粒為模板，以上述為引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出一條大小約2895bp的條帶，PCR鑒定正確(圖14)。重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I和Spe I消化后瓊脂糖凝膠電泳，也產(chǎn)生了一條大小約為2895bp的條帶，酶切鑒定正確(圖14)。對(duì)經(jīng)PCR鑒定和單雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PMD19-L進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果與APP-5b L-20株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，相似性最達(dá)到99. 36%。(2)右同源臂(R)的擴(kuò)增及TA克隆根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, NC_009053)利用Premier 5設(shè)計(jì)引物Pr-I和P1-2,其中上游引物Pr-I含有Spe I位點(diǎn)，下游引物Pr_2含有Sal I位點(diǎn)，上述引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下
Pr-I :5，-GAGACTAGTTAAGGAGACAACATGGCTAAC-3，(Spe I )Pr-2 :5， -CAAGTCGACGACACGCTCTACCGAATACTC-3， (Sal I )
以APP血清5型株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Apx I A基團(tuán)上游的1434bp序列。擴(kuò)增條件為95°C 預(yù)變性 5min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C I. 5min，31 個(gè)循環(huán)；72 °C 10min，4°C保存。將PCR擴(kuò)增結(jié)束后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小約為1434bp，與預(yù)期的大小相符(圖15)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒PMD19-R。以重組質(zhì)粒為模板，以上述為引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出一條大小約1434bp的條帶，PCR鑒定正確(圖16)。重組質(zhì)粒經(jīng)Spe I和Sal I消化后瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生了兩條大小約為2700bp和1434bp的條帶，酶切鑒定正確(圖16)。對(duì)經(jīng)PCR和單雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PMD19-R進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果與APP-5b L-20株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，同源性最達(dá)到99. 93%。(3)左右同源臂連接到pBS-OSK載體中，構(gòu)建最終載體pBOSK Λ I C①pBOSKR的構(gòu)建pBS-0SK經(jīng)Spe I和Sal I雙酶切后回收大片段，pMD19_R經(jīng)Spe I和Sal I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用Pr-1、Pr-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出了一條約為1434bp的條帶，PCR鑒定正確(圖17)。再用Spe I和Sal I消化重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后產(chǎn)生一條約為5500bp條帶和一條約為1434bp的條帶，酶切鑒定正確(圖17)。將PCR鑒定和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSKR。②載體pBOSKR中氨芐抗性基因的消除載體pBluescript II SK+只具有氨芐抗性，在插入正負(fù)篩選表達(dá)盒(OSK)后，經(jīng)卡那霉素抗性試驗(yàn)證明載體pBOSKR也具有了卡那霉素抗性，氨芐抗性基因在載體上已經(jīng)沒(méi)有什么作用，它的存在增加了載體大小，不利于在載體中連接入更多片段，并且Hasty等發(fā)現(xiàn)載體上的非同源序列對(duì)重組效率可能產(chǎn)生影響，所以應(yīng)當(dāng)盡量減少載體上的無(wú)關(guān)序列。用DNAMAN分析發(fā)現(xiàn)載體上卡那霉素抗性基因的兩端各有一個(gè)Pvu I酶切位點(diǎn)，用Pvu I酶切可以將載體切成兩段，大小分別約為5869bp和1045bp回收大片段，經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，挑選在含有卡那霉素的LB平板生長(zhǎng)，不能在含有氨芐的LB平板生長(zhǎng)的菌落在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用Pvu I酶切鑒定。將酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSKR(A_)。③pBOSK Λ I C的構(gòu)建pB0SKR(A_)經(jīng)Sac I和Spe I雙酶切后回收大片段，PMD19-L先用Pvu I酶切后回收大片段后再用Sac I和Spe I雙酶切后回收2895bp的片段，將回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用Pl-1、P1-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條約為6000bp的條帶和一條約為2895bp的條帶，PCR鑒定正確(圖18)。再用Sac I和Spe I消化重組質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳后產(chǎn)生了一條約為6000bp的條帶和一條約為2895bp的條帶，酶切鑒定正確(圖18)。將PCR鑒定和酶切切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為 pBOSKΛ I Co3、重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Λ I C的測(cè)序鑒定對(duì)所構(gòu)建載體pBOSKA I C上的多克隆位點(diǎn)之間的插入序列進(jìn)行測(cè)序，以鑒定所插入片段的堿基序列是否正確。測(cè)序結(jié)果表明插入的5個(gè)DNA片段的連接順序、方向和酶切位點(diǎn)與之前設(shè)計(jì)的一致，堿基沒(méi)有發(fā)生突變。4、重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Λ I C的正負(fù)篩選活性鑒定
(I)卡那霉素抗性實(shí)驗(yàn)分別將含有質(zhì)粒pBS-OK、pBOSK Δ I C和pBluescript II SK+的大腸桿菌劃線接種到含有卡那霉素的LB平板上，觀察在平板上的生長(zhǎng)情況來(lái)驗(yàn)證質(zhì)粒中的Karf基因是否在載體中表達(dá)。結(jié)果含有質(zhì)粒PBOSKA I C的大腸桿菌在平板上能夠生長(zhǎng)，含有有質(zhì)粒pBluescript II SK+的大腸桿菌在平板上不能夠生長(zhǎng),說(shuō)明質(zhì)粒中的Kanlr基因能夠在載體中表達(dá)。(2)蔗糖敏感性實(shí)驗(yàn)再將含有質(zhì)粒pBS-OK、pBS-OSK和pBOSK Λ I C的大腸桿菌劃線接種到含有卡那霉素的LB+10% S固體培養(yǎng)基上，如果質(zhì)粒中的sacB表達(dá)了果聚糖蔗糖酶，則使大腸桿菌對(duì)蔗糖敏感，在含有10%蔗糖的LB上生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)果如下含有質(zhì)粒pBS-OSK和pBOSK Δ I C的大腸桿菌在平板上不能夠生長(zhǎng)，含有有質(zhì)粒pBS-OK的大腸桿菌在平板上能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明質(zhì)粒pBS-ΟΚ在連入sacB基因后，表達(dá)了果聚糖蔗糖酶，使大腸桿菌對(duì)蔗糖敏感，在含有10%蔗糖的LB上生長(zhǎng)受到抑制。5、基因缺失突變株SWl Λ I C的構(gòu)建(I)重組菌的正向篩選基因缺失株SWl Λ I C的構(gòu)建的流程圖見(jiàn)附圖I。將重組轉(zhuǎn)移載體pBOSKA I C電轉(zhuǎn)化到親本株，在含有Kan的TSA平板上篩選Kan抗性菌落，將Kan抗性菌落轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的TSA平板上，通過(guò)與親本菌SWl在平板上的生長(zhǎng)情況對(duì)比，證實(shí)蔗糖對(duì)正向篩選到的菌落生長(zhǎng)有明顯抑制作用。在第一次突變后，重組轉(zhuǎn)移載體通過(guò)同源重組，整合到了 APP的基因組內(nèi)，Apx I C兩側(cè)的序列有兩個(gè)拷貝，一個(gè)是載體上缺失了 Apx I C部分基因片段的，另一個(gè)是APP自身的，因此用Apx I C兩側(cè)的引物可以擴(kuò)增兩個(gè)條帶，一個(gè)是含有完整Apx I C的878bp的和一個(gè)缺失Apx I C的403bp的條帶，從篩選到的第一次突變株P(guān)CR分別擴(kuò)增到了 1422的sacB、795bp的Kan'SiSbp的Apx I C及兩側(cè)序列,缺失了 Apx I C的擴(kuò)增結(jié)果只包括其兩側(cè)403bp的序列，PCR鑒定結(jié)果正確(圖19)。(2)重組菌的負(fù)向篩選篩選出一個(gè)上一步鑒定正確的具有Kan抗性、蔗糖敏感的菌落，在沒(méi)有Kan抗性的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，促進(jìn)第二次同源重組。培養(yǎng)至適當(dāng)濃度時(shí)，將培養(yǎng)液涂布到含有10%蔗糖的TSA平板上，篩選蔗糖抗性菌落。再將具有蔗糖抗性的菌落轉(zhuǎn)印到含有Kan的TSA的平板，鑒定對(duì)Kan的敏感性。篩選對(duì)Kan敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鑒定。結(jié)果不能從突變株中擴(kuò)增出Kanlr基因、sacB基因和Apx I C基因，能夠擴(kuò)增到一個(gè)大小為403bp缺失了 Apx I C基因的的條帶，表明在第二次突變時(shí)Apx I C基因已經(jīng)從細(xì)菌基因組中敲除，PCR鑒定正確(圖20)。實(shí)施例2.基因缺失株SWl Λ I C的生物學(xué)特性研究(I)生長(zhǎng)特性試驗(yàn)分別將突變株(SWl △ I C)和親本株(SWl)的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后取50 μ L上述菌液接種50mLTSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待0D_值都為0. 13時(shí)開始測(cè)定，每隔Ih取樣，以核酸蛋白儀讀取其OD6tltl值，通過(guò)每一時(shí)間點(diǎn)OD6tltl值大小比較它們的生長(zhǎng)速度。根據(jù)0D_值繪制親本株和突變株的生長(zhǎng)曲線，對(duì)比兩者的生長(zhǎng)特性。
突變株和親本株的生長(zhǎng)曲線如圖21所示。從生長(zhǎng)曲線可以看出突變株和親本株的生長(zhǎng)基本保持一致，這表明Apx I C基因的缺失沒(méi)有影響到突變株的生長(zhǎng)速度。(2)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
將突變株涂布于含卡那霉素的TSA平板上37°C培養(yǎng)，挑取單菌落傳代并保種，連續(xù)傳10代。將每代的菌種接種TSB液體培養(yǎng)基觀察細(xì)菌是否生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)每代菌種的菌液進(jìn)行基因組抽提，以Pc-l、Pc-2做為引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖22所示，每代PCR擴(kuò)增的條帶沒(méi)有發(fā)生變化，這表明Apx I C基因缺失位點(diǎn)的DNA能夠維持穩(wěn)定狀態(tài)。(3)溶血活性試驗(yàn)挑取突變株、親本株和DH5 α接種于兔血TSA瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，觀察它們的溶血情況。親本株可分泌溶血素，菌落周圍可產(chǎn)生透明溶血環(huán)，作為陽(yáng)性對(duì)照；DH5a不分泌溶血素，菌落周圍不產(chǎn)生透明溶血環(huán)，作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，突變株菌落周圍沒(méi)有出現(xiàn)溶血環(huán)，親本株菌落周圍出現(xiàn)了 2 3mm的透明溶血環(huán)，陰性對(duì)照大腸桿菌DH5a菌落周圍也沒(méi)有溶血環(huán)，結(jié)果表明了激活了的Apx I A在APP5親本株的溶血上起了主要作用，而本研究構(gòu)建的突變株由于Apx I C的缺失導(dǎo)致Apx I A激活失敗，因而喪失了溶血活性。(4)細(xì)胞毒性試驗(yàn)分別挑取親本株和突變株單菌落接種TSB液體培養(yǎng)基，200r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中晚期。取菌液12000r/min離心lmin，取上清用O. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。培養(yǎng)倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞(BHK21) 3瓶，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，分別接種親本株上清、突變株上清和TSB液體培養(yǎng)基各3mL，接毒后48h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。接突變株菌液上清的兩瓶和接TSB液體培養(yǎng)基的兩瓶細(xì)胞彼此無(wú)顯著差異，細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)明顯細(xì)胞病變(圖23);接親本株菌液上清的兩瓶細(xì)胞病變明顯，可見(jiàn)多處因細(xì)胞死亡脫落形成的空斑(圖24)。結(jié)果表明突變株上清對(duì)細(xì)胞毒性減弱，達(dá)到了預(yù)期目的。實(shí)施例3.缺失株(SWl △ I C)弱毒疫苗的制備對(duì)所構(gòu)建的APP血清5型突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，將缺失突變株劃線培養(yǎng)在含O. 01 % NAD的TSA平板(以下均同)上37°C培養(yǎng)，至長(zhǎng)出明顯菌落后挑取單菌落連續(xù)傳代培養(yǎng)，代次定為10代，并將每代的菌種接種到含O. 01 % NAD的TSB培養(yǎng)液(以下均同)中觀察細(xì)菌是否生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)每代的細(xì)菌做PCR鑒定，至第10代仍能擴(kuò)增出缺失后的475bp的條帶，遺傳性穩(wěn)定。將該基因缺失株接種至含5mLTSB培養(yǎng)液的試管中復(fù)蘇6-8h后，劃線接種到TSA平板上37°C恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，至第二天挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種到IOOmLTSB培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液的0D_達(dá)到2. O左右時(shí)，活菌數(shù)約6 X 109CFU/mL,此時(shí)在超凈工作臺(tái)中將菌液和20%脫脂乳(已滅菌)按I : I的比例混合均勻，以2mL/瓶進(jìn)行分裝，用滅菌脫脂棉封口，置于_20°C冰箱中凍存24h后，在_50°C冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍真空干燥，然后取出、壓蓋，_20°C保存。同時(shí)做疫苗成品檢驗(yàn)，檢驗(yàn)內(nèi)容包括物理性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)，該批疫苗為海綿狀疏松團(tuán)塊，色白略呈微黃，易于瓶壁脫離，加稀釋液后能迅速溶解，將該品無(wú)菌稀釋后劃線接種于TSA平板，37°C培養(yǎng)24h，未出現(xiàn)雜菌污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合要求，可作為研制基因缺失疫苗的菌株。實(shí)施例4. APP血清5型突變株弱毒疫苗對(duì)小鼠的毒力實(shí)驗(yàn)及LD5tl的測(cè)定將基因缺失株(SWl Δ I C)與親本株(SWl)凍干菌接種到TSB培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)12h，第二天以I : 100的比例接種于新制的TSB培養(yǎng)基中。37°C 300rpm振蕩培養(yǎng)3h后，用TSB洗滌菌體3次，恢復(fù)原體積，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用TSB將菌液依次進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射到6只6周齡BalB/C雌鼠，每只O. 2mL。觀察I周，記錄小鼠死亡情況。根據(jù)寇氏(Korbor)法計(jì)算LD5tlt5得出缺失株的LD5tl為2X IO8CFU,親本株LD5tl為1. 38 X IO7CFU0結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的基因缺失株比親本菌的毒力有明顯降低。實(shí)施例5. APP血清5型突變株弱毒疫苗的仔豬安全性實(shí)驗(yàn)將本實(shí)驗(yàn)室制備的突變株弱毒疫苗氣管內(nèi)接種10只45日齡的仔豬(胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測(cè)為陰性)，每只接種的劑量為Iml (約含活菌數(shù)I X IO9CFU)。同時(shí)做親本株以及TSB培養(yǎng)液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每日觀察仔豬的癥狀、食欲及精神狀況，記錄體溫變化情況，連續(xù)觀察2周。結(jié)果接種疫苗的仔豬體溫升高不明顯，也沒(méi)有出現(xiàn)呼吸困難等癥狀，仔豬精神狀況良好，食欲正常，2周后剖檢，發(fā)現(xiàn)胸腔及心包均無(wú)積液，肺臟大小正常、表面光滑無(wú)病變，與胸膜壁層無(wú)纖維素性粘連，這表明在該劑量接種時(shí)對(duì)仔豬是安全的。而親本株在該劑量下氣管內(nèi)接種的仔豬(對(duì)照組)，第二天出現(xiàn)即出現(xiàn)體溫明顯升高(41.7°C)，精神沉郁，食欲下降，喜臥，聲音撕?jiǎn)?，呼吸困難，喘氣等癥狀，持續(xù)三天后癥狀才逐漸緩解，2周后剖檢發(fā)現(xiàn)胸腔內(nèi)有典型的豬傳染性胸膜肺炎病理變化。注射TSB培養(yǎng)液的仔豬沒(méi)有表現(xiàn)任何臨診癥狀和體溫變化。實(shí)施例6. APP血清5型突變株疫苗對(duì)小鼠的免疫效力實(shí)驗(yàn)(1)小鼠的免疫程序選擇體重為20g左右的BalB/C小鼠48只，按實(shí)驗(yàn)要求分為6組，每組8只。1_3組小鼠腹腔注射200 μ L本研究制備的弱毒疫苗(含活菌數(shù)約為2 X IO7CFU)，4-6組小鼠腹腔注射200 μ L滅菌TSB培養(yǎng)液。分別于兩周及四周后對(duì)1-3組小鼠以同樣的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，同時(shí)對(duì)4-6組小鼠也腹腔注射200 μ L滅菌TSB培養(yǎng)液。并分別于免疫前O天、首免后二周、二免后二周及三免后二周檢測(cè)小鼠血清中Apx I -ELISA的抗體水平。(2)免疫小鼠的Apx I毒素抗體水平檢測(cè)分別于免疫前O天、首免后二周(第14天)、二免后二周(第28天)及三免后二周(第42天)對(duì)小鼠尾靜脈負(fù)壓采血，分離血清，采用間接ELISA方法檢測(cè)血清中Apx I毒素的抗體水平。檢測(cè)結(jié)果如下免疫基因缺失疫苗的小鼠在免疫前的抗體水平平均為O. 141，首免二周為O. 18，二免二周為O. 381，三免二周升至O. 862。而注射TSB培養(yǎng)液的三組小鼠，其抗體水平前后差別不大，平均值為O. 128 (如表2所示)。該結(jié)果表明本發(fā)明所制備的基因缺失疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗豬傳染性胸膜肺炎體液免疫應(yīng)答。(3)免疫小鼠的攻毒保護(hù)率實(shí)驗(yàn)根據(jù)前面小鼠毒力實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的親本株的LD5tl,以此作為參照確定第1、4組小鼠的攻毒劑量為10倍LD5tl,攻毒劑量為200 μ L,接種途徑為腹腔注射。為了確定該基因缺失疫苗對(duì)異源血清型是否也具有交叉免疫保護(hù)率，特選用毒力較強(qiáng)的APP血清I型和血清7型作為攻毒菌株。因此用APP血清I型作為第2、5組小鼠的攻毒菌株，APP血清7型作為第3、6組小鼠的攻毒菌株，攻毒劑量和接種途徑同第1、4組小鼠(見(jiàn)表2)。表2.免疫小鼠的攻毒保護(hù)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌Apx I C基因缺失突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟A:構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pBOSKA I C ;所述步驟A具體操作如下 Al，構(gòu)建APP正負(fù)篩選表達(dá)盒，操作步驟如下 All，APP外膜蛋白啟動(dòng)子序列(OmlaP)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank, NC_009053)設(shè)計(jì)引物Po-I和Po_2，以APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Omla基團(tuán)上游的266bp啟動(dòng)子序列；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19-0mlaP ； A12,果聚糖鹿糖酶基因(sacB)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank,NC_000964)設(shè)計(jì)引物Ps-I和Ps_2，以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增sacB基團(tuán)；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_sacB ； A13,卡那霉素抗性基因(Kanlr)的擴(kuò)增、TA克隆及鑒定根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank,U55763. I)設(shè)計(jì)引物Pk-I和Pk_2，以質(zhì)粒pEGFP-Nl DNA為模板，PCR擴(kuò)增Kanlr基因；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMDig-Karf ； A14,正負(fù)篩選表達(dá)盒(OSK)在pBluescript II SK+載體中的構(gòu)建pVAX-0mlaP的構(gòu)建PVAXI經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后回收大片段，pMD19_0mlaP經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Po-1、Po-2為引物進(jìn)行PCR鑒定正確，再用Xho I和EcoR I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為PVAX-OmlaP ； A15，pVAX-0K的構(gòu)建pVAX-OmlaP經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后回收大片段，pMD19_Kanr經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Pk-I、Pk-2進(jìn)行PCR鑒定，再BamH I和Kpn I酶切鑒定。PCR和酶切鑒定正確的命名為pVAX-OK ； A16，pBS-0K 的構(gòu)建pBluescript II SK+經(jīng)Xho I 和 Kpn I 酶切后回收大片段，pVAX-OK經(jīng)Xho I和Kpn I酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Po-l、Pk-2進(jìn)行PCR鑒定，再用Xho I和Kpn I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定正確的命SSpBS-OK ； 八17，？85-05乂的構(gòu)建巾85-01(經(jīng)出11(1111和3 6 I雙酶切后回收大片段，PVAXl經(jīng)Hind III和Spe I雙酶切后回收大小為662bp的小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，用Hind III和Spe I酶切鑒定；將酶切鑒定正確的命名為pBS-ΟΚΧ，連入此片段的目的是利用PVAXl上的小段消除pBS-OK載體多克隆位點(diǎn)上Hind III到Spe I之間的BamH I位點(diǎn)，以方便sacB連接到載體上，該片段將在后面連入右同源臂時(shí)被替換出去； A18，pBS-OSK的構(gòu)建pBS-0KX經(jīng)Bgl II和BamH I雙酶切后回收大片段，由于Bgl II和BamH I是同尾酶，連時(shí)會(huì)發(fā)生自載體身連接，載體酶后用去磷酸酶AlkalinePhosphatase (CIAP)處理，同時(shí)pMD19_sacB經(jīng)Bgl II和BamH I雙酶切后回收小片段；回收的兩個(gè)片段連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，以重組質(zhì)粒為模板，用引物Ps-1、Ps-2進(jìn)行PCR鑒定，再Bgl II和BamH I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定正確的命名為pBS_0SK，載體上的OmlaP、sacB、Kanr三個(gè)片段結(jié)合在一起形成正負(fù)篩選表達(dá)盒； A2，構(gòu)建左同源臂和右同源臂，具體操作如下A21，左同源 臂的擴(kuò)增及TA克隆根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank，NC_009053)設(shè)計(jì)引物 Pl-I和P1-2，以APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Apx I C基團(tuán)上游的2895bp 序列；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_L ；A22，右同源臂(R)的擴(kuò)增及TA克隆根據(jù)已發(fā)表序列(Genbank，NC_009053)設(shè)計(jì)引物 Pr-I和P1-2，以APP血清5型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增的Apx I A基團(tuán)上游的1434bp 序列；將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-TSimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD19_R ；A23，左右同源臂連接到pBS-OSK載體中，構(gòu)建最終載體pBOSKA I C pBOSKR的構(gòu)建pBS-0SK經(jīng)Spe I和Sal I雙酶切后回收大片段，pMD19_R經(jīng)Spe I 和Sal I雙酶切后回收小片段，回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物 Pr-UPr-2為進(jìn)行PCR鑒定；再用Spe I和Sal I酶切鑒定；PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSKR;載體pBOSKR中氨芐抗性基因的消除用DNAMAN分析發(fā)現(xiàn)載體上卡那霉素抗性基因的兩端各有一個(gè)Pvu I酶切位點(diǎn)，用Pvu I酶切可以將載體切成兩段，大小分別約為5869bp 和1045bp回收大片段，經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，挑選在含有卡那霉素的LB平板生長(zhǎng)，不能在含有氨芐的LB平板生長(zhǎng)的菌落在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用 Pvu I酶切鑒定；將酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSKR (A_)；pBOSK Δ I C的構(gòu)建pB0SKR(A_)經(jīng)Sac I和Spe I雙酶切后回收大片段，pMD19_L先用Pvu I酶切后回收大片段后再用Sac I和Spe I雙酶切后回2895片段，將回收的兩個(gè)片段進(jìn)行定向連接，以重組質(zhì)粒為模板，用引物P1-UP1-2為引物進(jìn)行PCR鑒定，再用Sac I 和Spe I酶切鑒定。PCR和酶切鑒定都正確的質(zhì)粒命名為pBOSK Λ I C ；A3，重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Λ I C的測(cè)序鑒定；步驟B :構(gòu)建基因缺失株SWl Δ I C，具體操作如下BI，重組菌的正向篩選將重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK Δ I C電轉(zhuǎn)化到APP血清5型SWl，在含有Kan的TSA平板上篩選Kan抗性菌落，將Kan抗性菌落轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的TSA平板上證實(shí)菌落對(duì)蔗糖的敏感性，篩選對(duì)Kan抗性、蔗糖敏感的菌落做PCR鑒定；B2，重組菌的負(fù)向篩選從步驟BI鑒定正確的一個(gè)對(duì)Kan抗性、蔗糖敏感的菌落在沒(méi)有抗性的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，促進(jìn)第二次同源重組；培養(yǎng)液然后以大約每個(gè)平板長(zhǎng)出100個(gè)菌落的濃度把過(guò)夜培養(yǎng)液涂布到含有10%蔗糖TSA平板上，篩選蔗糖抗性菌落。再將具有蔗糖抗性的菌落轉(zhuǎn)印到含有Kan的TSA的平板，鑒定對(duì)Kan的敏感性。篩選對(duì)Kan敏感、蔗糖抗性的菌落做 PCR鑒定，最終篩選到一株鑒定正確的Apx I C基因缺失突變株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法獲得的SWlΛ I C基因缺失突變株，保藏號(hào)為 CCTCC M 2011300。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因缺失突變株，其特征為該菌株通過(guò)同源重組，成功缺失了溶血外毒素Apx I C基因上475bp的片段，從而使該毒素的毒力喪失，但仍具有免疫原性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因缺失突變株，其特征在于該菌株為不含抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型基因缺失株。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因缺失突變株在制備豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型基因缺失弱毒疫苗中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的弱毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無(wú)抗性標(biāo)記的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxⅠC基因缺失突變株，該疫苗候選株的株號(hào)為SW1ΔⅠC，于2011年8月31日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC M 2011300；利用基因工程手段將毒素ApxⅠ的激活基因C缺失，缺失的片段大小為475bp。本發(fā)明所構(gòu)建的基因缺失株遺傳穩(wěn)定，不會(huì)返強(qiáng)。本發(fā)明還利用該基因缺失株制備了基因缺失弱毒疫苗，同時(shí)通過(guò)小白鼠、仔豬的免疫效力試驗(yàn)證明該疫苗能誘導(dǎo)良好的免疫保護(hù)。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102618453SQ201110336150
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者劉瓊, 華方根, 文心田, 文翼平, 曹三杰, 李建, 王國(guó)鑌, 謝文浩, 趙勤, 黃小波 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)