專利名稱：結(jié)合tweak的抗體的制作方法
結(jié)合TWEAK的抗體本申請(qǐng)是中國(guó)申請(qǐng)200680027581. 1的分案申請(qǐng)，該母案的國(guó)際申請(qǐng)日為2006年 5月25日，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。交叉引用的相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2005年5月27日提交的美國(guó)申請(qǐng)60/685，149的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
與腫瘤壞死因子(TNF)-相關(guān)的細(xì)胞因子都?xì)w屬于同一個(gè)蛋白質(zhì)超家族，它們具有很多功能，包括涉及免疫調(diào)節(jié)和凋亡調(diào)節(jié)的那些功能。TWEAK (TNF-樣的誘導(dǎo)凋亡的弱誘導(dǎo)物)是此超家族中的一員。發(fā)明概述抗TWEAK抗體可用來(lái)治療多種疾病如炎性疾病，神經(jīng)性疾病或其它本文所述的疾病。當(dāng)用于治療人類受試者時(shí)，所述抗體優(yōu)選是人的(HUMAN)、人源化的或是有效人化的 (EFFECTIVELY HUMAN)抗體?！矫?，本發(fā)明公開了包含第一和第二種免疫球蛋白可變區(qū)序列、并結(jié)合 TWEAK(例如人TWEAK)的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)能以，比如，Kd低于10_7M，如10_8，10_9，10_10， IiT11M或更好的親和力結(jié)合TWEAK。所述蛋白質(zhì)在本文中也稱為“抗TWEAK抗體”。所述第一和第二種免疫球蛋白可變區(qū)序列可包括免疫球蛋白可變區(qū)中至少足以形成結(jié)合TWEAK的抗原結(jié)合位點(diǎn)的部分。通常，第一和第二種免疫球蛋白可變區(qū)序列分別對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白重鏈和輕鏈(如成對(duì)的或者另外匹配的重鏈和輕鏈)的可變區(qū)序列。所述抗體能結(jié)合TWEAK上包括由P2D10識(shí)別的表位中的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)氨基酸殘基的表位，能結(jié)合P2D10識(shí)別的TWEAK的肽(例如長(zhǎng)度不足25、20或15個(gè)氨基酸的肽)或能結(jié)合P2D10所識(shí)別的TWEAK的區(qū)域。例如，所述抗體特異性結(jié)合TWEAK(尤其人TWEAK，例如TWEAK的可溶性區(qū)域)的表位，例如線性或構(gòu)象性表位。所述抗體可與P2D10 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TWEAK，例如人TWEAK。所述抗體可競(jìng)爭(zhēng)性抑制P2D10結(jié)合TWEAK，如人TWEAK。一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體可結(jié)合與P2D10的表位重疊的表位，如與P2D10表位有至少一個(gè)、 兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)氨基酸相同，或通過(guò)結(jié)合而在空間上(sterically)阻礙TWEAK與P2D10 相互作用的表位。例如，抗TWEAK抗體能結(jié)合TWEAK并調(diào)控(例如抑制)TWEAK和TWEAK受體如 Fnl4(如人Fnl4)之間的相互作用(如結(jié)合)。所述抗體也可降低TWEAK受體的信號(hào)傳導(dǎo)活性。所述抗體可靶向TTOAK、隔離(sequester)TTOAKjP /或調(diào)控TWEAK的體內(nèi)穩(wěn)定性。一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合TWEAK上與Fnl4(如人Fnl4)接觸的相互作用位點(diǎn)的至少一部分。所述抗體可與Fnl4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TWEAK，如人TWEAK。所述抗體可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fnl4結(jié)合TWEAK。所述抗體可與TWEAK上的表位相互作用，所述表位是因與抗體結(jié)合而在空間上阻礙TWEAK與Fnl4(如人TWEAK與人Fnl4)相互作用的表位。一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體能抑制一或多種TWEAK-相關(guān)活性，其IC5tl為約50nM-5pM，通常為約100_250pM或更低。例如，所述抗體能抑制TWEAK促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖或新血管形成的能力。一個(gè)實(shí)施方案中，抗TWEAK抗體降低至少一種TWEAK-相關(guān)活性，從而例如在將所述抗體給予受試者后能調(diào)控炎性疾病。在其它實(shí)施方案中，所述抗體能以IO3-IO8M^通常IO4-IOl1iT1的動(dòng)力學(xué)結(jié)合 (associate with)TWEAK。另一實(shí)施方案中，所述抗體有Κ^-ΙΟ、—1，通常Κ^-ΙΟ—、-1的解離動(dòng)力學(xué)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體以與單克隆抗體P2D10或其修飾形式，如其嵌合形式或人源化形式(如本文所述的人源化形式)類似(如5或10倍以內(nèi))的親和力和/或動(dòng)力學(xué)結(jié)合TWEAK，如人TWEAK?？捎美缟飩鞲衅骷夹g(shù)(BIAC0RE )，檢測(cè)抗TWEAK抗體的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是全長(zhǎng)抗體的抗原結(jié)合片段，如Fab、F (ab’)2、Fv或單鏈Fv片段。通常，所述抗體是全長(zhǎng)抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或單特異性抗體。例如，所述抗體在包含不足20種其它的抗TWEAK抗體的組合物中，如在不包含其它種類的抗 TffEAK抗體的組合物中。所述抗體可以是有效人化的。“有效人化的”抗體是包含足夠數(shù)量的人氨基酸位置、因而不在正常人體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答的抗體。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)不引起中和抗體應(yīng)答， 如人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。很多情況下，HAMA會(huì)帶來(lái)問(wèn)題，如需要重復(fù)給予抗體時(shí)，如在治療慢性或復(fù)發(fā)性疾病時(shí)。HAMA反應(yīng)可以因抗體的血清清除增加(見例如Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother. ,32 180-190 (1990))、以及還因潛在的變態(tài)反應(yīng)(見例如 LoBuglio et al. (1986)Hybridoma，5 :5117_5123)，而使重復(fù)給予抗體有可能變得失效。例如，所述抗體可以是人的、人源化的、CDR-移植的、嵌合的、突變的、親和力成熟的、脫敏的(deimmimized)、合成的或者體外產(chǎn)生的抗體，及它們的組合。一個(gè)實(shí)施方案中， 抗TWEAK抗體是人源化抗體?？筎WEAK抗體的重鏈和輕鏈可以基本上是全長(zhǎng)的。所述蛋白質(zhì)可包含至少一條、優(yōu)選兩條完整重鏈，和至少一條、優(yōu)選兩條完整輕鏈，或可包含抗原結(jié)合片段(如Fab， F (ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv片段)。其它實(shí)施方案中，所述抗體具有重鏈恒定區(qū)，其選自如IgGl， IgG2，IgG3，IgG4，IgM, IgAl，IgA2，IgD，和 IgE ；尤其選自如 IgGl，IgG2，IgG3，和 IgG4，更尤其為IgGl (如人IgGl)。通常，重鏈恒定區(qū)是人的或是人恒定區(qū)的修飾形式。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體具有輕鏈恒定區(qū)，其選自κ或λ，尤其κ (如人K)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含本文公開的抗體(如P2D10)的輕鏈或重鏈可變區(qū)的至少一個(gè)、兩個(gè)、優(yōu)選三個(gè)⑶R。上下文中，⑶R指Chothia超變環(huán)所限定的⑶R。例如， 所述蛋白質(zhì)在重鏈可變區(qū)序列的CDR區(qū)中，可以包含至少1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)如下序列GFTFSRYAMS(CDRl)(SEQ ID NO 1),EISSGGSYPYYPDTVTG(CDR2)(SEQ ID NO 2),VLYYDYDGDRIEVMDY(CDR3)(SEQ ID NO 3),或具有與上述序列相比有差異(如差異數(shù)與CDR長(zhǎng)度成比例)的氨基酸序列，所述差異是，每10個(gè)氨基酸有不超過(guò)4、3、2. 5、2、1. 5、1或0. 5個(gè)改變(如取代、插入或缺失)， 如每個(gè)⑶R有至少1個(gè)、但不超過(guò)2、3或4個(gè)改變。重鏈可變區(qū)序列可以將這些⑶R序列具體包含在⑶R3中，或包含在至少兩個(gè)⑶R(如⑶Rl和⑶R3，⑶R2和⑶R3)中，或包含在所有三個(gè)⑶R中。
所述蛋白質(zhì)的重鏈可變區(qū)序列的⑶R區(qū)中可包含至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)如下序列 (括號(hào)中的氨基酸代表在具體位置的可選氨基酸)(i) G- (YF) - (NT) _F_ (STDN) - (RY) -Y-A- (MIL) - (HS) ； (SEQ ID NO 4)，或(ii) Y-Y-(PV)-D-(TS) + (TK)-G ； (SEQ ID NO 5)禾口(iii) (VL) -(IL) -(YF) -(YF) -D-(YF) -D ； (SEQ ID NO 6)或(DE) - (RK) - (ILVM) - (EQD) - (VAL) -M- (DE) ； (SEQ ID NO :7)。所述蛋白質(zhì)的輕鏈可變區(qū)序列的⑶R區(qū)中，可包含至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)如下序列RSSQSLVSSKGNTYLH ； (CDRl)(SEQ ID NO 8)，KVSNRFS ； (CDR2) (SEQ ID NO :9)，和SQSTHFPRT ； (CDR3) (SEQ ID NO 10)，或具有與上述序列相比有差異(如差異數(shù)與CDR長(zhǎng)度成比例)的氨基酸序列，所述差異是，每10個(gè)氨基酸有不超過(guò)4、3、2. 5、2、1. 5、1或0. 5個(gè)改變(如取代、插入或缺失)， 如每個(gè)⑶R有至少1個(gè)、但不超過(guò)2、3或4個(gè)改變。輕鏈可變區(qū)序列可以將這些⑶R序列具體包含在⑶R3中，或包含在至少兩個(gè)⑶R(如⑶Rl和⑶R3，⑶R2和⑶R3)中，或包含在所有三個(gè)⑶R中。所述蛋白質(zhì)的輕鏈可變區(qū)序列的⑶R區(qū)中可包含至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)如下序列 (括號(hào)中的氨基酸代表在具體位置的可選氨基酸)(i) (RK) -S-S-Q-S- (Li) - (KV) -S-S- (KR) -G-N- (TN) -Y-L- (EHDNQY) ； (SEQID NO 11)，或(RK)-S-S-Q-S- (Li) -YSS- (KR) -G-N- (TN) -Y-L-H ； (SEQ ID NO 12)(ii) (KE) - (LVI) -S- (NYS) - (Rff) - (FAD) -S ； (SEQ ID NO 13)，或K (LVI) -S- (NYS) -R- (FAD) -S ； (SEQ ID NO 14)，禾口(iii) (SM) -Q-(GSA) -(ST) -(HEQ) -(FffL) -P ； (SEQ ID NO 15)或S-Q- (GSA) - (SIT) - (HEQ) -F-P ； (SEQ ID NO 16)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含P2D10的所有六個(gè)⑶R或緊密相關(guān)的⑶R， 如相同的CDR，或具有至少一個(gè)、但不超過(guò)兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)氨基酸改變(如取代、插入或缺失)的CDR，或本文所述其它CDR。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含與P2D10有相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonical structures)和對(duì)應(yīng)的Chothia CDR區(qū)的至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR區(qū)，如與P2D10的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的至少CDRl和/或CDR2相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)。所述蛋白質(zhì)可包含如下序列之一· DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 17)· DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 18)· DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 19)· DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRF
6SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 20)· DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 21)· DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 22)· DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 23)· DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 24)· DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWLQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 25) · DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRSSQSLVSSKGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHFPRT(SEQ ID NO 26)或具有少于八個(gè)、七個(gè)、六個(gè)、五個(gè)、四個(gè)、三個(gè)、或兩個(gè)改變(如取代、插入或缺失，如保守取代或?qū)2D10、huP2D10-Ll或huP2D10_L2對(duì)應(yīng)位置的氨基酸殘基的取代)的序列。取代舉例在如下 Kabat 位置之一 2，4，6，35，36，38，44，47，49，62，64-69，85，87，98， 99，101和102。所述取代可例如，將P2D10的一或多個(gè)氨基酸取代到框架區(qū)(如人框架區(qū)) 的對(duì)應(yīng)位置，如在FR2中(如將根據(jù)保守編號(hào)的位置46取代為Phe)以及在FR3中(如將位置87取代為Phe)。所述蛋白質(zhì)的重鏈可變區(qū)可包括如下序列之一· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGR VTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 27)· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFT FSRYAMSffVRQAPGQRLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTG RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 28)· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQATGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 29)· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFT FSRYAMSffVRQAPGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTG RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 30)· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFT FSRYAMSffVRQAPGKGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTG RVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 31)· QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQALEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGR VTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 32)· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGR VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 33) · QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQARGQRLEWIGEISSGGSYPYYPDTVTGR VTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAVLYYDYDGDRIE(SEQ ID NO 34)· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 35)· EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVLYYDYDGDRIE(SEQ ID NO 36)· QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWIRQAPGKGLEffVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 37)· EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVGEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 38)· EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 39)· EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 40)· EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 41)· QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 42)· QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 43) · QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 44)· QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 45)· EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDVLYYDYDGDRIE(SEQ ID NO 46)· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 47)· EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSRYAMSWFRQAPGKGLEWVGEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 48)· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEYVSEISSGGSYPYYPDTVTGR FTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARVLYYDYDO)RIE(SEQ ID NO 49)或具有少于八個(gè)、七個(gè)、六個(gè)、五個(gè)、四個(gè)、三個(gè)、或兩個(gè)改變(如取代、插入或缺失，如保守取代或?qū)2D10中對(duì)應(yīng)位置的氨基酸殘基的取代)的序列。取代舉例在如下 Kabat 位置之一 2，4，6，25，36，37，39，47，48，93，94，103，104，106 和 107。所述取代可例如， 將P2D10的一或多個(gè)氨基酸取代到框架區(qū)(如人框架區(qū))的對(duì)應(yīng)位置。一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈框架(如分別的FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，或包含F(xiàn)Rl、FR2和FR3、但不包含CDR的序列)包括氨基酸序列，其與如下種系V區(qū)段序列之一的重鏈框架有至少 80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或更高的相同性DP_25，DP-I, DP-12，DP-9，DP-7， DP-31, DP-32, DP-33, DP-58，DP-54，其它 VH I 亞組(subgroup)種系序列，其它 VH III 亞組種系序列，或另一個(gè)V基因，該基因與規(guī)范結(jié)構(gòu)等級(jí)1-3 (見例如Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227799-817 ；Tomlinson et al. (1992)J. Mol. Biol. 227 :776_798)匹配 (compatible)。其它與規(guī)范結(jié)構(gòu)等級(jí)1_3匹配的框架包括具有按照Kabat編號(hào)的一或多個(gè)如下殘基的框架位置26的Ala，Gly, Thr或Val ；位置26的Gly ；位置27的Tyr，Phe或Gly ；位置 29 的 Phe, Val, Ile 或 Leu ；位置 34 的 Met, lie, Leu, Val, Thr, Trp 或 Ile ；位置 94 的 Arg, Thr，Ala, Lys ；位置 54 的 Gly, Ser，Asn 或 Asp ；和位置 71 的 Argo一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈框架(如分別的？附斤1 2，？1 3，或包含？1^1 2和？1 3、但不包含⑶R的序列)包括氨基酸序列，其與Vk II亞組種系序列或如下種系V區(qū)段序列之一的輕鏈框架有至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或更高的相同性:A17，Al，A18， A2,A19/A3,A23,Vk I亞組種系序列(如DPK9序列)，或另一個(gè)V基因，該基因與規(guī)范結(jié)構(gòu)等級(jí)4-1(見例如Tomlinson et al. (1995)EMBO J. 14 :4628)匹配。其它與規(guī)范結(jié)構(gòu)等級(jí) 4-1匹配的框架包括具有按照Kabat編號(hào)的一或多個(gè)如下殘基的框架位置2的Val，Leu或 Ile ；位置25的Ser或Pro ；位置27b的Ile或Leu ；位置四的Gly ；位置33的Phe或Leu ； 和位置71的Phe。另外，按照Kabat編號(hào)，位置48可以是Ile或Val。另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈框架(如分別的FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，或包含F(xiàn)Rl、FR2和FR3、 但不包含⑶R的序列)包含氨基酸序列，其與Vk I亞組種系序列(如DPK9序列)的輕鏈框架有至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或更高的相同性。一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈或重鏈可變區(qū)框架(如至少包含F(xiàn)R1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，任選包含 FR4的區(qū)域)可選自如下(a)輕鏈或重鏈可變區(qū)框架，其包含至少80%、90%、95%、或優(yōu)選100%的來(lái)自人輕鏈或重鏈可變區(qū)框架的氨基酸殘基，如來(lái)自人成熟抗體、人種系序列、 人共有序列、或本文所述人抗體的輕鏈或重鏈可變區(qū)框架殘基；(b)輕鏈或重鏈可變區(qū)框架，其包含20% -80%,40% -60%,60% -90%、或70% -95%的來(lái)自人輕鏈或重鏈可變區(qū)框架的氨基酸殘基，如來(lái)自人成熟抗體、人種系序列、人共有序列的輕鏈或重鏈可變區(qū)框架殘基；(c)非人框架(如嚙齒動(dòng)物框架)；或(d)已修飾過(guò)的非人框架，如用于除去免疫原性或細(xì)胞毒性決定簇，如脫敏的，或部分人源化的。一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)序列包括在一或多個(gè)如下位置的人殘基或人共有序列殘基(優(yōu)選至少五個(gè)、十個(gè)、十二個(gè)或所有)(在輕鏈可變區(qū)的 FR 中)4L，35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L 和 / 或(在重鏈可變區(qū)的 FR 中)2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H，45H，49H，58H，60H，67H，68H，69H，70H，73H，74H，75H，78H，91H，92H，93H 和 / 或 103H(按照Kabat編號(hào))。一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)非人⑶R，如鼠⑶R，如P2D10的⑶R，或其突變體，和至少一個(gè)框架，該框架與P2D10的框架有至少一個(gè)氨基酸，如至少5、8、10、12、 15或18個(gè)氨基酸不同。例如，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)這樣的非人CDR，并且在HC FRUHC FR2、HC FR3、LC FRULC FR2禾口 LC FR3的至少三個(gè)中有至少一
個(gè)氨基酸不同。一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列包含氨基酸序列，它與本文所述抗體(如P2D10、huP2D10-l或huP2D10-2)的可變區(qū)序列有至少80%，85%，90%， 95%，97%，98%，99%或更高的相同性；或者與本文所述抗體(如P2D10、huP2D10_l或 huP2D10-2)的可變區(qū)序列有至少1或5個(gè)殘基、但少于40、30、20、或10個(gè)殘基不同。一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)可變區(qū)中的一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)包含分別源自鼠抗體(如 P2D10)和人源化抗體(如56-8 !和K107)或種系序列的框架區(qū)氨基酸位置。例如，所述可變區(qū)包括一些與鼠抗體和人抗體(或種系序列)都相同的位置，因?yàn)楹髢煞N抗體在那個(gè)位置是相同的。剩余的那些在鼠抗體和人抗體中有不同的框架位置中，至少50、60、70、80或90%的可變區(qū)位置優(yōu)選與人抗體(或種系序列)相同，而不是與鼠抗體相同。這些剩余的框架位置無(wú)一、或至少有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)可以與鼠抗體相同，而不是與人抗體相同。 例如，HC FRl中的一個(gè)或兩個(gè)這些位置可以是鼠的；HC FR2中的一個(gè)或兩個(gè)這些位置可以是鼠的；FR3中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)這些位置可以是鼠的；LC FRl中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)這些位置可以是鼠的；LC FR2中的一個(gè)或兩個(gè)這些位置可以是鼠的；LC FR3中的一個(gè)或兩個(gè)這些位置可以是鼠的。一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列包含氨基酸序列，該氨基酸序列由本文所述核酸序列編碼，或由與本文所述核酸序列(例如具體的核酸序列或編碼本文所述氨基酸序列的核酸序列)或其互補(bǔ)鏈雜交的核酸編碼，所述雜交例如在低嚴(yán)謹(jǐn)度、中嚴(yán)謹(jǐn)度、高嚴(yán)謹(jǐn)度、或極高嚴(yán)謹(jǐn)度條件進(jìn)行?？筎WEAK抗體可以衍生或連接另一個(gè)功能分子，如另一個(gè)肽、蛋白質(zhì)或化合物。例如，所述抗體可以(如通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)締合或其它方式)功能性連接一或多個(gè)其它分子實(shí)體(entities)，如另一種抗體(如雙特異性或多特異性抗體)、毒素、放射性同位素、聚合物、細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑等。另一方面，本發(fā)明公開了組合物，如藥物組合物，其包含可藥用載體和抗TWEAK抗體，例如本文所述抗TWEAK抗體。另一實(shí)施方案中，將抗TWEAK抗體(如其藥物組合物)給予受試者，該受試者需要抗TWEAK抗體療法，或其狀況可被該抗體改善。例如，可以將抗TWEAK抗體給予受試者，該受試者已患有或有風(fēng)險(xiǎn)患有炎性疾病、免疫病、自身免疫病、神經(jīng)性疾病(neuronal disorder)、瘤形成性疾病(neoplastic disorder)或本文所述其它疾病。一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述抗TWEAK抗體用于制備治療炎性疾病、免疫病、自身免疫病、神經(jīng)性疾病、瘤形成性疾病或其它本文所述疾病的藥物。另一方面，本發(fā)明涉及治療受試者的TWEAK-相關(guān)性病癥的方法。所述方法包括 給予受試者足夠治療(如改善或預(yù)防)TWEAK-相關(guān)性病癥的量的抗TWEAK抗體?？梢詫⒖?TWEAK抗體單獨(dú)給予受試者，或與其它本文所述的治療性方式聯(lián)用。一個(gè)實(shí)施方案中，該受試者是哺乳動(dòng)物，如人，例如患有TWEAK-相關(guān)性病癥(如本文所述病癥)的人。所述抗體可用于改善這些病癥的一或多種癥狀。術(shù)語(yǔ)“治療”指以有效的量、方式和/或模式施用療法，來(lái)改善或預(yù)防與病癥(如本文所述病癥)有關(guān)的狀況、癥狀或參數(shù)，或預(yù)防病癥的發(fā)作、 進(jìn)展或惡化，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的程度或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言可檢測(cè)的程度。因此，治療可獲得治療性和/或預(yù)防性益處。有效的量、方式或模式可因受試者而異并可以為受試者定制(tailor)。一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述抗TWEAK抗體被用于制備治療TWEAK-相關(guān)性病癥的藥物。另一方面，本發(fā)明涉及調(diào)控TWEAK和TWEAK受體蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法。 例如，抗TWEAK抗體可用于降低或抑制TWEAK與TWEAK受體如而14結(jié)合。該方法包括使 TffEAK或含TWEAK的復(fù)合物與該抗體接觸。該方法可用于體外細(xì)胞，如培養(yǎng)的細(xì)胞，如體外或離體(ex vivo)培養(yǎng)的細(xì)胞。例如，表達(dá)TWEAK受體的細(xì)胞能夠在體外在培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 而且可以通過(guò)將抗TWEAK抗體加入培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)接觸步驟?；蛘?，該方法可以在存在于受試者中的細(xì)胞上進(jìn)行，如作為體內(nèi)(如治療性或預(yù)防性)方案的一部分。例如，抗TWEAK抗體可以局部或全身遞送。一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述抗TWEAK抗體用于制備調(diào)控TWEAK和
10TWEAK受體蛋白質(zhì)之間的相互作用的藥物。 該方法可包括在允許TWEAK與TWEAK受體復(fù)合物或其亞基相互作用的條件下，使 TffEAK與TWEAK受體復(fù)合物或其亞基接觸，從而形成TWEAK/TWEAK受體混合物。通常，可以以有效量提供抗TWEAK抗體，從而TWEAK/TWEAK受體混合物與抗TWEAK抗體的接觸會(huì)調(diào)控如干擾(如抑制、阻斷或降低)TWEAK和該受體蛋白質(zhì)之間的相互作用或TWEAK的至少一種功能，如TWEAK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。本發(fā)明公開還涉及包含核苷酸序列的核酸，其編碼抗TWEAK抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，如本文所述。例如，本發(fā)明涉及分別編碼P2D10的重鏈和輕鏈可變區(qū)的第一和第二核酸。另一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述核酸的宿主細(xì)胞和載體。本發(fā)明公開還涉及TWEAK (如人TWEAK)的表位，其被P2D10和能與所述表位相互作用的蛋白質(zhì)識(shí)別。例如，包含該表位的蛋白質(zhì)和肽可用于產(chǎn)生或篩選其它與所述表位相互作用的可結(jié)合化合物，例如蛋白質(zhì)如抗體或小分子。例如，包含該表位的肽可用作免疫原或篩選表達(dá)文庫(kù)的靶標(biāo)。也可以評(píng)價(jià)化合物與所述肽相互作用的能力，或通過(guò)確定圖譜 (mapping)或結(jié)構(gòu)，來(lái)評(píng)價(jià)化合物與所述表位(如在成熟TWEAK中)相互作用的能力。評(píng)價(jià)例如包含確定在存在競(jìng)爭(zhēng)性P2D10抗體時(shí)所述化合物是否能夠與TWEAK相互作用。本發(fā)明還公開了體內(nèi)將試劑，如藥物(包括遺傳試劑(genetic agent))或細(xì)胞毒劑與抗TWEAK抗體(如P2D10或其它本文所述的抗體)一起，遞送或靶向到表達(dá)TWEAK的細(xì)胞或結(jié)構(gòu)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及1.分離的蛋白質(zhì)，其包含重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，它們能形成與人 TffEAK結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中所述蛋白質(zhì)具有一或多種如下性質(zhì)(a)該蛋白質(zhì)與 P2D10、huP2D10-l 或 huP2D10_2 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人 TTOAK ；(b)該蛋白質(zhì)結(jié)合人TWEAK上與P2D10、huP2D10-l或huP2D10_2所結(jié)合的表位重疊的表位；(c)其重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列由在高嚴(yán)謹(jǐn)條件與編碼P2D10、 huP2D10-l或huP2D10-2的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸編碼；(d)其重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列與P2D10、huP2D10-l或huP2D10_2
的對(duì)應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列至少80%相同；(e)其重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列的多個(gè)⑶R區(qū)(總體上)與P2D10、 huP2D10-l或huP2D10-2的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的⑶R區(qū)至少95%相同；或(f)其框架區(qū)(總體上)與P2D10、huP2D10_l或huP2D10_2的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)至少95%相同。2.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中所述重鏈可變區(qū)序列的CDR區(qū)中包含如下的至少兩個(gè)序列GFTFSRYAMS(CDRl)(SEQ ID NO 1),EISSGGSYPYYPDTVTG(CDR2)(SEQ ID NO 2),VLYYDYDGDRIEVMDY(CDR3)(SEQ ID NO 3)。3.項(xiàng)1或2的蛋白質(zhì)，其中輕鏈可變區(qū)序列的⑶R區(qū)中包含如下的一或多個(gè)序列RSSQSLVSSKGNTYLH(CDRl)(SEQ ID NO 8),
KVSNRFS (CDR2) (SEQ ID NO :9)，禾口SQSTHFPRT(CDR3)(SEQ ID NO 10)。4.項(xiàng)2的蛋白質(zhì)，其中重鏈可變區(qū)序列包含如下的⑶R GFTFSRYAMS(CDRl)(SEQ ID NO 1),EISSGGSYPYYPDTVTG(CDR2)(SEQ ID NO 2),VLYYDYDGDRIEVMDY(CDR3)(SEQ ID NO 3)；且輕鏈可變區(qū)序列的⑶R區(qū)中包含如下的一或多個(gè)序列RSSQSLVSSKGNTYLH(CDRl)(SEQ ID NO 8),KVSNRFS (CDR2) (SEQ ID NO :9)，禾口SQSTHFPRT(CDR3)(SEQ ID NO :10)。5.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其為重組全長(zhǎng)IgG。6.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其包含人的Fc區(qū)。7.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其包含人的Fc區(qū)，帶有三個(gè)或更少的氨基酸取代。8.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其為Fab或ScFv09.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其包含與人種系框架區(qū)至少90%相同的框架區(qū)。10.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中輕鏈可變區(qū)序列的多個(gè)框架區(qū)總體上與VK 1亞組種系序列中的相應(yīng)序列至少95 %相同。11.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中重鏈可變區(qū)序列的多個(gè)框架區(qū)總體上與DPM種系序列至少95%相同。12.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中輕鏈可變區(qū)序列的多個(gè)框架區(qū)總共與DPK9種系序列中的相應(yīng)序列至少95%相同。13.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中重鏈可變區(qū)序列的多個(gè)框架區(qū)總體上與VH I亞組種系序列中的相應(yīng)序列至少95 %相同。14.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其包含與P2D10、huP2D10_l或huP2D10_2具有相同規(guī)范結(jié)構(gòu)
的高變環(huán)。15.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中重鏈可變區(qū)序列包含與SEQ ID NO :65至少95%相同的序列。16.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中重鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :65。17.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO :67或69至少95%相同的序列。18.項(xiàng)1或15的蛋白質(zhì)，其中輕鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :67或69。19.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中重鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :27-49中的任一個(gè)或與其至少95%相同的序列。20.項(xiàng)1的蛋白質(zhì)，其中輕鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO :17-26中的任一個(gè)或與其至少95%相同的序列。21.藥物組合物，其包含前述項(xiàng)任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和可藥用載體。22.提供抗體的方法，該方法包括提供含有重組核酸序列的宿主細(xì)胞，所述序列用于表達(dá)包含重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是項(xiàng)1的蛋白質(zhì)；以及
12
在使所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下維持所述細(xì)胞。23.項(xiàng)22的方法，其還包括分離所述蛋白質(zhì)并將所述蛋白質(zhì)與可藥用載體配成制劑。24.治療受試者的自身免疫病的方法，該方法包括給予該受試者治療自身免疫病有效量的項(xiàng)21的藥物組合物。25.治療受試者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括給予該受試者治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效量的項(xiàng)21的藥物組合物。26.治療受試者的多發(fā)性硬化的方法，該方法包括給予該受試者治療多發(fā)性硬化有效量的項(xiàng)21的藥物組合物。27.治療受試者的中風(fēng)的方法，該方法包括給予該受試者治療中風(fēng)有效量的項(xiàng)21的藥物組合物。28.治療受試者的癌癥的方法，該方法包括給予該受試者治療癌癥有效量的項(xiàng)21的藥物組合物。29.項(xiàng)觀的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。***本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指蛋白質(zhì)，其包含至少一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)，如提供免疫球蛋白可變區(qū)或免疫球蛋白可變區(qū)序列的氨基酸序列。例如，抗體可包含重鏈(H)可變區(qū)(本文縮寫為VH)，和輕鏈(L)可變區(qū)(本文縮寫為VL)。在另一個(gè)例子中，抗體包含兩個(gè)重鏈(H)可變區(qū)和兩個(gè)輕鏈(L)可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“抗體”包含抗體的抗原結(jié)合片段(例如單鏈抗體、Fab片段、F(ab' )2片段、Fd片段、Fv片段、和dAb片段)以及全長(zhǎng)抗體，如全長(zhǎng)的IgA，IgG(如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)，IgE，IgD，IgM(及其亞型)類型的免疫球蛋白。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”指被加工去除了任何信號(hào)序列的具有天然抗體至少96%長(zhǎng)度的抗體。全長(zhǎng)抗體能夠包含天然抗體的全長(zhǎng)，如天然抗體(如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)從氨基末端殘基到羧基末端殘基的殘基?！懊庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)序列”指形成免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。例如，所述序列可以包括所有或部分的天然存在的可變區(qū)的氨基酸序列。例如，所述序列可以包含或不包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)N-或C-末端氨基酸，或可以包含其它與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成匹配的改變?！胺蛛x的組合物”指從含有該組合物的天然樣本至少一種組分的至少90%取出的組合物。人工制備的或天然的組合物可以是“至少”具有某種純度的“組合物”，如果所需的種類或種類群基于重量比(weight-weight basis)是至少5，10，25，50，75，80，90，95，98或 99%純的?！氨砦弧敝缚贵w所結(jié)合的靶化合物上的位點(diǎn)。當(dāng)靶化合物是蛋白質(zhì)時(shí)，例如，表位可指抗體所結(jié)合的氨基酸(具體為氨基酸側(cè)鏈)。重疊表位包含至少一個(gè)共同的氨基酸殘基， 如至少2，3，4或5個(gè)共同的氨基酸殘基。本文所用的術(shù)語(yǔ)“在低嚴(yán)謹(jǐn)度、中嚴(yán)謹(jǐn)度、高嚴(yán)謹(jǐn)度、或極高嚴(yán)謹(jǐn)度條件雜交”描述了雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可見于CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6。此文獻(xiàn)中描述了水相和非水相方法，任一種都可用。本文的具體雜交條件如下1)低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C雜交，之后在0. 2X SSC, 0. 1 % SDS中至少在50°C (對(duì)于低嚴(yán)謹(jǐn)度條件，洗滌的溫度應(yīng)升高到洗滌兩次；幻中嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件是在6X SSC中在約45°C雜交，之后在0. 2X SSC, 0. SDS中在60°C洗滌一或多次；幻高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件是在6X SSC 中在約45°C雜交，之后在0. 2X SSC，0. SDS中在65°C洗滌一或多次；并且優(yōu)選4)極高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件是在0. 5M磷酸鈉，7% SDS中在65°C雜交，之后在0. 2X SSC, 1 % SDS中在 65°C洗滌一或多次。高嚴(yán)謹(jǐn)度條件C3)是優(yōu)選的，除特別指出之外應(yīng)使用該條件。"TWEAK-相關(guān)疾病”是由TWEAK引起或因給予TWEAK阻斷劑而改變其狀況、癥狀或發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的任何疾病。除非另外指出，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義。如下描述了合適的方法和材料，但在本文所述的實(shí)踐或試驗(yàn)中也可以使用與本文所述的類似或等同的方法和材料。另外，本發(fā)明關(guān)于Chothia CDR所述的實(shí)施方案也可用Kabat⑶R實(shí)現(xiàn)。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和本文所述的其它參考文獻(xiàn)都全文引入本文作為參考。如有矛盾，以本發(fā)明說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例僅用于舉例并不應(yīng)起限制作用。

發(fā)明內(nèi)容
P2D10是舉例的鼠抗體，其特異性結(jié)合人TWEAK并抑制TWEAK功能。也公開了 P2D10抗體的變體，包括舉例的人源化變體。這些抗體、其它抗TWEAK抗體、及其它TWEAK阻斷劑可用于治療或預(yù)防TWEAK-介導(dǎo)的疾病，如炎性疾病及其它本文公開的疾病?？筎WEAK 抗體本文的公開包括具體舉例的抗TWEAK抗體如P2D10、huP2D10_l、和huP2D10_2的序列?？衫?，通過(guò)制備并表達(dá)編碼所述(recited)氨基酸序列的合成基因，或者通過(guò)突變?nèi)朔N系基因來(lái)提供編碼所述氨基酸序列的基因，從而制備具體抗體如上述這些抗體。進(jìn)一步地，這些抗體及其它抗TWEAK抗體可例如用一或多種以下方法來(lái)制備?，F(xiàn)有多種獲得抗體，尤其人抗體的方法。一種舉例的方法包括篩選蛋白質(zhì)表達(dá)文庫(kù)，例如噬菌體或核糖體展示文庫(kù)。對(duì)噬菌體展示的描述見例如美國(guó)5，223，409 ； Smith(1985)Science 228 :1315-1317 ；WO 92/18619 ；W091/17271 ；WO 92/20791 ；WO 92/15679 ；WO 93/01288 ；WO 92/01047 ；W092/09690 ；和 WO 90/02809o 對(duì) Fab 在噬菌體上展示的描述見例如美國(guó)專利5，658，727 ；5, 667，988 ；和5，885，793。除了應(yīng)用展示文庫(kù)，其它方法也可用于獲得結(jié)合TWEAK的抗體。例如，可以用 TWEAK蛋白質(zhì)或其肽作為非人動(dòng)物如嚙齒類動(dòng)物如小鼠、倉(cāng)鼠或大鼠的抗原。一個(gè)實(shí)施方案中，非人動(dòng)物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可以用人Ig基因座的大片段改造有小鼠抗體生成的缺陷的小鼠品系。用雜交瘤技術(shù)，可以制備并選擇具有所需特異性的由所述基因衍生的抗原特異性單克隆抗體。參見例如XEN0M0USE ， Green et al. (1994)Nature Genetics7 :13-21, U. S. 2003-0070185, WO 96/34096，和 WO 96/33735。另一個(gè)實(shí)施方案中，從非人動(dòng)物獲得單克隆抗體，然后進(jìn)行修飾，如人源化或脫敏。Winter描述了舉例的可用于制備本文所述人源化抗體的CDR-移植方法
14(U. S. 5，225，539)。具體人抗體的所有或一些⑶R可以用非人抗體的至少部分來(lái)置換?？赡軆H需要置換結(jié)合所需的CDR或這些CDR的結(jié)合決定簇，來(lái)獲得結(jié)合TWEAK的有效人源化抗體。人源化抗體可以通過(guò)用來(lái)自人Fv可變區(qū)的等效序列置換不直接參與抗原結(jié)合的 Fv可變區(qū)序列來(lái)制備。制備人源化抗體的常用方法見Morrison，S. L. (1985) Science 229 1202-1207，Oi et al. (1986)BioTechniques 4 :214，和 US5, 585，089 ;US 5, 693, 761 ；US 5，693，762 ；US 5，859，205 ；和 US 6，407，213。那些方法包括分離、操作(manipulate)和表達(dá)核酸序列，該序列編碼來(lái)自至少一條重鏈或輕鏈的所有或部分的免疫球蛋白Fv可變區(qū)。 這些核酸的來(lái)源是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且例如，可以從產(chǎn)生抗預(yù)定靶的抗體的雜交瘤(如上述)，從種系免疫球蛋白基因，或從合成的構(gòu)建體獲得。然后將編碼人源化抗體的重組DNA克隆到合適的表達(dá)載體中。人種系序列，例如，公開在iTomlinson, I. A.et al. (1992) J. Mol. Biol. 227 776-798 ；Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16 :237-242 ；Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio. 227 :799-817 ；和 iTomlinson et al. (1995)EMBO J14 :4628-4638 中。V BASE 目錄提供了人免疫球蛋白可變區(qū)序列的全面目錄(TomlinSon，I.A. et al.編輯的MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)。這些序列也可用作人序列(如框架區(qū)和CDR) 的來(lái)源。例如美國(guó)專利6，300，064所述，也可使用共有人框架區(qū)。也可以通過(guò)具體缺失人T細(xì)胞表位或用WO 98/5四76和WO 00/34317公開的方法“脫敏”，來(lái)修飾非人的結(jié)合TWEAK的抗體，簡(jiǎn)而言之，可以分析抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)中結(jié)合MHC II類的肽；這些肽代表潛在的T-細(xì)胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317 所限定)。為了檢測(cè)潛在的T-細(xì)胞表位，可以應(yīng)用稱為“肽聯(lián)系(threading)”的計(jì)算機(jī)建模方法，另外可以在人MHCII類結(jié)合肽的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索在Vh和\序列中存在的基序，如WO 98/5四76和WO 00/34317所述。這些基序結(jié)合18個(gè)主要MHC II類DR同種異型(allotype) 中的任一個(gè)，由此構(gòu)建潛在的T細(xì)胞表位?？梢酝ㄟ^(guò)取代可變區(qū)中的少量氨基酸殘基，或優(yōu)選通過(guò)多個(gè)單氨基酸取代，去除所檢測(cè)的潛在T-細(xì)胞表位。盡可能地進(jìn)行保守取代。通常， 但不是絕對(duì)地，可以使用在人種系抗體序列的位置常見的氨基酸。在確定了脫敏性改變后， 通過(guò)誘變或其它合成方法(如從頭合成，盒式置換等)構(gòu)建編碼Vh和\的核酸。誘變后的可變區(qū)序列可任選與人的恒定區(qū)，如人IgGl或κ恒定區(qū)融合。在一些情況下，潛在的T細(xì)胞表位可包括已知或據(jù)預(yù)測(cè)對(duì)抗體功能重要的殘基。 例如，潛在的T細(xì)胞表位通常偏向(biased)⑶R。另外，潛在的T細(xì)胞表位可出現(xiàn)在對(duì)于抗體結(jié)構(gòu)和結(jié)合重要的框架殘基上。導(dǎo)致去除這些潛在表位的那些改變有時(shí)需要更多檢查 (scrutiny)，如通過(guò)制備并測(cè)試有無(wú)此改變的鏈來(lái)檢查。如果可以，與⑶R重疊的潛在T細(xì)胞表位可以通過(guò)CDR區(qū)域外的取代來(lái)除去。有時(shí)，CDR區(qū)域內(nèi)的改變是唯一選擇，因此可以測(cè)試有無(wú)此取代的變體。其它時(shí)候，去除潛在T細(xì)胞表位所需的取代是位于框架內(nèi)可能對(duì)抗體結(jié)合關(guān)鍵的殘基位置上。此時(shí)，測(cè)試有無(wú)此取代的變體。因此，有時(shí)設(shè)計(jì)多種用不同方式脫敏的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并測(cè)試多種重鏈/輕鏈組合，來(lái)鑒定最佳脫敏抗體。然后，通過(guò)考慮不同變體的結(jié)合親和力及脫敏程度，尤其可變區(qū)中仍存在的潛在T細(xì)胞表位數(shù)，來(lái)選擇最終的脫敏抗體?？捎妹撁粜揎椚魏慰贵w，如包含非人序列的抗體，如合成抗體、鼠抗體、其它非人單克隆抗體，或從展示文庫(kù)分離的抗體。
也可使用其它人源化抗體的方法。例如，其它方法可以依賴于抗體的三維結(jié)構(gòu)，在結(jié)合決定簇的三維結(jié)構(gòu)附近的框架位置，以及免疫原性肽序列。參見例如WO 90/07861 ；美國(guó)專利 5，693，762 ;5，693，761 ;5，585，089 ;5，530，101 ；和 6，407，213 ； Tempest et al. (1991)Biotechnology 9:266-271。還有另一種方法稱為“人源化改造 (humaneering)，，，對(duì)其的描述見例如 U. S. 2005-008625。所述抗體可包含人Fc區(qū)，如野生型區(qū)或包含一或多個(gè)改變的Fc區(qū)。一個(gè)實(shí)施方案中，改變?nèi)缤蛔兒愣▍^(qū)以修飾所述抗體的性質(zhì)(如提高或降低如下的一或多個(gè)Fc 受體結(jié)合，抗體糖基化，半胱氨酸殘基數(shù)目，效應(yīng)細(xì)胞功能，或補(bǔ)體功能)。例如，人IgGl恒定區(qū)可在一或多個(gè)殘基，如殘基234和237之一或多個(gè)發(fā)生突變?？贵w可在重鏈CH2區(qū)有突變，所述突變降低或改變效應(yīng)功能，如Fc受體結(jié)合和補(bǔ)體活化。例如，抗體可有美國(guó)專利5，624，821和5，648，260所述的突變。抗體也可有穩(wěn)定免疫球蛋白兩條重鏈之間二硫鍵的突變，如IgG4鉸鏈區(qū)中的突變，這在本領(lǐng)域已經(jīng)公開(如Angal et al. (1993)Mol. Immunol. 30 :105-08)。也見例如 U. S. 2005-0037000。親和力成熟。一個(gè)實(shí)施方案中，例如通過(guò)誘變修飾抗TWEAK抗體，來(lái)提供經(jīng)修飾的抗體的庫(kù)(pool)。然后評(píng)價(jià)這項(xiàng)經(jīng)修飾的抗體，來(lái)鑒定功能性特征發(fā)生改變(如結(jié)合提高，穩(wěn)定性提高，抗原性降低或體內(nèi)穩(wěn)定性提高)的一或多種抗體。一個(gè)方案 (implementation)中，用展示文庫(kù)技術(shù)來(lái)選擇或篩選經(jīng)修飾的抗體的庫(kù)。然后，例如通過(guò)使用較高的嚴(yán)謹(jǐn)度或更有競(jìng)爭(zhēng)力的結(jié)合和洗滌條件從第二文庫(kù)中鑒定出具有較高親和力的抗體。也可使用其它篩選技術(shù)?！┓桨钢?，所述誘變靶向那些已知或很有可能位于結(jié)合界面的區(qū)域。例如，如果所鑒定的結(jié)合蛋白質(zhì)是抗體，那么誘變可以針對(duì)本文所述重鏈或輕鏈的CDR區(qū)。進(jìn)一步地， 誘變可以針對(duì)鄰近或鄰接⑶R的框架區(qū)，如特別是在與⑶R相距(junction) 10、5或3個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)的框架區(qū)。對(duì)于抗體，誘變也可限于一或數(shù)個(gè)CDR，如進(jìn)行逐步改進(jìn)。一個(gè)實(shí)施方案中，用誘變來(lái)使抗體更類似一或多個(gè)種系序列。一種舉例的種系化方法包括鑒定與所述分離的抗體的序列類似(具體數(shù)據(jù)庫(kù)中最類似)的一或多個(gè)種系序列。然后在該分離的抗體中以增加方式(incrementally)、組合方式或兩種方式一起(在氨基酸水平)進(jìn)行突變。例如，制備核酸文庫(kù)，使其包含編碼一部分或所有可能的種系突變的序列。然后評(píng)估被突變的抗體，從而例如鑒定相比于分離的抗體具有一或多個(gè)其它種系殘基、且仍有效(如具有功能許不敢活性)的抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，向分離的抗體中引入盡可能多的種系殘基。一個(gè)實(shí)施方案中，用誘變將一或多個(gè)種系殘基取代或插入到CDR區(qū)中。例如，種系 CDR殘基可以來(lái)自與被修飾的可變區(qū)類似(如最類似)的種系序列。誘變后，可以評(píng)估所述抗體的活性(結(jié)合或其它功能活性)，來(lái)確定所述一或多個(gè)種系殘基是否被耐受。在框架區(qū)可進(jìn)行類似誘變?？梢砸圆煌绞竭x擇種系序列。例如，選擇符合預(yù)定的可選性或相似性標(biāo)準(zhǔn)的種系序列，所述標(biāo)準(zhǔn)為，例如與供體非人抗體相比有至少某個(gè)百分比的同一性，如至少75，80， 85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或 99. 5% 的同一性?？捎弥辽?2，3，5，或 10 個(gè)種系序列進(jìn)行選擇。對(duì)于CDRl和CDR2，鑒定相似的種系序列包括選擇一個(gè)這樣的序列。對(duì)于 CDR3，鑒定相似的種系序列包括選擇一個(gè)這樣的序列，但也可包括使用兩個(gè)分別構(gòu)成氨基末端部分和羧基末端部分的種系序列。其它方案中，使用超過(guò)一個(gè)或兩個(gè)種系序列，從而例如形成共有序列。其它實(shí)施方案中，可修飾所述抗體，使之具有改變的糖基化模式(即從原來(lái)的或天然的糖基化模式發(fā)生改變)。本文中的“改變”指缺失了一或多個(gè)碳水化合物部分和/或?qū)⒁换蚨鄠€(gè)糖基化位點(diǎn)添加到原來(lái)的抗體中。將糖基化位點(diǎn)加入迄今公開的抗體中可通過(guò)改變氨基酸序列、使其包含糖基化位點(diǎn)共有序列而實(shí)現(xiàn)；這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。其它增加抗體上的碳水化合物部分?jǐn)?shù)目的方法是通過(guò)化學(xué)方法或酶促方法將糖苷與抗體的氨基酸殘基偶聯(lián)。對(duì)這些方法的描述見WO 87/05330和Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22 :259_306?？梢匀绫绢I(lǐng)域所述通過(guò)化學(xué)方法或酶促方法去除在抗體上存在的任何碳水化合物部分(Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259 52 ；Edge et al. (1981)Anal. Biochem. 118 :131 ；禾口 Thotakura et al. (1987)Meth. Enzymol. 138 350)。美國(guó)專利5，869，046介紹了一種修飾，其通過(guò)提供拯救受體結(jié)合表位來(lái)延長(zhǎng)體內(nèi)半壽期。一個(gè)實(shí)施方案中，抗體具有與P2D10的CDR序列非實(shí)質(zhì)區(qū)別的CDR序列。非實(shí)質(zhì)區(qū)別包括次要氨基酸改變，如⑶R，如Chothia或Kabat⑶R序列中任何通常的5_7個(gè)氨基酸中有1或2個(gè)被取代。通常氨基酸被具有相似電荷、疏水性或立體化學(xué)特征的相關(guān)氨基酸取代。這些取代在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員了解的范圍內(nèi)。與CDR中不同，可以在結(jié)構(gòu)框架區(qū)(FR) 進(jìn)行更為實(shí)質(zhì)許不敢的改變而不會(huì)負(fù)面影響抗體的結(jié)合性質(zhì)。對(duì)FR的改變包括但不限于， 人源化非人衍生的框架或改造那些對(duì)抗原接觸或穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)重要的框架殘基，如改變恒定區(qū)的類或亞類，改變那些可能改變效應(yīng)功能如Fc受體結(jié)合功能的具體氨基酸殘基(Limd et al. (1991) J. Immun. 147 :2657-62 ；Morgan et al. (1995) Immunology 86 :319-24),或改變?cè)摵愣▍^(qū)的來(lái)源物種?？筎WEAK抗體可以是全長(zhǎng)抗體形式，或是抗體片段形式，如Fab，F(xiàn)(ab' )2，F(xiàn)d, dAb 和scFv片段。其它片段包括包含單個(gè)可變區(qū)的蛋白質(zhì)，如camel或camelized domain。參見例如 U. S. 2005-0079574 和 Davies et al. (1996) Protein Eng. 9 (6) :531-7?？贵w制備。可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞中制備一些抗體如Fab。也可以在真核細(xì)胞中制備抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，抗體(如scFv)在畢赤酵母(Pichia)(參見，例如 Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251 123-35)、漢遜酵母(Hanseula)或糖酵母 (Saccharomyces)等酵母細(xì)胞中表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。表達(dá)抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞例如包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括dhfr-CHO細(xì)胞，見tolauband Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,使用 DHFR 選擇標(biāo)記，例如見 Kaufman and Sharp (1982)Mol. Biol. 159 :601-621)、淋巴細(xì)胞系例如NSO骨髓瘤細(xì)胞和SP2細(xì)胞、COS細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞。重組表達(dá)載體除了攜帶編碼多樣化免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的核酸序列，還可以攜帶其它序列，如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中的載體復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于選出引入了所述載體的宿主細(xì)胞(參見，例如美國(guó)專利4，399，216， 4，634，665和5，179，017)。例如，通常選擇性標(biāo)記基因賦予已經(jīng)引入載體的宿主細(xì)胞對(duì)藥物，如G418、潮霉素或甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性。
17
在一例抗體表達(dá)系統(tǒng)中，將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達(dá)載體通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染引入dhfr-CHO細(xì)胞。在該重組表達(dá)載體內(nèi)，所述抗體的重鏈和輕鏈基因各自與增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件(如源自SV40、CMV、腺病毒等，諸如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件)可操作連接，來(lái)驅(qū)動(dòng)所述基因的高水平轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體也攜帶DHFR基因，其允許通過(guò)甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增來(lái)選出轉(zhuǎn)染了所述載體的CHO細(xì)胞。對(duì)選出的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之表達(dá)抗體重鏈和輕鏈，并從培養(yǎng)基中回收所述抗體。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，選出轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基回收所述抗體。例如，可以利用蛋白A或蛋白G偶聯(lián)基質(zhì)通過(guò)親和層析分離一些抗體。對(duì)于一些含F(xiàn)c區(qū)的抗體，抗體制備系統(tǒng)優(yōu)選合成含糖基化Fc區(qū)的抗體。例如，IgG分子的Fc區(qū)在CH2區(qū)的天冬酰胺297處糖基化。該天冬酰胺是用雙觸角型寡糖 (biantennary-type oligosaccharide)進(jìn)行修飾的位置。已證實(shí)，這種糖基化是Fc γ受體和補(bǔ)體Clq介導(dǎo)的效應(yīng)功能所必需的(Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51 :1-84 ； Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163 :59-76)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c 區(qū)可以在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，從而使對(duì)應(yīng)于天冬酰胺297的殘基適當(dāng)糖基化。所述抗體的Fc區(qū)或其它區(qū)域也可包括其它真核翻譯后修飾?？贵w也可以由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生。例如，美國(guó)專利5，849，992描述了在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)抗體的方法。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，使其含有乳特異性啟動(dòng)子、編碼目標(biāo)抗體的核酸序列、以及用于分泌的信號(hào)序列。由這類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中的雌性動(dòng)物產(chǎn)出的乳汁含有分泌至其中的目標(biāo)抗體。所述抗體可以從乳汁中純化，或在一些情況下直接使用?？贵w的結(jié)合特性可以用任何標(biāo)準(zhǔn)方法如下述方法之一來(lái)測(cè)量BIAC0RE 分析，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，X線晶體成像技術(shù)，序列分析和掃描誘變?？梢栽隗w外或在患如本文所述疾病的動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)抑制TWEAK的一或多種活性的能力。優(yōu)選地，所述抗體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的效果，這表明所述抗體抑制TWEAK的一或多種活性。一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)抗體對(duì)TWEAK刺激皮膚成纖維細(xì)胞中IL-8、MMP-U PGE2、 IL-6、IP-10和RANTES生成的能力的抑制。合適的實(shí)驗(yàn)條件參見Chich印ortiche et al. (200 Arthritis Res. 4(2) :126_133。另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)抗體抑制TWEAK刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。見例如 U. S. 2003-0211993，其描述了如下進(jìn)行的增殖試驗(yàn)(及其它可用的實(shí)驗(yàn))將HVEC接種在 96孔微滴板中達(dá)到亞匯合(subconfluence) (4000細(xì)胞/孔)，并在不加供應(yīng)商的生長(zhǎng)補(bǔ)充物(supplier growth supplement)的CS-C培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基或基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)基中含或不含TWEAK(100ng/ml)， bFGF(l/500 至 1/1000 稀釋的 bFGF 生長(zhǎng)補(bǔ)充物(Clonetics)或 lng/ml (R&D Systems)), VEGF(10ng/ml)或這些因子的組合。在指定情況下，也加入10 μ g/ml的被測(cè)抗體或?qū)φ湛贵w。細(xì)胞在37°C、5% CO2溫育3天，用3H-胸苷脈沖最后10小時(shí)的培養(yǎng)物來(lái)測(cè)量增殖。 用 BETAPLATE (EG&G ffallac, Gaithersburg, Md.)測(cè)量結(jié)合細(xì)胞的放射性。由 TTOAK 或由 TffEAK與bFGF組合介導(dǎo)的增殖下降表明，所述抗體有效阻斷TWEAK活性。
表面等離子體共振(SPR)。目標(biāo)蛋白質(zhì)與靶(如TWEAK)的結(jié)合相互作用可用SI3R 分析。sra或生物分子相互作用分析(BIA)實(shí)時(shí)檢測(cè)生物特異性相互作用，而無(wú)需標(biāo)記任何相互作用物(interactant)。在BIA芯片結(jié)合表面的質(zhì)量改變(指示發(fā)生了結(jié)合)導(dǎo)致鄰近表面的光折射率的改變(表面等離子體共振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)。折射率的改變產(chǎn)生了可檢測(cè)信號(hào)，測(cè)定該信號(hào)作為生物分子之間的實(shí)時(shí)反應(yīng)的指標(biāo)。對(duì)使用SPR的方法的描述見例如美國(guó)專利 5，641，640 ;I aether (198 Surface Plasmons Springer Verlag ； Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63 :2338-2345 ；Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5 :699-705 禾口 BIAcore International AB (Uppsala, Sweden)提供的網(wǎng)上資源。來(lái)自SPR的信息可用于提供對(duì)生物分子與靶結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括K。n和K。ff的準(zhǔn)確定量測(cè)量?？梢杂肂IAcore層析技術(shù)通過(guò)評(píng)估不同抗體彼此競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TWEAK(如人TWEAK， 尤其可溶性人TWEAK)的能力來(lái)直接定位表位，所述技術(shù)參見Wiarmacia BIAtechnology Handbook，" Epitope Mapping" ,Section 6. 3. 2, (Mayl994)；也參見 Johne et al. (1993) J. Immunol. Methods, 160 :191_198。在例如Western印跡和免疫沉淀試驗(yàn)中評(píng)價(jià)抗體的其它一般指導(dǎo)可參見 Antibodies :A Laboratory Manual, ed. by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor press (1988))。TffEAK-相關(guān)疾病抗TWEAK抗體(例如本文所述抗體)可用于治療多種病癥，如TWEAK-相關(guān)性疾病。 例如，所述抗體可用于治療患者的炎性、免疫性或自身免疫性疾病，以及瘤形成疾病。炎性 TWEAK-相關(guān)疾病的例子包括，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis)，強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，炎性腸病(inflammatory bowel disease)(包括饋瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)和克隆病(Crohn's disease))，銀屑病(psoriasis) 或炎性肌炎(inflammatory myositis)?？芍委煹难仔约膊〉钠渌影ǎ筛駶h斯細(xì)胞(Langerhans-cell)的組織細(xì)胞增多癥(histiocytosis)，成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome)/ 1 塞 j"生細(xì)支氣管炎(bronchiolitis obliterans), 韋格納肉芽月中病(Wegener ‘ s granulomatosis),脈管炎(vasculitis),惡病質(zhì) (cachexia), 口炎(stomatitis),特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis),皮肌炎(dermatomyositis)或多肌炎(polymyositis),非傳染性鞏膜炎(non-infectious scleritis)，牽累肺的慢性結(jié)節(jié)病(chronic sarcoidosis with pulmonary involvement), 脊髓增生異常綜合征/有過(guò)多的未成熟細(xì)胞的難治性貧血(myelodysplastic syndrome/ refractory anemia with excess blasts)，潰瘍性結(jié)腸炎，中度到重度的慢性阻塞性肺病和巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(giant cell arteritis)。可以給有風(fēng)險(xiǎn)、已確診、或患有這些疾病之一的受試者施用抗TWEAK抗體，其用量和施用時(shí)間導(dǎo)致提供總體(overall)治療效果?？筎WEAK抗體可以單獨(dú)施用或與其它藥劑聯(lián)用。例如，USSN 60/679，518描述了聯(lián)用TWEAK阻斷劑與TNF-α阻斷劑的方法。在組合療法的情況中，施用的量和時(shí)間可以提供，例如協(xié)同治療效果。進(jìn)一步地，可以將施用 TWEAK阻斷劑(有或無(wú)第二種藥劑)作為初步(primary)治療，例如一線治療(first line treatment)，或作為第二步(secondary)治療，例如在受試者對(duì)之前施用的療法(即除了用 TffEAK阻斷劑的療法之外的療法)反應(yīng)不足的情況下。
類風(fēng)濕件關(guān)節(jié)炎(RA)抗TWEAK抗體(如本文所述抗體)可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(“RA")是導(dǎo)致要見于關(guān)節(jié)的痛、腫(swelling)、僵硬(stiffness)和功能喪失的慢性炎性疾病。RA常始于滑膜，即圍繞關(guān)節(jié)產(chǎn)生保護(hù)性囊的膜。在很多患RA的個(gè)體中，白細(xì)胞從循環(huán)浸潤(rùn)到滑膜造成持續(xù)的異常炎癥(如滑膜炎(synovitis))。因此，滑膜發(fā)炎，引起發(fā)熱(warmth)、紅、腫和痛。軟骨中的膠原蛋白(collagen)逐漸被破壞，使關(guān)節(jié)腔變窄，并最終破壞骨。炎癥導(dǎo)致病變區(qū)的侵蝕性骨破壞。在這個(gè)階段，滑膜的細(xì)胞異常地生長(zhǎng)分裂，使正常的薄滑膜變厚，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)觸之腫脹且浮腫(puffy)。隨RA進(jìn)展，異常的滑膜細(xì)胞侵入并破壞關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨和骨。支持并穩(wěn)定關(guān)節(jié)的周圍肌肉、韌帶和肌腱(tendon)可變?nèi)?，不能正常工作。RA也可引起更廣泛的骨流失(loss)， 這可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(osteoporosis)，使骨變脆和更易折斷。所有這些作用都導(dǎo)致與RA有關(guān)的痛、損害(impairment)和變形(deformities)。會(huì)受影響的區(qū)域包括腕、指節(jié)(knuckle)、 膝和足跖球(the ball of the foot)。通常，多個(gè)關(guān)節(jié)可受牽涉，甚至脊柱(spine)都可受累。在約25%患RA的人中，小血管的炎癥可在皮下引起類風(fēng)濕小結(jié)，或腫塊(lump)，它們常形成于緊靠關(guān)節(jié)處。隨疾病進(jìn)展，還可積液，尤其是在踝(ankle)。很多患RA的患者也發(fā)生貧血，或紅細(xì)胞正常數(shù)目降低。RA包括多種疾病亞型，如費(fèi)爾蒂綜合征(Felty' s syndrome)，血清陰性的RA，〃 經(jīng)典(classical) “ RA，進(jìn)展性和/或復(fù)發(fā)性RA，和伴有脈管炎的RA。一些專家將此病分為1型和2型。1型較不常見，最多持續(xù)數(shù)月，不留下永久殘疾。2型是慢性的，持續(xù)數(shù)年， 有些例子中持續(xù)終生。RA也能表現(xiàn)為皮下類風(fēng)濕小結(jié)，內(nèi)臟結(jié)節(jié)(visceral nodule)，脈管炎導(dǎo)致的腿潰瘍或多發(fā)性單神經(jīng)炎(mononeuritis multiplex)，胸腔或心包積液(pleural or pericardial effusions)，淋巴結(jié)病(Iymphadenopathy)，費(fèi)爾蒂綜合征，干燥綜合征 (Sjogren' ssyndrome)和鞏膜外層炎(印iscleritis)。這些疾病亞型以及顯示一或多種上述癥狀的受試者可用本文所述抗體來(lái)治療。RA可用多種臨床衡量標(biāo)準(zhǔn)(measure)來(lái)評(píng)價(jià)。一些指標(biāo)(indicia)舉例包括總 Siarp得分(TSS)，Siarp侵蝕得分，及HAQ殘疾指數(shù)(index)。本文的方法可用于改進(jìn)這些指標(biāo)的至少一項(xiàng)。用于治療RA的抗TWEAK抗體的治療性能可以在動(dòng)物模型上評(píng)估，如用小鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(mCIA)模型(參見例如Stuart et al.，J. Clin. Invest. 69 673-683(1982)。多發(fā)性硬化抗TWEAK抗體(如本文所述抗體)可用于治療多發(fā)性硬化(MS)及相關(guān)疾病。MS 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征為炎癥和脫髓鞘(loss of myelin sheath) 0MS患者可用診斷臨床確診的(Clefinite)MS的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定，該標(biāo)準(zhǔn)是由診斷MS的工作室(workshop)確立的(Poser et al.，Ann. Neurol. (1983) 13 :227)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，患臨床確診的MS的個(gè)體已有兩次發(fā)病(attack)，并有任何(either)兩種損害(lesion)的臨床實(shí)證(clinical evidence)，或一種損害的臨床實(shí)證以及另一種損害的能產(chǎn)生臨床癥狀體征的解剖或生化異常(paraclinical)的實(shí)證。確診的MS也可以用兩次發(fā)病的實(shí)證、腦脊液中IgG的寡克隆(oligoclonal)帶，或發(fā)病、兩種損害的臨床實(shí)證及腦脊液中IgG的寡克隆帶的組合來(lái)診斷。
對(duì)多發(fā)性硬化的有效治療可用多種不同方式來(lái)檢驗(yàn)。用如下參數(shù)來(lái)評(píng)定(gauge) 治療的有效性。使用三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)EDSS(殘疾狀況拓展量化表)、惡化表現(xiàn)或MRI (磁共 ISj^ft (magnetic resonance imaging))。 EDSS MS )^ 白勺貞(impairment) ^v 級(jí)的工具(Kurtzke (1983) Neurology 33:1444)。評(píng)價(jià)8個(gè)功能系統(tǒng)的神經(jīng)學(xué)損傷的種類和嚴(yán)重程度。主要地，在治療前，評(píng)價(jià)患者如下系統(tǒng)的損傷錐體(pyramidal)，小腦，腦干， 感覺(jué)，腸和膀胱，視覺(jué)，大腦等等。以指定的(defined)間隔進(jìn)行隨訪。評(píng)分從0 (正常)到 10 (MS 致死)。EDSS 下降表示治療有效(Kurtzke (1994) Ann. Neurol. 36 :573-79)。多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型例如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(autoimmune encephalitis, EAE)小鼠模型，如 Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141 :1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132 :2393-2401)和 Traugott (Cell Immunol. (1989) 119 :114-129)所述。 可在誘導(dǎo)EAE前給小鼠施用本文所述抗體。用特征性(characteristic)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)小鼠來(lái)確定所述抗體的效力。中風(fēng)抗TWEAK抗體(如本文所述抗體)可用于治療(如在最近的48，24，12，8或2小時(shí)內(nèi))患中風(fēng)如血栓栓塞性(thromboembolic)或出血性(hemorrhagic)中風(fēng)的受試者，或預(yù)防中風(fēng)，例如在有中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的受試者中預(yù)防中風(fēng)。方法例如參見USSN 60/653，811所述。 中風(fēng)是由血管病導(dǎo)致的急性腦損傷的統(tǒng)稱。中風(fēng)可分為至少兩大類出血性中風(fēng)(由血液滲漏到正常血管外導(dǎo)致)和缺血性中風(fēng)(由于供血不足導(dǎo)致的腦缺血)。一些可導(dǎo)致缺血性中風(fēng)的事件包括血栓癥(thrombosis)，栓塞(embolism)，和全身性灌注不足(systemic hypoperfusion)(導(dǎo)致缺血禾口低氧(hypoxia))。中風(fēng)通常由于缺氧(oxygen deprivation)和繼發(fā)事件導(dǎo)致神經(jīng)性死亡和腦損傷。 由于缺乏供血或其它損害導(dǎo)致死亡的腦區(qū)域被稱為梗死(infarct)。有時(shí)，本文所述治療可用于縮小梗死范圍或使之最小化，如通過(guò)減少引起神經(jīng)性死亡或損傷的繼發(fā)事件來(lái)實(shí)現(xiàn)。由在腦動(dòng)脈壁上形成的血栓導(dǎo)致的腦動(dòng)脈阻塞通稱為腦血栓形成。在腦栓塞中， 阻斷(blocking)腦動(dòng)脈的栓塞性(occlusive)物質(zhì)來(lái)自(arises downstream)循環(huán)(如血栓從心臟被運(yùn)到腦動(dòng)脈)。因?yàn)殡y于分辨中風(fēng)是由于血栓還是栓塞，使用術(shù)語(yǔ)血栓栓塞 (thromboembolism)來(lái)包括這兩種中風(fēng)。全身性灌注不足可能是血量(blood level)下降， 紅細(xì)胞壓積下降，低血壓或心臟不能充分泵血的結(jié)果。而且，抗TWEAK抗體可用作預(yù)防性中風(fēng)療法或?yàn)槠湟徊糠?，例如施用到?jīng)歷過(guò)短暫性缺血發(fā)作(transient ischemic attack, TIA)或正表現(xiàn)出TIA癥狀的受試者。神經(jīng)性疾病抗TWEAK抗體(如本文所述抗體)可用于治療或預(yù)防神經(jīng)性疾病，如機(jī)械性神經(jīng)性倉(cāng)lJ傷(mechanical neuronal trauma)禾口神經(jīng)變性(neurodegenerative)疾病。機(jī)械性神經(jīng)性創(chuàng)傷例如有脊髓損傷(SCI)和創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)。神經(jīng)變性疾病例如有肌 ^ftIIlJ^(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 3 ^ ) ^ (progressive bulbar palsy，PBP)，原發(fā)性側(cè)索硬化(primary lateral sclerosis，PLS)，進(jìn)行性肌萎縮(progressive muscular atrophy, PMA)，中白金森病(Parkinson' s disease)，亨廷屯頁(yè)病(Huntington' s disease，HD)，禾Π 阿爾茨海默病(Alzheimer，s Disease)。參見例如 USSN 60/653,813。一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)性疾病主要特征為神經(jīng)細(xì)胞的破壞或死亡，所述神經(jīng)細(xì)胞如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(如ALS)，基底神經(jīng)節(jié)(basal ganglia)的紋狀體神經(jīng)元(striatal neuron)和/或皮質(zhì)(cortical)神經(jīng)元(如亨廷頓病)，黑質(zhì)(substantia nigra)神經(jīng)元 (如帕金森病)。癌癥TffEAK及其受體可參與至少一些類型的癌癥如胰腺癌的發(fā)病?？筎WEAK抗體(如本文所述抗體)可用于治療或預(yù)防癌癥(如腺癌)及其它瘤形成性疾病。參見例如2005 年 5 月 27 日提交的 “TREATMENT OF CANCER，，，USSN 60/685,465。藥物組合物抗TWEAK抗體(如本文所述抗體)可以配制成藥物組合物給受試者施用，用于如治療本文所述的疾病。藥物組合物通常含有可藥用載體。本文所用的“可藥用載體”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)(dispersion media)、包衣(coating)、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等生理相容性試劑。該組合物可包括可藥用鹽，如酸加成鹽或堿加成鹽 (參見例如 Berge，S. M.，et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19)。藥物配制是公知技術(shù)，并且進(jìn)一步描述在例如Gennaro (ed.)，Remington =The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed. , Lippincott, Williams & Wilkins(2000) (ISBN :0683306472) ；Ansel et al. , Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,7th Ed. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1999)(ISBN 0683305727) ；and Kibbe(ed. ), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN :091733096X)中。藥物組合物可以為多種形式。這些形式包括例如，液體、半固體及固體劑型，如溶液(如注射液和灌注(infusion)液)、分散體(dispersion)或懸浮液(suspension)、片劑、 丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選形式可以取決于用藥模式和治療目的。通常，本文所述試劑的組合物采用注射液或灌注液的形式。一個(gè)實(shí)施方案中，抗TWEAK抗體與賦形劑物質(zhì)，如氯化鈉，七水磷酸氫二 內(nèi)(sodium dibasic phosphate heptahydrate)、 M St 二 S1 內(nèi)(sodium monobasic phosphate)，以及穩(wěn)定劑一起配制。它可以以例如緩沖溶液中的合適濃度提供，并可以貯存在 2-8"C。這些組合物可以經(jīng)非腸胃方式施用(如靜脈，皮下，腹腔或肌內(nèi)注射)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“非腸胃施用”指除了腸道施用和局部表面施用以外的施用模式， 通常經(jīng)注射而施用，包括但不限于經(jīng)以下模式注射和輸注靜脈內(nèi)(intravenous)、 肌肉內(nèi)(intramuscular)、云力脈內(nèi)(intraarterial)、鞘內(nèi)(intrathecal)、囊內(nèi) (intracapsular)、目艮眶內(nèi)(intraorbital)、心內(nèi)(intracardiac)、皮內(nèi)(intradermal)、 Il復(fù)月空(intraperitoneal) > in iW (transtracheal)、 1 Τ" (subcutaneous)、 1 下(subcuticular)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intraarticular)、被膜下(subcapsular)、蛛網(wǎng)膜下 (subarachnoid)(intraspiriEil)、MH夕卜(epidural)月匈#內(nèi)(intrasterriEil)。可以將組合物配制成溶液、微乳液、分散體、脂質(zhì)體或其它適于在高濃度穩(wěn)定貯存的有序結(jié)構(gòu)。將合適的溶劑中的所需量的本文所述試劑，根據(jù)需要摻入上文所列的一種或多種成分，再過(guò)濾除菌，可以制得無(wú)菌注射液。通常，將本文所述試劑摻入含有基本分散介質(zhì)和上文所列的所需其它成分的無(wú)菌媒介物(vehicle)中，可制得分散體。在制備
22無(wú)菌注射液所用的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，其從本文所述試劑和任何其它所需成分的事先過(guò)濾除菌的溶液產(chǎn)生粉末。溶液的適當(dāng)流動(dòng)性(proper fluidity)可以通過(guò)以下方法維持，例如，利用卵磷脂之類的包衣、在分散體的情況下維持所需的粒徑(particle size)、以及利用表面活性劑。注射組合物通過(guò)在組合物中包含單硬脂酸鹽和明膠之類的延遲吸收劑，可延長(zhǎng)吸收時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，抗TWEAK抗體可以與保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體(carrier) —起制備，如控釋配制劑，包括植入體(implant)以及微囊遞送體系 (microencapsulated delivery system)。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸 (polyglycolic acid)、膠原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸(polylactic acid)。制備這類配制劑的多種方法已有專利或者是眾所周知的。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York(1978)?？筎WEAK抗體可以用例如改進(jìn)其在循環(huán)(如血液、血清)或其它組織中的穩(wěn)定性和/或滯留時(shí)間的組分(moiety)進(jìn)行修飾，所述改進(jìn)例如是改進(jìn)至少1. 5、2、5、10或50倍。 可以評(píng)估被修飾的抗體是否到達(dá)炎癥位置如關(guān)節(jié)。例如，抗TWEAK抗體可以與聚合物締合(如偶聯(lián))，所述聚合物例如基本上無(wú)抗原性的聚合物，如聚環(huán)氧烷烴(polyalkylene oxide)或聚環(huán)氧乙烷(polyethylene oxide)。 合適的聚合物分子量可以差別很大?？梢圆捎梅肿恿科骄s200-約35，000道爾頓(或約 1，000-約 15，000、以及 2，000-約 12，500)的聚合物。例如，抗TWEAK抗體可以與水溶性聚合物偶聯(lián)，所述聚合物例如親水聚乙烯聚合物，如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。這類聚合物的例子包括，聚環(huán)氧烷烴均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenated polyols)、它們的共聚物和嵌段共聚物，只要維持所述嵌段共聚物的水溶性即可。其它可用的聚合物包括，聚氧化烯(polyoxyalkylenes)如聚氧化乙烯(polyoxyethylene)、聚氧化丙烯(polyoxypropylene)、以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯 (polymethacrylates)；丙烯酸共聚物(carbomer)；以及分支或非分支多糖。在一些方案中，抗TWEAK抗體也可以偶聯(lián)或締合標(biāo)記物或其它試劑如其它的治療劑如細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，但在很多實(shí)施方案中，此構(gòu)型是不必要的。細(xì)胞毒劑和化療劑舉例包括紫杉醇(taxol)、松胞菌素Wcytochalasin B)、短桿菌肽D (gramicidin D)、長(zhǎng)春花堿(vinblastine)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、美登木素生物堿(maytansinoid)(如美登木醇(maytansinol)或DMl美登木素生物堿、美登素 (maytansine)的含巰基衍生物)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝霉素(mithramycin)、放線菌素(actinomycin)D、l-去氫睪酮(l-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素類，普魯卡因(procaine)、紫杉燒(taxane)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普萘洛爾 (propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及它們的類似物或同系物。當(dāng)抗TWEAK抗體與第二種試劑(如抗-TNF- α抗體或其它試劑)聯(lián)用時(shí)，這兩種試劑可以分開或一起配制?？梢砸詤f(xié)同(synergistically)有效的量配制或者使用所述試劑。也可以使用一或全部?jī)煞N所述試劑，但它們的量比各自單用的量低。例如，可以在例如施用前，混合各種藥物組合物并一起施用，或可以分開施用，如在相同或不同的時(shí)間施用。也可以使用其它TWEAK阻斷劑，如USSN 60/679，518所述的試劑。所述試劑可以是能夠給受試者施用的任何類型化合物(如有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子、核酸、蛋白質(zhì)或肽模擬物 (peptide mimetic))。一個(gè)實(shí)施方案中，所述阻斷劑是生物學(xué)的，如分子量在5_300kDa之間的蛋白質(zhì)。例如，TffEAK阻斷劑可抑制TWEAK與TWEAK受體的結(jié)合。除結(jié)合TWEAK的抗體之外的TWEAK阻斷劑舉例包括，結(jié)合TWEAK-R的抗體及與細(xì)胞表面的TWEAK-R競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 TffEAK的可溶形式的TWEAK-R(如而14)。也可以例如用常規(guī)方法或本文所述方法提供藥物組合物形式的本文所述其它治療劑?？梢杂枚喾N方法將抗TWEAK抗體施用給受試者，如人類受試者。在很多應(yīng)用中，施用途徑是下述之一靜脈注射或灌注(IV)，皮下注射(SC)，腹腔(IP)或肌肉注射。也可以使用關(guān)節(jié)內(nèi)遞送。也可以使用其它非腸胃施用模式。這些模式例如包括動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)氣管、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外以及胸骨內(nèi)注射。有些情況下，施用可以直達(dá)炎癥位置如關(guān)節(jié)或其它發(fā)炎的位置。施用所述抗體的途徑和/或模式也可以根據(jù)個(gè)案定制，如通過(guò)監(jiān)測(cè)受試者，如使用斷層成像(tomographic imaging)，神經(jīng)學(xué)檢查(neurological exam)，及與具體疾病有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，如評(píng)價(jià)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定制?？梢园垂潭▌┝?fixed dose)，或者按mg/kg劑量施用所述抗體。也可以選擇劑量來(lái)降低或避免產(chǎn)生針對(duì)抗TWEAK抗體的抗體。可以對(duì)劑量方案(dosage regimen)進(jìn)行調(diào)整，以產(chǎn)生所需反應(yīng)，例如治療反應(yīng)或組合治療效應(yīng)(combinatorial therapeutic effect) 0通常，抗TWEAK抗體(以及可選的第二種試劑)的用量可以給受試者提供生物可利用的(bioavailable)量的所述試劑。例如，可以施用 0. l-100mg/kg, 0. 5-100mg/kg, lmg/ kg-100mg/kg,0. 5-20mg/kg,0. 1-lOmg/kg，或 1-lOmg/kg 的劑量。也可以使用其它劑量。本文所用的單位劑量(Dosage unit form)或“固定劑量”指物理離散單位，是適合對(duì)受治受試者施用的單次藥劑(unitary dosage)；每一單位含有預(yù)定量的活性化合物和所需的藥用載體，還可以任選含有其它試劑，所述活性化合物的預(yù)定量是經(jīng)過(guò)計(jì)算可以產(chǎn)生所需治療效應(yīng)的量?？梢越o予單一或多重劑量?？蛇x地或另外地，所述抗體可經(jīng)連續(xù)灌注來(lái)施用。例如，可以在一段時(shí)間(一個(gè)療程)內(nèi)以定期間隔(periodic interval)施用抗 TWEAK抗體，所述一段時(shí)間足以包括至少2次(dose)，3次，5次，10次，或更多，如每日1或 2次，或每周約1-4次的給藥，或優(yōu)選每周，每?jī)芍?，每月，如約1-12周，優(yōu)選2-8周，更優(yōu)選約3-7周，甚至更優(yōu)選約4、5或6周給藥?？赡苡绊懹行е委熓茉囌咚璧膭┝康囊蛩睾蜁r(shí)間(timing)，包括如疾病或病癥嚴(yán)重程度，配制劑，遞送途徑，治療史，受試者的總體健康狀況和/或年齡，以及其它存在的疾病。另外，用治療有效量的化合物治療受試者可包括單次治療或，優(yōu)選包括系列治療(series of treatment) 0也可用動(dòng)物模型來(lái)確定有用的劑量，如起始劑量或方案。如果受試者有發(fā)生炎癥或其它本文所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)，所述抗體可以在疾病完全發(fā)作前施用，如作為預(yù)防措施。此種預(yù)防性治療的持續(xù)時(shí)間可以是所述抗體的單個(gè)劑量，或者所述治療可以持續(xù)(如多重劑量)。例如，對(duì)有疾病風(fēng)險(xiǎn)或有發(fā)病傾向的受試者，可以用所述抗體治療數(shù)日，數(shù)周，數(shù)月或甚至數(shù)年，從而避免疾病的發(fā)生或暴發(fā)(fulminate)。藥物組合物可包含“治療有效量”的本文所述試劑。這些有效量可以基于所施用試劑的效用，或在使用一種以上的試劑時(shí)試劑的組合效用來(lái)確定。試劑的治療有效量也可以因個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別、體重，以及該化合物在該個(gè)體體內(nèi)激發(fā)所需反應(yīng)的能力等因素而有不同，所述能力例如改進(jìn)至少一個(gè)疾病參數(shù)或改進(jìn)該疾病的至少一種癥狀。治療有效量也可以是，治療有益效果超過(guò)該組合物的任何毒副作用或有害作用的量。用于治療的設(shè)備和試劑念可以利用醫(yī)療設(shè)備(medical devices)來(lái)施用包含抗TWEAK抗體的藥物組合物。 所述設(shè)備可設(shè)計(jì)具有以下性能例如便攜性(portability)，室溫貯藏(storage)，以及使用簡(jiǎn)易性，從而可以在緊急條件下使用它，如由未受訓(xùn)者或本領(lǐng)域急救人員從醫(yī)療設(shè)備和其它醫(yī)療裝備正取出。該設(shè)備可以包括，如用于貯存含有抗TWEAK抗體的藥物制劑的一或多個(gè)腔(housing)，并可被構(gòu)建(configure)成遞送所述抗體的一或多個(gè)單位劑量的形狀?？梢赃M(jìn)一步構(gòu)建該設(shè)備的形狀來(lái)施用第二種試劑，如抗-TNF-α抗體，為另外還包含抗 TffEAK抗體的單一藥物組合物或?yàn)閮煞N分開的藥物組合物。例如，藥物組合物可以用無(wú)針式皮下注射設(shè)備(needleless hypodermic injection device)來(lái)施用，所述設(shè)備參見例如美國(guó)專利5，399，163，5，383，851， 5，312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556。眾所周知的植入體和模塊 (module)有美國(guó)專利4，487，603公開了一種可植入的顯微-輸注泵，用于以控制速率分配(dispensing)藥物；美國(guó)專利4，486，194公開了一種治療設(shè)備，用于穿過(guò)皮膚施用藥物； 美國(guó)專利4，447，233公開了一種藥物輸注泵，用于以精確的輸注速率遞送藥物；美國(guó)專利 4，447，224公開了一種可變流植入型輸注裝置，用于連續(xù)遞送藥物；美國(guó)專利4，439，196公開了一種滲透型藥物遞送體系，其具有多室隔間(multi-chamber compartment)；美國(guó)專利 4，475，196公開了一種滲透型藥物遞送體系。當(dāng)然，多種其它的設(shè)備、植入體、遞送體系和模塊也是已知的?？梢杂迷噭┖行问教峁┛筎WEAK抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括(a)裝有組合物的容器，所述組合物含有抗TWEAK抗體，還可以含有(b)信息材料(informational material)。所述信息材料可以是描述性(descriptive)、指導(dǎo)性(instructional)、商品廣告性(marketing)或其它性質(zhì)的材料，它們與本文所述方法和/或使用所述試劑的治療益處有關(guān)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括用于治療炎性疾病的第二種試劑，如抗-TNF- α 抗體。例如，所述試劑盒包括裝有包含抗TWEAK抗體的組合物的第一個(gè)容器，和裝有該第二種試劑的第二個(gè)容器。試劑盒中的信息物質(zhì)其形式不限。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述信息物質(zhì)包含關(guān)于該化合物的制備、該化合物的分子量、濃度、有效期、批號(hào)或生產(chǎn)地信息等等的信息。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述信息物質(zhì)涉及，例如以合適的劑量(dose)、劑型、或施用模式(如本文所述劑量、劑型、或施用模式)施用抗TWEAK抗體的方法，來(lái)治療患有炎性疾病或其它本文所述疾病或有相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的受試者。所述信息物質(zhì)可以以多種形式提供，包括印刷的文字(text)、 計(jì)算機(jī)可讀形式、視頻記錄、或聲頻記錄，或提供實(shí)質(zhì)性材料的鏈接(link)或地址(如在互聯(lián)網(wǎng)上)的信息。
25
試劑盒的組合物中，除了含有所述抗體，還可以含有其它成分，如溶劑或緩沖液、 穩(wěn)定劑、或保存劑(preservative)。所述抗體可以以任何形式，例如液體、干燥形式或凍干形式，優(yōu)選基本純的和/或無(wú)菌的形式提供。當(dāng)所述試劑以溶液形式提供時(shí)，該溶液優(yōu)選是含水溶液。當(dāng)所述試劑以干燥形式提供時(shí)，一般加入合適的溶劑來(lái)重建。所述溶劑，例如無(wú)菌水或緩沖液，可以選擇包含在試劑盒中。所述試劑盒可以包括一或多個(gè)容器用于裝載含有所述試劑的一或多種組合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括相互分隔的容器、分隔體(divider)或分隔室 (compartment)，用于裝載組合物和信息材料。例如，可以將組合物裝在大瓶(bottle)、小瓶(vial)或注射器(syringe)中，將信息材料裝在塑料的套(sleeve)或包(packet)中。 在其它實(shí)施方案中，將試劑盒的不同組件裝在一個(gè)不分隔的容器中。例如，將組合物裝在大瓶、小瓶或注射器中，而所述大瓶、小瓶或注射器上貼有標(biāo)簽形式的信息材料。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括一組(a plurality)(如一包(pack))容器，其中每一容器裝有一或多個(gè)單位劑型(如本文所述劑型)的所述試劑。所述容器可以包括一個(gè)組合(combination) 單位劑量(unit dosage)，例如含有抗TWEAK抗體和第二種試劑(如按所需比例)的單位。 例如，所述試劑盒包括一組注射器、安瓿(ampules)、箔制包(foil packet)、帶氣泡的包裝袋(blister pack)、或醫(yī)療設(shè)備，例如每一個(gè)都容納一個(gè)單位劑量。試劑盒中的這些容器可以是隔絕空氣的(air tight)、防水的(waterproof)(如濕度或蒸發(fā)引起的變化都無(wú)法透過(guò))、和/或避光的(light-tight)。所述試劑盒還可以選擇含有適于施用所述組合物的裝置，例如注射器或其它合適的遞送裝置。所述裝置可以預(yù)先裝載所述試劑的一或全部?jī)煞N，或者也可以是空的但適于裝載試劑。靶向表達(dá)TWEAK的細(xì)胞本文所述的抗TWEAK抗體可用于將其所攜帶的有效物質(zhì)(payload)靶向表達(dá) TffEAK的細(xì)胞或組織或其它與TWEAK有關(guān)的結(jié)構(gòu)。例如，所述抗體可以與能遞送外源基因的病毒或病毒樣顆粒(如用于基因療法)或脂質(zhì)體(如包容有治療劑或外源基因的脂質(zhì)體)連接。用抗體靶向病毒的方法舉例見Roux et al. (1989)Proc Natl Acad Sci Π2Δ(1989) 86 :9079-9083 所述。也參見例如 Curr Gene Ther. (2005)5 :63-70, Hum Gene Ther. (2004) 15 1034-1044。本發(fā)明的抗-TWEAK Ab也可以連接到含治療劑如化療劑的脂質(zhì)體上?？贵w與脂質(zhì)體的連接可以用任何已知的交聯(lián)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，如廣泛用于將毒素或化療劑與抗體偶聯(lián)來(lái)進(jìn)行定向遞送的異源雙功能(heterobifimctional)交聯(lián)劑。例如，與脂質(zhì)體偶聯(lián)可以用定向碳水化合物的交聯(lián)試劑4-(4-馬來(lái)酰亞氨苯基)丁酸酰胼G-(4-maleimid0phenyl) butyric acid hydrazide, MPBH) ^$3 (Duzgunes et al. (1992) J. Cell. Biochem. Abst. Supp 1. 16E 77)。含脂質(zhì)體的抗體也可用公知方法制備(參見例如DE 3,218, 121 ；Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 :3688-92 ；Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4030-34 ；U. S. 4，485，045 和 4，544，545)。診斷用途 抗TWEAK抗體可在檢測(cè)有無(wú)TWEAK的體外(如生物樣本，如組織，活檢標(biāo)本)或體內(nèi)(如受試者的體內(nèi)成像)診斷方法中使用。例如，可以將人的或有效人化的抗TWEAK抗體施用到受試者來(lái)檢測(cè)該受試者內(nèi)的TWEAK。例如，所述抗體可用，例如MRI可檢測(cè)標(biāo)記物或放射性標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。該受試者可用檢測(cè)該可檢測(cè)標(biāo)記物的工具來(lái)評(píng)價(jià)。例如，可以掃描該受試者來(lái)評(píng)價(jià)所述抗體在受試者體內(nèi)的定位。例如，該受試者可以用例如NMR或其它斷層工具來(lái)成像。用于診斷成像的標(biāo)記物舉例包括放射性標(biāo)記物，如mIZ11^iZ23L99U2Pj3P, 125I，3H, 14C,和188詘，熒光標(biāo)記物如熒光素(fluorescein)和羅丹明(rhodamine)，核磁共振活性標(biāo)記物，用正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(“PET”)掃描儀可檢測(cè)的發(fā)射正電子的同位素，化學(xué)發(fā)光物(chemiluminescer)，如螢光素(Iuciferin)，和酶標(biāo)標(biāo)記物如過(guò)氧化物酶或磷酸酶。也可使用短程輻射源(short-range radiation emitter)，如用近程檢測(cè)探針可檢測(cè)的同位素?？捎眠@些試劑用已知技術(shù)標(biāo)記蛋白質(zhì)配體。例如，涉及放射性標(biāo)記抗體的技術(shù)參見 Wensel and Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York，禾口 Colcher et al. (1986)Meth. Enzymol. 121 :802-816?？梢杂靡阎夹g(shù)如放射性核素掃描技術(shù)，用如Y照相機(jī)或發(fā)射斷層攝影術(shù)(emission tomography)給受試者體內(nèi)“造影”。見例如 A. R. Bradwell et al.， "Developments m Antibody Imaging，，，Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al.，(eds.)，pp 65—85 (Academic Pressl985)?；蛘?，當(dāng)放射性標(biāo)記物(如"C，18F，150，及13N)發(fā)射正電子時(shí)，可以使用正電子發(fā)射橫斷面(transaxial) 斷層攝影術(shù)掃描儀,如位于BrooWiaven National Laboratory的Pet VI。MRI造影劑(contrast agent)。磁共振成像(MRI)利用NMR來(lái)觀察活體受試者的內(nèi)部特征，并用于預(yù)后、診斷、治療和手術(shù)。MRI的明顯益處在于其不使用放射性示蹤化合物。對(duì)一些MRI技術(shù)的總結(jié)見于EPO 502 814 A。一般利用不同環(huán)境中與水質(zhì)子弛豫 (relaxation)時(shí)間常數(shù)Tl和T2相關(guān)的差異來(lái)成像。然而，這些差異不足以提供清晰的高分辨率的影像。這些弛豫時(shí)間常數(shù)的差異可以用造影劑改善。這些造影劑的例子包括多種磁性劑 (magnetic agent)，順磁性劑(paramagnetic agent)(主要改變Tl)和鐵磁性或超磁性物質(zhì)(主要改變T2反應(yīng))。螯合劑(如EDTA，DTPA和NTA螯合劑)可用于一些順磁性物質(zhì) (如i^3+，Mn2+，Gd3+)的連接(和毒性降低)。其它試劑可以呈顆粒狀，如直徑小于ΙΟμπι至約lOnm)。顆?？梢跃哂需F磁性，反鐵磁性，或超磁性。顆?？梢园?，如磁鐵礦(Fe53O4)， Y-Fe2O3，鐵酸鹽，及屬于過(guò)渡元素的其它磁性礦物化合物。磁性顆?？砂ê安缓谴判晕镔|(zhì)的一或多種磁性晶體。非磁性物質(zhì)可包含合成的或天然的聚合物(如kpharose，葡聚糖，糊精，淀粉等)?？筎WEAK抗體也可用指示基團(tuán)標(biāo)記，所述基團(tuán)包含NMR-活性19F原子，或多種這類原子，因?yàn)?i)基本上所有的天然富含氟的原子是19F同位素，因此，基本所有的含氟化合物具有NMR-活性；(ii)多種化學(xué)活性多氟化合物，如三氟乙酸酐可以用較低價(jià)格買到， 并且(iii)已發(fā)現(xiàn)很多氟化化合物是醫(yī)療上可用于人的，如全氟多醚(perfluorinated polyether)作為血紅蛋白替代物來(lái)運(yùn)送氧。在一段時(shí)間的溫育后，用如Pykett (1982) Scientific American, 246 :78-88所述的裝備之一進(jìn)行全身MRI，來(lái)定位并造影TWEAK的分布。另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)體外樣本(如生物樣本，如血清，血菜，組織，活檢標(biāo)本)中TWEAK的存在的方法。所述方法可用于診斷疾病，如免疫細(xì)胞相關(guān)性疾病。所述方法包括(i)使樣本或?qū)φ諛颖九c抗TWEAK抗體接觸；和(ii)評(píng)價(jià)樣本中TWEAK的存在，如通過(guò)檢測(cè)抗TWEAK抗體與TWEAK形成的復(fù)合物，或者通過(guò)檢測(cè)所述抗體或TWEAK的存在來(lái)評(píng)價(jià)。例如，可以將所述抗體固定在例如支持物上，檢測(cè)被留在支持物上的抗原，和/或反之?？梢园▽?duì)照樣本。相對(duì)于對(duì)照樣本，試驗(yàn)樣本中復(fù)合物形成的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改變可以指示樣本中TWEAK的存在。通常，抗TWEAK抗體可用于包括熒光極化(polarization)、顯微鏡檢、ELISA、離心、層析和細(xì)胞分選(如熒光活化細(xì)胞分選)在內(nèi)的應(yīng)用。實(shí)施例1鼠P2D10重鏈可變區(qū)的序列(⑶R用下劃線標(biāo)記)是1 EVQLVESGGG LVRPGGSLKL FCAASGFTFS RYAMSffVRQS PEKRLEffVAE51 ISSGGSYPYY PDTVTGRFTI SRDNAKNTLY LEMSSLKSED TAMYYCARVL101 YYDYDGDRIE VMDYffGQGTA VIVSS (SEQ ID NO 50)這是鼠亞組3D重鏈可變區(qū)。鼠P2D10輕鏈可變區(qū)的序列(⑶R用下劃線標(biāo)記)是1 DVVMTQSPLS LSVSLGDQAS ISCRSSQSLY SSKGNTYLHW YLQKPGQSPK51 FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVAAEDLGV YFCSQSTHFP101 RTFGGGTTLE IK (SEQ ID NO 51)這是鼠亞組2kappa輕鏈。為huP2D10選擇如下的人接受體框架人56_8細(xì)亞組3重鏈可變區(qū)(NCBI database accession number GI :33318898, Scamurra et al. , direct submission)。序列(⑶R用下劃線標(biāo)記)如下1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMSffVRQA PGKGLEffVAN51 IKQDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP101 MTTVVKPSLA TNDYffGQGTL VTVSS (SEQ ID NO :52)人 K107 亞組 2 輕鏈可變區(qū)的序列(NCBI database accession number GI 21669075, Akahori et al.，direct submission) (CDR 用下劃線標(biāo)記)是1 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDff YLQKPGQSPQ51 LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTP101 LTFGGGTKVE IK (SEQ ID NO :53)在顯示的人接受體序列中，⑶R(下劃線標(biāo)記的)與muP2D10可變區(qū)中的那些具有相同長(zhǎng)度和規(guī)范等級(jí)。如下顯示鼠P2D10(上)和人接受體56_8細(xì)(下)重鏈可變區(qū)的序列比對(duì)(68.8% 相同).1 EVQLVESGGGLVRPGGSLKLFCAASGFTFSRYAMSffVRQSPEKRLEffVAE 50IIIIIIIIIII. INN lllllll I ΜΙΝΙ· I III1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSffVRQAPGKGLEffVAN 50....51 ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLKSEDTAMYYCARVL 100
I Il Il I.I MIIIIIIIIII. 111:1. II:· MM. IIM51 IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP 100..101 YYDYDGDRIEYMDYffGQGTAYIVSS 125 (SEQ ID NO 54) IMIIII Ι Μ101 MTTYYKPSLATNDYffGQGTLYTVSS 125(SEQ ID NO 55)如下顯示鼠P2D10 (上)和人接受體K107輕鏈(下)可變區(qū)的序列比對(duì)(75. 9% 相同).....1 DVVMTQSPLSLSVSLGDQASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPK 50IIIIIIIM I. IIIIIIIIII. I I Il IIIIIIIII.1 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDffYLQKPGQSPQ 50.....51 FLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVAAEDLGVYFCSQSTHFP 100μι μι ιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιι Ml· III I.51 LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100.101 RTFGGGTTLEIK 112(SEQID NO :56)I I I I I I . I I101 LTFGGGTKVEIK 112(SEQ ID NO :57)huP2D10輕鏈有兩個(gè)版本(Li和L2)?？贵whuP2D10_l指包含huP2D10Hl和 huP2D10Ll 的抗體。抗體 huP2D10-2 指包含 huP2D10Hl 和 huP2D10L2 的抗體。如下顯示56-8 !人接受體(上)和huP2D10Hl重鏈(下)可變區(qū)的序列比對(duì).....1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSffVRQAPGKGLEffVAN 50111111111111111111111111111111 I 1111111111111111 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSffVRQAPGKGLEffVAE 50..51 IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP 100ι Il Il |. IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIM
51 ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVL 100..101 MTTYYKPSLATNDYffGQGTLYTVSS 125(SEQID NO :58) ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι I101 YYDYDGDRIEVMDYffGQGTLVTVSS 125(SEQ ID NO :59)下劃線標(biāo)記CDR。huP2D10重鏈?zhǔn)侵苯拥?straight) CDR移植物(即框架中無(wú)回
復(fù)突變)。如下顯示K107人kappa接受體(上)和huP2D10Ll輕鏈(下)可變區(qū)的序列比對(duì)
1DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSS0SLLHSNGYNYLDWYL0KPG0SP0 50
llllllllllllllllllllllllllll. I I Il IIIIIIIII
1DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSS0SLVSSKGNTYLHWYL0KPG0SP0 50
51LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMOALOTP 100
Il III llllllllllllllllllllllllllllll |.
51fLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYfCSOSTHFP 100
101LTFGGGTKVEIK 112(SEQ ID NO :60)
IIIIIIIII
101RTFGGGTKVEIK 112(SEQ ID NO :61)
下劃線標(biāo)記CDR。huP2D10Ll輕鏈在上面所示框架中有兩處用小寫字母標(biāo)出的回復(fù)突變:FR2 中的 L46F 和 FR3 中的 Y87F。
如下顯示K107人接受體(上)和huP2D10L2輕鏈(下)可變區(qū)的序列比對(duì)
1DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSS0SLLHSNGYNYLDWYL0KPG0SP0 50
llllllllllllllllllllllllllll· I I Il IIIIIIIII
1DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSS0SLVSSKGNTYLHWYL0KPG0SP0 50
51LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100
III III lllllllllllllllllllllllllllllll |.
51LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFP 100
101LTFGGGTKVEIK 112(SEQ ID NO :62)
IIIIIIIII
101RTFGGGTKVEIK 112(SEQID NO :63)
下劃線標(biāo)記CDR。huP2D10L2輕鏈?zhǔn)侵苯拥腃DR移植物(框架中無(wú)回復(fù)突變)。
這是成熟huP2D10 Hl IgGl重鏈的舉例氨基酸序列
1EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYAMSffVRQA PGKGLEffVAE
51ISSGGSYPYY PDTVTGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARVL
101YYDYD⑶RIE VMDYffGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL
151GCLVKDYFPE PVTVSffNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS
201LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL
251FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
301EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
351PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEffE SNGQPENNYK
401TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRffQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS
451LSPG(SEQ ID NO :64)
30
如下顯示重鏈可變區(qū)Vh區(qū)段(SED ID NO 65)的Kabat編號(hào)Kabat 編號(hào) 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890hP2D10 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYAMSffVRQA PGKGLEffVAEKabat 編號(hào) 12a3456789 0123456789 0123456789 012abc3456 78901234hP2D10 ISSGGSYPYY PDTVTGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR這是成熟huP2D10Ll輕鏈的舉例氨基酸序列1 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQ51 FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFCSQSTHFP101 RTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK151 VQffKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE201 VTHQGLSSPV TKSFNRGEC(SEQ ID NO 66)如下顯示此\區(qū)段的Kabat編號(hào)(SEQ ID NO 67)Kabat No. 1234567890 1234567890 1234567abc de89012345 6789012345hP2D10 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQKabat No. 6789012345 6789012345 6789012345 6789012345 6789012345hP2D10 FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFCSQSTHFP這是成熟huP2D10L2輕鏈的舉例氨基酸序列1 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQ51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQSTHFP101 RTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK151 VQffKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE201 VTHQGLSSPV TKSFNRGEC(SEQ ID NO :68)如下顯示此\區(qū)段的Kabat編號(hào)(SEQ ID NO :69)Kabat No. 1234567890 1234567890 1234567abc de89012345 6789012345hP2D10 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQKabat No. 6789012345 6789012345 6789012345 6789012345 6789012345hP2D10 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFCSQSTHFP實(shí)施例2封閉TWEAK的單克隆抗體mP2D10顯著降低了多發(fā)性硬化、中風(fēng)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型的臨床嚴(yán)重程度。針對(duì)抗TWEAK單克隆抗體mP2D10在靜脈(IV)給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)(PK)建立模型。經(jīng)IV注射給予小鼠1、10或100mg/kg的mP2D10。用ELISA測(cè)定mP2D10的血清濃度。濃度-時(shí)間1 分布圖(profile)用二室模型來(lái)分析，其采用一級(jí)消除動(dòng)力學(xué) (first-order elimination)或Michaelis-Menten消除動(dòng)力學(xué)，從具有Vl體積的中央室進(jìn)行消除。二室間的速度常數(shù)是K12(從1室釋放(exiting)到2室)和K21(從2室釋放到1室)。對(duì)于一級(jí)消除動(dòng)力學(xué)模型，消除速度常數(shù)是Κ10。對(duì)于Michaelis-Menten消除動(dòng)力學(xué)模型，藥物以Vm*Cl/(Km+Cl)的速度清除，其中Cl是在中央室的mP2D10濃度，Vm 和 Km 為常數(shù)。用軟件 ADAPT II (D' Argenio, D. Ζ. and A. Schumitzky. ADAPT IIUser' s Guide Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software. BiomedicalSimulations Resource, Los Angeles, 1997.),用最大似然估計(jì)(Maximum Likelihood estimation)方法來(lái)擬合數(shù)據(jù)。對(duì)于二室線性消除模型，Vl是 23. 2mL/kg，K10 是 0. 0096h_l，K12 是 2. 501,K21 是 1. 053。曲線下面積(AIC)值為298, Schwarz值為304. 2。對(duì)于二室非線性消除模型，Vl是 0. 02；35。Vm 是 9. 22mg/kg/hr，Km 是 484. 2μ g/mL。K12 是 2. ;M8h_l，K21 是 0. 966h_l。AIC 值為沈9，Schwarz值為276。mP2D10的Hi用非線性模型預(yù)測(cè)比線性模型好。mP2D10的濃度-時(shí)間分布圖用應(yīng)用Michaelis-Menten消除動(dòng)力學(xué)的二室模型預(yù)測(cè)比應(yīng)用一級(jí)消除動(dòng)力學(xué)的二室模型好。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)試驗(yàn)就能得到或能確認(rèn)本文所述的具體實(shí)施方案的很多等效方案。
權(quán)利要求
1.藥物組合物在制備治療選自狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、以及狼瘡性腎炎的疾病的藥物中的用途，所述組合物包含抗TWEAK (TNF樣的弱的凋亡誘導(dǎo)劑)抗體，所述抗體包含能形成與人TWEAK結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，其中所述抗 TWEAK抗體包含選自下組的氨基酸序列a)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO :50的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 51的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同；b)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO :50的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 51的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同；c)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO 52或SEQ ID NO 64的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 61, SEQ IDNO 66，SEQ ID N0:63，或SEQ ID NO 68的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同；d)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO 52或SEQ ID NO 64的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同，且輕鏈可變區(qū)序列與 SEQ ID NO :61,SEQ ID NO 66, SEQID N0:63，或 SEQ ID NO :68 的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同；和e)重鏈可變區(qū)包含多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中 ⑶Rl包含SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；⑶R2包含SEQ ID NO 5所示氨基酸序列；CDR3包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 7所示氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)包含多個(gè)CDR，其中CDRl包含SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列； CDR2包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14所示氨基酸序列； CDR3包含SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16所示氨基酸序列。
2.藥物組合物在制備治療炎性疾病的藥物中的用途，所述組合物包含抗TWEAK(TNF樣的弱的凋亡誘導(dǎo)劑)抗體，所述抗體包含能形成與人TWEAK結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，其中所述抗TWEAK抗體包含選自下組的氨基酸序列a)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO :50的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 51的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同；b)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO :50的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 51的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同；c)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO 52或SEQ ID NO 64的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 61, SEQ IDNO :66，SEQ ID N0:63，或SEQ ID NO 68的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同；d)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO 52或SEQ ID NO 64的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同，且輕鏈可變區(qū)序列與 SEQ ID NO :61,SEQ ID NO 66, SEQID N0:63，或 SEQ ID NO :68 的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同；和e)重鏈可變區(qū)包含多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中 ⑶Rl包含SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；⑶R2包含SEQ ID NO 5所示氨基酸序列；CDR3包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 7所示氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)包含多個(gè)CDR，其中CDRl包含SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列； CDR2包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14所示氨基酸序列； CDR3包含SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16所示氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述炎性疾病選自銀屑病關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，炎性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆病，銀屑病，炎性肌炎，郎格漢斯細(xì)胞的組織細(xì)胞增多癥，成人呼吸窘迫綜合征，閉塞性細(xì)支氣管炎，韋格納肉芽腫病，脈管炎，惡病質(zhì)，口炎，特發(fā)性肺纖維化， 皮肌炎或多肌炎，非傳染性鞏膜炎，牽累肺的慢性結(jié)節(jié)病，脊髓增生異常綜合征，有過(guò)多的未成熟細(xì)胞的難治性貧血，阻塞性肺病，以及巨細(xì)胞動(dòng)脈炎。
4.藥物組合物在制備治療神經(jīng)性疾病的藥物中的用途，所述組合物包含抗TWEAK(TNF 樣的弱的凋亡誘導(dǎo)劑)抗體，所述抗體包含能形成與人TWEAK結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，其中所述抗TWEAK抗體包含選自下組的氨基酸序列a)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO 50的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID N0:51的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同；b)重鏈可變區(qū)序列與SEQID NO :50的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID N0:51的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同；c)重鏈可變區(qū)序列與SEQID N0:52或SEQ ID NO :64的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同，且輕鏈可變區(qū)序列與SEQ ID NO 61, SEQ IDNO 66，SEQ ID N0:63，或SEQ ID NO 68的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列有至少95%相同；d)重鏈可變區(qū)序列與SEQID N0:52或SEQ ID NO :64的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同，且輕鏈可變區(qū)序列與 SEQ ID NO :61,SEQ ID NO 66, SEQID N0:63，或 SEQ ID NO :68 的相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列相同；和e)重鏈可變區(qū)包含多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中 ⑶Rl包含SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；⑶R2包含SEQ ID NO 5所示氨基酸序列；CDR3包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 7所示氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)包含多個(gè)CDR，其中CDRl包含SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列； CDR2包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14所示氨基酸序列； CDR3包含SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16所示氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述神經(jīng)性疾病選自脊髓損傷，創(chuàng)傷性腦損傷，肌萎縮性側(cè)索硬化，進(jìn)行性球麻痹，原發(fā)性側(cè)索硬化，進(jìn)行性肌萎縮，帕金森病，亨廷頓病，和阿爾茨海默病。
全文摘要
本發(fā)明描述了抗TWEAK抗體。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102441163SQ20111035813
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2006年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者亞歷克塞.盧戈夫斯科伊, 埃倫.加伯, 琳達(dá).C.伯克利 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司