專利名稱：一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌性疫苗的制備方法，具體的說是一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
禽巴氏桿菌(又稱為禽多殺性巴氏桿菌)是禽霍亂(也稱為禽巴氏桿菌病)的病原菌，該菌引起的禽霍亂疾病在我國是比較常見的禽類傳染病之一，幾乎所有的家禽都能感染該病，禽類感染該病后發(fā)病率和死亡率很高，以嚴(yán)重下痢、發(fā)病急、病程短、死亡快為主要特征。該病在全國范圍內(nèi)的流行嚴(yán)重影響到我國養(yǎng)禽業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，給養(yǎng)禽戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；蚪M疫苗是將重組的帶有抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，以裸DNA的形式免疫動(dòng)物，利用宿主的細(xì)胞系統(tǒng)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)抗原基因，從而達(dá)到免疫預(yù)防疾病的作用，是目前較為新型的疫苗之一。目前我國用于預(yù)防禽巴氏桿菌引起的禽霍亂的疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種，其中弱毒活疫苗是我國所有禽類傳染病弱毒活疫苗中研究最多的一類，曾在20世紀(jì)80年代達(dá)到了研制的高峰期，但由于禽巴氏桿菌本身復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)和易變異等固有的問題，至今尚未獲得理想的弱毒活疫苗?，F(xiàn)有的市售弱毒活疫苗存在著一系列的問題，如免疫保護(hù)力偏低、免疫期偏短、局部及全身的反應(yīng)偏大，造成減食和嚴(yán)重產(chǎn)蛋下降，甚至有時(shí)會(huì)造成部分接種禽的死亡，以及菌株遺傳不夠穩(wěn)定等技術(shù)問題，應(yīng)用不當(dāng)甚至?xí)鹎莼魜y的爆發(fā)，因此其效果并不十分理想。滅活苗存在的保護(hù)率低和免疫期短的問題比弱毒活苗更為嚴(yán)重，所以研制新型有效的禽巴氏桿菌病疫苗勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問題，提供了一種可用于預(yù)防禽巴氏桿菌病的基因組疫苗的制備方法，通過該方法制備出的疫苗，其制備方法簡單，操作方便，制得的產(chǎn)品能夠有效的防止禽巴氏桿菌病對(duì)雞的傷害；
本發(fā)明涉及到以下菌種和試劑
禽巴氏桿菌U^ia/ Pasteurella)購買自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；
大腸桿菌JM83菌株(fecAericAia. cWi JM83)購買于華美生物工程有限公司； DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結(jié)合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；
限制性內(nèi)切酶BamH I、10倍限制性內(nèi)切酶BamH I緩沖液、限制性內(nèi)切酶Sau3A I和 10倍限制性內(nèi)切酶Sau3A I緩沖液、限制性內(nèi)切酶EcoR I、10倍限制性內(nèi)切酶EcoR I緩沖液、T4DNA連接酶、10倍T4DNA連接酶緩沖液、10倍小牛小腸堿性磷酸酶緩沖液，小牛小腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase, CIAP，購買于大連寶生物工程有限公司；蛋白酶K購買于北京鼎國生物工程有限公司；
一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法，其具體步驟為
步驟一、禽巴氏桿菌基因組的提取
1)取0.1毫升的禽巴氏桿菌，將其接種到10毫升的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在 37°C條件下，培養(yǎng)18小時(shí)，形成菌液，備用；
2)從步驟1)的菌液中提取禽巴氏桿菌基因組，將得到的禽巴氏桿菌基因組放置在-20°C條件下，備用；
步驟二、禽巴氏桿菌基因組的酶切、回收及純化
1)酶切體系的配制在0.5ml離心管a中加入42. 5微升的禽巴氏桿菌基因組、2. 5微升的限制性內(nèi)切酶Sau3A I和5微升的10倍限制性內(nèi)切酶Sau3A I緩沖液，混合均勻，得到50微升的混合物A，將上述含有混合物A的0. 5ml離心管a放在溫度為37° C的水浴鍋中，放置4分鐘，取出，再將含有混合物A的0. 5ml離心管a放在溫度為75°C的水浴鍋中，放置30分鐘，取出，冷卻至21°C，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物A進(jìn)行檢測
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物A，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物A中含有酶切后的禽巴氏桿菌基因組的目的基因；
3)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的禽巴氏桿菌基因組進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物A放在已稱重的1. 5ml離心管a中，稱取1. 5ml離心管a的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然后將1. 5ml離心管a中的混合物A搗碎，加入與混合物 A等體積的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管a放置在50° C水浴中加熱至混合物 A完全融解，得到混合液I，將混合液I加入到DNA純化柱a上，DNA純化柱a位于收集管a 中，將收集管a置于21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a在21°C 條件下放置1分鐘，后將收集管a送入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a中的液體后，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，再將收集管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a將其放置于1. 5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30微升洗脫液， 將1. 5ml離心管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a得到1. 5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切并純化后的禽巴氏桿菌基因組，存儲(chǔ)于-20°C條件下，備用；
步驟三、真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)的酶切、回收、純化及去磷酸化
1)酶切體系的配制在0.2毫升離心管a中加入50微升的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、 10微升的限制性內(nèi)切酶BamH I、10微升的10倍的限制性內(nèi)切酶BamH I緩沖液和30微升的水，混合均勻，得到的混合物B，將上述混合物B放入37° C的水浴鍋中，反應(yīng)7小時(shí)，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物B進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物B中含有酶切后的真核表達(dá)載體PCDNA3. 1 (+)；
3)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)進(jìn)行回收、純化取1. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將混合物B從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物B放在已稱重的1. 5ml離心管c中，稱取1. 5ml離心管c的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物B的重量，然后將1. 5ml離心管c中的混合物B搗碎，加入等體積的 DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管c放置在50°C水浴中加熱至混合物B完全融解，得到混合液II，將混合液II加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中，收集管b在21°C條件下放置1分鐘，將將收集管b放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，后將收集管b在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管b放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的 DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，然后將收集管b放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱b上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管d在21°C條件下放置 1分鐘，然后將收集管b放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b 得到1. 5ml離心管中d中的液體，該液體就是酶切并純化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)，
4)真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)的去磷酸化
取步驟3)中酶切并回收后的真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) 40微升并加到0. 5毫升離心管b中，然后再在0. 5毫升離心管b中加入5微升的10倍小牛小腸堿性磷酸酶緩沖液、2 微升的小牛小腸堿性磷酸酶和3微升的水，混合均勻，得到混合物C，將含有混合物C的0. 5 毫升離心管b放在37°C的水浴鍋中，放置30分鐘，然后在0. 5毫升離心管b中加入100微升的無水乙醇，混合均勻，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，離心后倒掉 0. 5毫升離心管b內(nèi)沉淀物上層的液體，再向0. 5毫升離心管b中加入15微升的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，得到去磷酸化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)， 存儲(chǔ)于-20°C條件下，備用；
步驟四、禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備
1)禽巴氏桿菌基因組與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的連接
在1. 5ml離心管e中依次加入6微升純化后的禽巴氏桿菌基因組、10微升的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+),2微升的T4 DNA連接酶和2微升的10倍T4DNA連接酶緩沖液，混合均勻，得到的混合物D，將上述含有混合物D的1. 5ml離心管e放入16°C的水浴鍋中，反應(yīng)12 小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，取出備用；
2)將大腸桿菌JM83菌株放置在0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，備用；
3)取步驟2)中100微升的大腸桿菌JM83，將其加到含有混合物D的1.5ml離心管e 中，混合均勻，得到混合物E，將含有混合物E的1. 5ml離心管e置于0°C的冰水混合物中， 放置5分鐘，取120微升的混合物E加到0° C的電擊杯內(nèi)，將電擊杯放到電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，進(jìn)行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1. 8千伏，電阻為200歐姆，電擊時(shí)間為0. 05秒，電擊結(jié)束后，取出含有混合物E的電擊杯，然后在電擊杯內(nèi)加入1毫升的SOC培養(yǎng)基，混合均勻，得到混合物F，將電擊杯內(nèi)的混合物F轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管f中，將1. 5ml離心管f置于37° C的搖床中，轉(zhuǎn)速225轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)為1小時(shí)，待培養(yǎng)結(jié)束后，取出，取100微升培養(yǎng)后的混合物F，并涂布于含有濃度為60微克/毫升的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，將涂布后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基置于37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)16小時(shí)，備用；
4)挑取培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入30毫升含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的濃度為60微克/毫升，后將含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基置于37°C恒溫?fù)u床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，形成培養(yǎng)液，備用；
5)取1.0毫升的培養(yǎng)液，將其加到1. 5ml離心管g中，將1. 5ml離心管g放入4°C離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄去1. 5ml離心管g中沉淀物上層的液體，在 1. 5ml離心管g中加入100微升4° C的溶液I，均勻混合后，加入200微升的溶液II，混合均勻，將1. 5ml離心管g在21°C條件下放置4分鐘，然后向1. 5ml離心管g中加入150微升4° C的溶液III，混合均勻，后將1. 5ml離心管g放于0°C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取出，備用；
6)取1.5ml離心管g中的上層澄清液體400微升，將其加到1. 5ml離心管h中，然后依次向1. 5ml離心管h中加入200微升的苯酚和200微升的氯仿，振蕩混勻后，得到混合液 III，將含有混合液III的1. 5ml離心管h放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400微升將其轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管i中，后向 1. 5ml離心管i中加入400微升氯仿，振蕩混勻后，得到混合液IV，將含有混合液IV的1. 5ml 離心管i放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400微升將其轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管j中，再向1. 5ml離心管j中加入1毫升的無水乙醇，將1. 5ml離心管j置于21° C條件下，放置30分鐘，后取出放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，棄去1. 5ml離心管j中沉淀物上層的液體，得到下部沉淀物I，備用；
7)向含有沉淀物I的1.5ml離心管j中加入500微升濃度70%的乙醇，混合均勻，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，倒掉1. 5毫升離心管j中沉淀物上層的液體，得到沉淀物 II，待1. 5毫升離心管j中的沉淀物II干燥后，向含有沉淀物II的1. 5毫升離心管j中加入 20微升的PBS溶液，濃度為0.01 mmol/L，pH值為7.2，進(jìn)行溶解，得到混合液乂，備用；
8)在1.5毫升離心管k中加入3微升混合液V、1微升的限制性內(nèi)切酶EcoR I、1微升的10倍限制性內(nèi)切酶EcoR I緩沖液和6微升的水，混合均勻，將1. 5毫升離心管k放置于 37°C水浴鍋內(nèi)，放置2小時(shí)，形成混合液VI，即得到禽巴氏桿菌基組疫苗，備用；
9)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合液VI進(jìn)行檢測
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合液VI，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到6000bp的條帶時(shí)，證明禽巴氏桿菌基組疫苗制備成功；
所述的載體為真核表達(dá)載體PCDNA3. 1(+)；
所述的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；
所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；
所述胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中含有1. 5%的胰蛋白胨，0. 5%的大豆蛋白胨，0. 5%的氯化鈉，余量為水；
所述SOC培養(yǎng)基組成成份按重量百分比SOC培養(yǎng)基中含有m的胰化蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、0. 05%的氯化鈉、0. 0 濃度為2. 5mmol/L的氯化鉀、0. 1%濃度為10 mmol/L的氯化鎂、0. 36%濃度為20mmol/L的葡萄糖，余量為水；
所述PBS溶液組成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化鈉、0. 024%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 144%的磷酸氫二鈉，余量為水；
所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述電泳緩沖液的組成成份每升電泳緩沖液中含有40mmol的Tris堿、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份按重量百分比洗脫液中含有40%的濃度lOmol/L的乙酸鈉、 8. 5%的冰醋酸，余量為水；
所述的溶液I的組成成份每升溶液I中含有50 mmol的葡萄糖、25 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的溶液II的組成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%濃度為lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；
所述的溶液III的組成成份按重量百分比溶液III中含有60%的濃度5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水。有益效果
本發(fā)明提供了一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn) 1、傳統(tǒng)的禽巴氏桿菌弱毒疫苗的研制需要利用培養(yǎng)基或者活體動(dòng)物對(duì)禽巴氏桿菌菌種進(jìn)行連續(xù)傳代，利用培養(yǎng)基傳代容易污染雜菌，利用活體動(dòng)物傳代則要考慮動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)禽巴氏桿菌的抵抗作用，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且傳代效果不穩(wěn)定；而本發(fā)明所述的一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法只需將禽巴氏桿菌基因組和真核表達(dá)載體PCDNA3. 1(+) 進(jìn)行酶切后連接并電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM83菌株中，用常規(guī)方法提取質(zhì)粒后溶解即可得到禽巴氏桿菌病基因組疫苗，操作方法簡單易行，容易操作，周期短，適于大批量生產(chǎn)。2、本發(fā)明制備禽巴氏桿菌基因組疫苗時(shí)用于切割禽巴氏桿菌基因組和真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)的限制性內(nèi)切酶分別為Sau3A I和BamH I，這兩種酶為同尾酶，切割后所得序列的末端是互補(bǔ)的，易于在T4 DNA連接酶的作用下將切割后的禽巴氏桿菌基因組和真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)連接在一起。3、本發(fā)明所用轉(zhuǎn)化方法為電轉(zhuǎn)化而不是常規(guī)的化學(xué)轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化方法簡單、快速、 穩(wěn)定、重復(fù)性好，而且不需要對(duì)大腸桿菌JM83菌株進(jìn)行預(yù)先的處理，在電場中依靠高壓脈沖促使酶切并連接后的禽巴氏桿菌基因組和真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)進(jìn)入大腸桿菌 JM83菌株中，但大腸桿菌JM83菌株不會(huì)受到嚴(yán)重的傷害，有利于轉(zhuǎn)化后腸桿菌JM83菌株的生長。4、利用本發(fā)明的方法所制備的疫苗是一種禽巴氏桿菌基因組疫苗，基因組疫苗是重組有抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，以裸DNA的形式免疫機(jī)體后，利用宿主的細(xì)胞系統(tǒng)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)抗原基因，從而達(dá)到免疫作用，而且pcDNA3. 1(+)本身可起到疫苗佐劑的作用，因此，該疫苗抗原性好，抗原蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾及立體構(gòu)象和自然感染時(shí)所產(chǎn)生的抗原蛋白完全一樣，可在禽體內(nèi)合成抗原蛋白，正常的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而且與傳統(tǒng)的弱毒活疫苗相比，沒有返毒的危險(xiǎn)，因此比較安全，應(yīng)用時(shí)不會(huì)因?yàn)橐呙绫旧淼脑蚨l(fā)禽類感染禽巴氏桿菌病。5、利用本發(fā)明的方法所制備的禽巴氏桿菌基因組疫苗，其本質(zhì)上是一種含有禽巴氏桿菌基因組的真核表達(dá)質(zhì)粒，不含有活的禽巴氏桿菌，應(yīng)用時(shí)不必考慮禽巴氏桿菌的活性，而且很容易保存和運(yùn)輸。


圖1為禽巴氏桿菌基組疫苗的雙酶切瓊脂糖凝膠檢測電泳圖中=Marker為5000bp，檢測樣品為雙酶切后的禽巴氏桿菌基組疫苗檢測片段為 6000bp。
具體實(shí)施例方式一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法，具體步驟為 步驟一、禽巴氏桿菌基因組的提取
1)取0.1毫升的禽巴氏桿菌，將其接種到10毫升的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在 37°C條件下，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)18小時(shí)，形成菌液，備用；
2)取步驟1)中的菌液10毫升，將其放入到15毫升離心管中，放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為 8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，倒掉15毫升離心管中沉淀物上層的澄清液體，向15毫升離心管中加入950微升的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，向15毫升離心管中加入50微升濃度為10%的十二烷基硫酸鈉溶液，0. 1克的蛋白酶K，然后將15毫升離心管放在37°C水浴鍋中，放置1小時(shí)，備用；
3)向步驟2)中的15毫升離心管中加入150微升的5mmol/L的氯化鈉，混合均勻，后加入150微升的十六烷基三甲基溴化銨/氯化鈉溶液，混合均勻，將15毫升離心管放在65°C 的水浴鍋內(nèi)，放置10分鐘，再向15毫升離心管內(nèi)加入1300微升的酚、氯仿和異戊醇混合液，混合均勻，將15毫升離心管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，得到上層液體，備用；
4)取步驟3)中的上層液體MOO微升加到5毫升離心管a中，向5毫升離心管中加入 MOO微升的酚、氯仿和異戊醇混合液，混合均勻，將5毫升離心管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，待離心結(jié)束后，取5毫升離心管a中的上層液體1000微升， 并加入到5毫升離心管b內(nèi)，然后向5毫升離心管b內(nèi)加入2000微升的無水乙醇，混合均勻，將5毫升離心管b置于0°C的冰水混合物中，放置2小時(shí)，將5毫升離心管b放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去5毫升離心管b內(nèi)沉淀物上層的澄清液體， 得到沉淀，然后再向5毫升離心管b中加入50微升的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，得到禽巴氏桿菌基因組，將得到的禽巴氏桿菌基因組放置在-20°C條件下，備用；
步驟二、禽巴氏桿菌基因組的酶切、回收及純化
1)酶切體系的配制在0.5ml離心管a中加入42. 5微升的禽巴氏桿菌基因組、2. 5微升的限制性內(nèi)切酶Sau3A I和5微升的10倍限制性內(nèi)切酶Sau3A I緩沖液，混合均勻，得到50微升的混合物A，將上述含有混合物A的0. 5ml離心管a放在溫度為37° C的水浴鍋中，放置4分鐘，取出，再將含有混合物A的0. 5ml離心管a放在溫度為75°C的水浴鍋中，放置30分鐘，取出，冷卻至21°C，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物A進(jìn)行檢測
稱取0. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5微升的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5微升的混合物A和2微升DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物A中含有酶切后的禽巴氏桿菌基因組的目的基因；
3)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的禽巴氏桿菌基因組進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物A放在已稱重的1. 5ml離心管a中，稱取1. 5ml離心管a的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然后將1. 5ml離心管a中的混合物A搗碎，加入與混合物 A等體積的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管a放置在50° C水浴中加熱至混合物 A完全融解，得到混合液I，將混合液I加入到DNA純化柱a上，DNA純化柱a位于收集管a 中，將收集管a置于21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a在21 °C條件下放置1分鐘，后將收集管a送入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，將DNA純化柱a 置于收集管a內(nèi)，再將收集管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA 純化柱a將其放置于1. 5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30微升洗脫液，將1. 5ml 離心管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出 DNA純化柱a得到1. 5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切并純化后的禽巴氏桿菌基因組，存儲(chǔ)于_20°C條件下，備用；
步驟三、真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)的酶切、回收、純化及去磷酸化
1)酶切體系的配制在0.2毫升離心管a中加入50微升的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)、 10微升的限制性內(nèi)切酶BamH I、10微升的10倍的限制性內(nèi)切酶BamH I緩沖液和30微升的水，混合均勻，得到的混合物B，將上述混合物B放入37° C的水浴鍋中，反應(yīng)7小時(shí)，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物B進(jìn)行檢測
稱取0. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5微升的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5微升的混合物B和2微升DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物B中含有酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1⑴；
3)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將混合物B從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物B放在已稱重的1. 5ml離心管c中，稱取1. 5ml離心管c的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物B的重量，然后將1. 5ml離心管c中的混合物B搗碎，加入等體積的 DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管c放置在50° C水浴中加熱至混合物B完全融解，得到混合液II，將混合液II加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中，收集管b在21°C條件下放置1分鐘，將將收集管b放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，后將收集管b在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管b放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的 DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，然后將收集管b放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱b上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管d在21°C條件下放置 1分鐘，然后將收集管b放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b 得到1. 5ml離心管中d中的液體，該液體就是酶切并純化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)，
4)真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)的去磷酸化
取步驟3)中酶切并回收后的真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)40微升并加到0. 5毫升離心管b中，然后再在0. 5毫升離心管b中加入5微升的10倍小牛小腸堿性磷酸酶緩沖液、2 微升的小牛小腸堿性磷酸酶和3微升的水，混合均勻，得到混合物C，將含有混合物C的0. 5 毫升離心管b放在37°C的水浴鍋中，放置30分鐘，然后在0. 5毫升離心管b中加入100微升的無水乙醇，混合均勻，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，離心后倒掉 0. 5毫升離心管b內(nèi)沉淀物上層的液體，再向0. 5毫升離心管b中加入15微升的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，得到去磷酸化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)， 存儲(chǔ)于-20°C條件下，備用；
步驟四、禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備
1)禽巴氏桿菌基因組與真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)的連接
在1. 5ml離心管e中依次加入6微升純化后的禽巴氏桿菌基因組、10微升的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+),2微升的T4 DNA連接酶和2微升的10倍T4DNA連接酶緩沖液，混合均勻，得到的混合物D，將上述含有混合物D的1. 5ml離心管e放入16°C的水浴鍋中，反應(yīng)12 小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，取出備用；
2)將大腸桿菌JM83菌株放置在0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，備用；
3)取步驟2)中100微升的大腸桿菌JM83，將其加到含有混合物D的1.5ml離心管e 中，混合均勻，得到混合物E，將含有混合物E的1. 5ml離心管e置于0° C的冰水混合物中， 放置5分鐘，取120微升的混合物E加到0° C的電擊杯內(nèi)，將電擊杯放到電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，進(jìn)行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1. 8千伏，電阻為200歐姆，電擊時(shí)間為0. 05秒，電擊結(jié)束后，取出含有混合物E的電擊杯，然后在電擊杯內(nèi)加入1毫升的SOC培養(yǎng)基，混合均勻，得到混合物F，將電擊杯內(nèi)的混合物F轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管f中，將1. 5ml離心管f置于37° C的搖床中，轉(zhuǎn)速225轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)為1小時(shí)，待培養(yǎng)結(jié)束后，取出，取100微升培養(yǎng)后的混合物F，并涂布于含有濃度為60微克/毫升的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，將涂布后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基置于37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)16小時(shí)，備用；
4)挑取培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入30毫升含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的濃度為60微克/毫升，后將含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基置于37° C恒溫?fù)u床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，形成培養(yǎng)液，備用；
5)取1.0毫升的培養(yǎng)液，將其加到1. 5ml離心管g中，將1. 5ml離心管g放入4°C離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄去1. 5ml離心管g中沉淀物上層的液體，在 1. 5ml離心管g中加入100微升4° C的溶液I，均勻混合后，加入200微升的溶液II，混合均勻，將1. 5ml離心管g在21°C條件下放置4分鐘，然后向1. 5ml離心管g中加入150微升4° C的溶液III，混合均勻，后將1. 5ml離心管g放于0°C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C的條件下離心10分鐘，取出，備用；
6)取1.5ml離心管g中的上層澄清液體400微升，將其加到1. 5ml離心管h中，然后依次向1. 5ml離心管h中加入200微升的苯酚和200微升的氯仿，振蕩混勻后，得到混合液 III，將含有混合液III的1. 5ml離心管h放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400微升將其轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管i中，后向 1. 5ml離心管i中加入400微升氯仿，振蕩混勻后，得到混合液IV，將含有混合液IV的1. 5ml 離心管i放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400微升將其轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管j中，再向1. 5ml離心管j中加入1毫升的無水乙醇，將1.5ml離心管j置于21°C條件下，放置30分鐘，后取出放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，棄去1. 5ml離心管j中沉淀物上層的液體，得到下部沉淀物I，備用；
7)向含有沉淀物I的1.5ml離心管j中加入500微升濃度70%的乙醇，混合均勻，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，倒掉1. 5毫升離心管j中沉淀物上層的液體，得到沉淀物 II，待1. 5毫升離心管j中的沉淀物II干燥后，向含有沉淀物II的1. 5毫升離心管j中加入 20微升的PBS溶液，濃度為0.01 mmol/L，pH值為7.2，進(jìn)行溶解，得到混合液乂，備用；
8)在1.5毫升離心管k中加入3微升混合液V、1微升的限制性內(nèi)切酶EcoR I、1微升的10倍限制性內(nèi)切酶EcoR I緩沖液和6微升的水，混合均勻，將1. 5毫升離心管k放置于 37°C水浴鍋內(nèi)，放置2小時(shí)，形成混合液VI，即得到禽巴氏桿菌基組疫苗，備用；9)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合液VI進(jìn)行檢測
稱取0. 25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中， 在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5微升的混合液VI和2微升DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到6000bp的條帶時(shí)，即得到禽巴氏桿菌基組疫苗； 步驟五、動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
取1日齡的未經(jīng)過免疫的雛雞50只，每日按正常日糧飼養(yǎng)，4周齡時(shí)隨機(jī)分為2組，每組25只，即免疫組和對(duì)照組，分別對(duì)免疫組和對(duì)照組的試驗(yàn)雞群采用大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射的方法進(jìn)行免疫，共分三次免疫，第一次免疫時(shí)間為4周齡，第二次免疫時(shí)間為6周齡，第三次免疫時(shí)間為8周齡，每次免疫的劑量200微升/只，取濃度為0. Olmmol/L的禽巴氏桿菌基因組疫苗對(duì)免疫組進(jìn)行免疫，取濃度為0. 01mmol/L, pH值為7. 2的1倍PBS溶液對(duì)對(duì)照組進(jìn)行免疫；
步驟六、動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)
當(dāng)免疫組和對(duì)照組的試驗(yàn)雞群達(dá)到10周齡時(shí)，分別對(duì)免疫組和對(duì)照組進(jìn)行肌肉注射禽多殺性巴氏桿菌，進(jìn)行攻毒，攻毒劑量按每只雞注射2X IO9個(gè)禽多殺性巴氏桿菌，攻毒之后，對(duì)免疫組和對(duì)照組的試驗(yàn)雞群繼續(xù)飼養(yǎng)15天，記錄兩組雞在攻毒15天后的存活量，并計(jì)算出免疫組和對(duì)照組的保護(hù)率，保護(hù)率越高說明免疫預(yù)防效果越好，說明利用本發(fā)明的方法制備的禽巴氏桿菌基因組疫苗具有免疫預(yù)防效果； 試驗(yàn)組的保護(hù)率的計(jì)算方法如下 (免疫組的雞在攻毒15天后仍然存活的數(shù)量/20) X 100% 對(duì)照組的保護(hù)率的計(jì)算方法如下 (對(duì)照組的雞在攻毒15天后仍然存活的數(shù)量/20) X 100%
結(jié)果顯示，免疫組的雞在攻毒15天后存活15只，免疫組的保護(hù)率為75% ；對(duì)照組的雞在攻毒15天后全部死亡，對(duì)照組的保護(hù)率為0%，說明利用本發(fā)明的方法制備出的禽巴氏桿菌病基因組疫苗給雞進(jìn)行三次免疫之后能使被免疫雞獲得免疫保護(hù)，有效地預(yù)防禽巴氏桿菌??；
在上述禽巴氏桿菌基組疫苗的雙酶切瓊脂糖凝膠檢測電泳圖中，Marker為5000bp，檢測樣品為雙酶切后的禽巴氏桿菌基組疫苗檢測片段為6000bp ；
在本發(fā)明中所述的禽巴氏桿菌基因組為普通未變異禽巴氏桿菌菌株，通過實(shí)驗(yàn)室提取或市場購買均能得到；
所述的載體為真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)；
所述的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；
所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；
所述胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中含有1. 5%的胰蛋白胨，0. 5%的大豆蛋白胨，0. 5%的氯化鈉，余量為水；
所述SOC培養(yǎng)基組成成份按重量百分比SOC培養(yǎng)基中含有m的胰化蛋白胨、ο. 5%的酵母提取物、0. 05%的氯化鈉、0. 0 濃度為2. 5mmol/L的氯化鉀、0. 1%濃度為10 mmol/L的氯化鎂、0. 36%濃度為20mmol/L的葡萄糖，余量為水；
所述PBS溶液組成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化鈉、0. 024%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 144%的磷酸氫二鈉，余量為水；
所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述電泳緩沖液的組成成份每升電泳緩沖液中含有40mmol的Tris堿、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的溶液I的組成成份每升溶液I中含有50 mmol的葡萄糖、25 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的溶液II的組成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%濃度為lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；
所述的溶液III的組成成份按重量百分比溶液III中含有60%的濃度5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水；
所述十六烷基三甲基溴化銨/氯化鈉溶液的組成成分按重量百分比十六烷基三甲基溴化銨/氯化鈉溶液中含有10%十六烷基三甲基溴化銨，4. 1%氯化鈉，余量為水；
所述酚、氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比酚、氯仿和異戊醇混合液中含有 25份的酚，對(duì)份的氯仿和1份的戊醇。
權(quán)利要求
1. 一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法，其特征在于，其具體步驟為步驟一、禽巴氏桿菌的提取1)取0.1毫升的禽巴氏桿菌，將其接種到10毫升的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在 37°C條件下，培養(yǎng)18小時(shí)，形成菌液，備用；2)從步驟1)的菌液中提取禽巴氏桿菌基因組，將得到的禽巴氏桿菌基因組放置在-20°C條件下，備用；步驟二、禽巴氏桿菌基因組的酶切、回收及純化1)酶切體系的配制在0.5ml離心管a中加入42. 5微升的禽巴氏桿菌基因組、2. 5微升的限制性內(nèi)切酶Sau3A I和5微升的10倍限制性內(nèi)切酶Sau3A I緩沖液，混合均勻，得到50微升的混合物A，將上述含有混合物A的0. 5ml離心管a放在溫度為37° C的水浴鍋中，放置4分鐘，取出，再將含有混合物A的0. 5ml離心管a放在溫度為75°C的水浴鍋中，放置30分鐘，取出，冷卻至21°C，備用； 2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物A進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物A，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物A中含有酶切后的禽巴氏桿菌基因組的目的基因；3 )用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的禽巴氏桿菌基因組進(jìn)行回收、純化取1. 5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物A放在已稱重的1. 5ml離心管a中，稱取1. 5ml離心管a的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然后將1. 5ml離心管a中的混合物A搗碎，加入與混合物 A等體積的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管a放置在50° C水浴中加熱至混合物 A完全融解，得到混合液I，將混合液I加入到DNA純化柱a上，DNA純化柱a位于收集管a 中，將收集管a置于21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a在21°C 條件下放置1分鐘，后將收集管a送入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a中的液體后，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，再將收集管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a將其放置于1. 5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30微升洗脫液， 將1. 5ml離心管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a得到1. 5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切并純化后的禽巴氏桿菌基因組，存儲(chǔ)于-20°C條件下，備用；步驟三、真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)的酶切、回收、純化及去磷酸化 1)酶切體系的配制在0.2毫升離心管a中加入50微升的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、 10微升的限制性內(nèi)切酶BamH I、10微升的10倍的限制性內(nèi)切酶BamH I緩沖液和30微升的水，混合均勻，得到的混合物B，將上述混合物B放入37° C的水浴鍋中，反應(yīng)7小時(shí)，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物B進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物B中含有酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)；3)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)進(jìn)行回收、純化取1. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將混合物B從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物B放在已稱重的1. 5ml離心管c中，稱取1. 5ml離心管c的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物B的重量，然后將1. 5ml離心管c中的混合物B搗碎，加入等體積的 DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管c放置在50° C水浴中加熱至混合物B完全融解，得到混合液II，將混合液II加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中，收集管b在21°C條件下放置1分鐘，將將收集管b放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，后將收集管b在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管b放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的 DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內(nèi)的液體，將DNA純化柱b置于收集管b內(nèi)，然后將收集管b放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱b上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管d在21°C條件下放置 1分鐘，然后將收集管b放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b 得到1. 5ml離心管中d中的液體，該液體就是酶切并純化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)，4)真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)的去磷酸化取步驟3)中酶切并回收后的真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)40微升并加到0. 5毫升離心管b中，然后再在0. 5毫升離心管b中加入5微升的10倍小牛小腸堿性磷酸酶緩沖液、2 微升的小牛小腸堿性磷酸酶和3微升的水，混合均勻，得到混合物C，將含有混合物C的0. 5 毫升離心管b放在37°C的水浴鍋中，放置30分鐘，然后在0. 5毫升離心管b中加入100微升的無水乙醇，混合均勻，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，離心后倒掉 0. 5毫升離心管b內(nèi)沉淀物上層的液體，再向0. 5毫升離心管b中加入15微升的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，得到去磷酸化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)， 存儲(chǔ)于-20°C條件下，備用；步驟四、禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備1)禽巴氏桿菌基因組與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的連接在1. 5ml離心管e中依次加入6微升純化后的禽巴氏桿菌基因組、10微升的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+),2微升的T4 DNA連接酶和2微升的10倍T4DNA連接酶緩沖液，混合均勻，得到的混合物D，將上述含有混合物D的1. 5ml離心管e放入16°C的水浴鍋中，反應(yīng)12 小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，取出備用；2)將大腸桿菌JM83菌株放置在0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，備用；3)取步驟2)中100微升的大腸桿菌JM83，將其加到含有混合物D的1.5ml離心管e 中，混合均勻，得到混合物E，將含有混合物E的1. 5ml離心管e置于0°C的冰水混合物中， 放置5分鐘，取120微升的混合物E加到0° C的電擊杯內(nèi)，將電擊杯放到電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，進(jìn)行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1. 8千伏，電阻為200歐姆，電擊時(shí)間為0. 05秒，電擊結(jié)束后，取出含有混合物E的電擊杯，然后在電擊杯內(nèi)加入1毫升的SOC培養(yǎng)基，混合均勻，得到混合物F，將電擊杯內(nèi)的混合物F轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管f中，將1. 5ml離心管f置于37° C的搖床中，轉(zhuǎn)速225轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)為1小時(shí)，待培養(yǎng)結(jié)束后，取出，取100微升培養(yǎng)后的混合物F，并涂布于含有濃度為60微克/毫升的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，將涂布后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基置于37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)16小時(shí)，備用；4)挑取培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入30毫升含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的濃度為60微克/毫升，后將含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基置于37° C恒溫?fù)u床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，形成培養(yǎng)液，備用；5)取1.0毫升的培養(yǎng)液，將其加到1. 5ml離心管g中，將1. 5ml離心管g放入4°C離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄去1. 5ml離心管g中沉淀物上層的液體，在 1. 5ml離心管g中加入100微升4° C的溶液I，均勻混合后，加入200微升的溶液II，混合均勻，將1. 5ml離心管g在21°C條件下放置4分鐘，然后向1. 5ml離心管g中加入150微升4° C的溶液III，混合均勻，后將1. 5ml離心管g放于0°C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取出，備用；6)取1.5ml離心管g中的上層澄清液體400微升，將其加到1. 5ml離心管h中，然后依次向1. 5ml離心管h中加入200微升的苯酚和200微升的氯仿，振蕩混勻后，得到混合液 III，將含有混合液III的1. 5ml離心管h放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400微升將其轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管i中，后向 1. 5ml離心管i中加入400微升氯仿，振蕩混勻后，得到混合液IV，將含有混合液IV的1. 5ml 離心管i放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400微升將其轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管j中，再向1. 5ml離心管j中加入1毫升的無水乙醇，將1. 5ml離心管j置于21° C條件下，放置30分鐘，后取出放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，棄去1. 5ml離心管j中沉淀物上層的液體，得到下部沉淀物I，備用；7)向含有沉淀物I的1.5ml離心管j中加入500微升濃度70%的乙醇，混合均勻，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，倒掉1. 5毫升離心管j中沉淀物上層的液體，得到沉淀物 II，待1. 5毫升離心管j中的沉淀物II干燥后，向含有沉淀物II的1. 5毫升離心管j中加入 20微升的PBS溶液，濃度為0.01 mmol/L，pH值為7.2，進(jìn)行溶解，得到混合液乂，備用；8)在1.5毫升離心管k中加入3微升混合液V、1微升的限制性內(nèi)切酶EcoR I、1微升的10倍限制性內(nèi)切酶EcoR I緩沖液和6微升的水，混合均勻，將1. 5毫升離心管k放置于 37°C水浴鍋內(nèi)，放置2小時(shí)，形成混合液VI，即得到禽巴氏桿菌基組疫苗，備用；9)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合液VI進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合液VI，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到6000bp的條帶時(shí)，證明禽巴氏桿菌基組疫苗制備成功；所述的載體為真核表達(dá)載體PCDNA3. 1(+)；所述的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中含有1. 5%的胰蛋白胨，0. 5%的大豆蛋白胨，0. 5%的氯化鈉，余量為水；所述SOC培養(yǎng)基組成成份按重量百分比SOC培養(yǎng)基中含有m的胰化蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、0. 05%的氯化鈉、0. 0 濃度為2. 5mmol/L的氯化鉀、0. 1%濃度為10 mmol/L的氯化鎂、0. 36%濃度為20mmol/L的葡萄糖，余量為水；所述PBS溶液組成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化鈉、0. 024%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 144%的磷酸氫二鈉，余量為水；所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述電泳緩沖液的組成成份每升電泳緩沖液中含有40mmol的Tris堿、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的洗脫液的組成成份按重量百分比洗脫液中含有40%的濃度lOmol/L的乙酸鈉、 8. 5%的冰醋酸，余量為水；所述的溶液I的組成成份每升溶液I中含有50 mmol的葡萄糖、25 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的溶液II的組成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%濃度為lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的溶液III的組成成份按重量百分比溶液III中含有60%的濃度5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水。
全文摘要
一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法，利用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ對(duì)目的基因進(jìn)行酶切，利用限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行酶切，利用小牛小腸堿性磷酸酶對(duì)酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行去磷酸化，后將禽巴氏桿菌基因組和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)JM83中，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后獲得禽巴氏桿菌基因組疫苗；本發(fā)明方法所制備出的禽巴氏桿菌基因組疫苗通過動(dòng)物試驗(yàn)檢測表明，可降低禽巴氏桿菌病的發(fā)生，降低禽巴氏桿菌對(duì)禽類侵襲，其制作方法簡單，容易操作。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102397560SQ20111035914
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者孫軍杰, 孫曉菲, 宮強(qiáng), 張愛國, 曲寧, 牛明福, 程茗 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)