專利名稱：一種治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用制劑領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種治療惡性膠質(zhì)瘤的納米制劑。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近來(lái)研究表明，膠質(zhì)瘤是血管依賴性腫瘤，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和侵襲過程中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的高表達(dá)整合素(ΙΝΤανβ3)，且表達(dá)強(qiáng)度隨著腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而明顯增強(qiáng)。在腫瘤誘導(dǎo)的新生血管組織中，表達(dá)豐富的ΙΝΤα νβ3對(duì)腫瘤血管的生成起重要作用，參與大部分惡性膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲。在正常腦組織及顱外組織雖然有 ΙΝΤανβ3的表達(dá)，但表達(dá)量很低。RGD多肽作為整合素和其配體相互作用的識(shí)別位點(diǎn)，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互黏附，以及細(xì)胞與ECM之間的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵性的作用，調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移以及調(diào)亡。通過競(jìng)爭(zhēng)整合素識(shí)別位點(diǎn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞與ECM的相互作用、阻斷血管上皮細(xì)胞增殖的信使傳遞、終止細(xì)胞增殖、抑制腫瘤新生血管的形成、阻止腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲性生長(zhǎng)。此外，高濃度的RGD 肽可通過與細(xì)胞內(nèi)procaspase- 3自身含有的一個(gè)潛在RGD結(jié)合序列即Asp- Asp-Met (DDM)之間的相互作用，引發(fā)procaspase- 3構(gòu)象改變，從而激活caspase- 3，直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。但由于大多數(shù)線性RGD長(zhǎng)肽難以跨越血腦屏障，局部劑量過低，而RGD短肽及短環(huán)肽循環(huán)半衰期短，易于清除，難以到達(dá)治療腦腫瘤的效果。因此，目前RGD肽僅能用于制備腦腫瘤顯影劑，而在腦腫瘤的治療方面，國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。載藥納米微粒是納米技術(shù)與現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，是一種藥物控釋和緩釋的新劑型。它包括納米粒子(nanopart icales)和納米膠囊(nanocap su Ies)，是直徑在 10 500nm之間的固狀膠態(tài)粒子，活性部分(藥物、生物活性材料等)通過溶解、包裹作用位于粒子內(nèi)部，或者通過吸附、附著作用位于粒子表面。自1976年BirrerAach首次報(bào)道載藥納米微粒以來(lái)，納米微粒作為藥物緩釋和靶向載體已被廣泛地運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。 其中，聚離子膠束由于可在水溶液中進(jìn)行載藥，避免了有機(jī)溶劑的使用，受到廣泛關(guān)注。聚離子膠束的穩(wěn)定性受膠束本身化學(xué)組成及其所處環(huán)境等各種因素的影響。通過對(duì)聚離子膠束的交聯(lián)，可以提高有效提高聚離子膠束的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束在制備治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種聚天冬氨酸離子復(fù)合物在制備治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物中作為載體的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，公開以下技術(shù)方案一種治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物，所述藥物為RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束。所述聚天冬氨酸離子復(fù)合物為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，公開以下技術(shù)方案治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物的制備方法，包括以下步驟
(a)制備端基為馬來(lái)酰亞胺基及胺基的聚乙二醇Mal-PEG-NH2；
(b)制備聚乙二醇接枝聚琥珀酰亞胺PEG-g-PSI；
(c)制備聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA；
(d)制備PEG-g-PAsp ；
(e)制備聚天冬氨酸基聚離子膠束PIC及其交聯(lián)；
(f)制備RGD - PIC0其中，(a)端基為馬來(lái)酰亞胺基及胺基的聚乙二醇的(Mal-PEG-NH2)的制備 由于Mal-PEG-OH的端羥基具有一定活性，利用％ 二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)活化 Mal-PEG-OH為中間體Mal_PEG_SC，再利用過量的乙二胺取代SC直接得到Mal-PEG-NH2,反應(yīng)方程式如圖1所示。(b)聚乙二醇接枝聚琥珀酰亞胺(PEG-g-PSI)的制備利用Mal-PEG-NH2與聚琥珀酰亞胺開環(huán)反應(yīng)，制備了兩種分別帶正、負(fù)電荷的帶有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp，反應(yīng)過程示意圖如圖2所示。(c)聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA的制備PEG-g_PSI分散于少量水中，磁力攪拌 10 min ；冰浴下緩慢滴加氫氧化鈉水溶液至PEG-g-PSI溶液中，滴加完畢后，在常溫下反應(yīng) 6 h ；反應(yīng)結(jié)束后，加入0. 1 M HCl調(diào)節(jié)溶液pH值到中性；透析，冷凍干燥得到白色固體粉末 PEG-g-PAsp ；紅外測(cè)試分析產(chǎn)物的基團(tuán)改變情況。(d)PEG-g-PAsp 的制備1 g PEG-g-PSI 溶于 10 mL DMF ；將溶液緩慢滴加到 5 mL 乙二胺中，在常溫下反應(yīng)8 h ；反應(yīng)結(jié)束后，用無(wú)水乙醚沉淀，得到淺黃色固體粉末；再無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，除去過量的乙二胺；最后產(chǎn)物在40 °(真空干燥M h，得到淺黃色固體粉末 PEG-^-PDEA ；紅外測(cè)試分析產(chǎn)物的基團(tuán)改變情況。(e)聚天冬氨酸基聚離子膠束的制備及其交聯(lián)
(1)PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp分別溶于pH值為7. 4的磷酸緩沖液中，PEG-g-PDEA和 PEG-g-PAsp與磷酸緩沖液的摩爾比為1 :2 ；
(2)磁力攪拌下將PEG-g-PAsp溶液緩慢滴加到PEG-g-PDEA溶液中，PEG-g-PAsp溶液與PEG-g-PDEA溶液的摩爾比為1:1;
(3)繼續(xù)攪拌半小時(shí)，用0.45 μ m水相濾膜過濾；
(4)濾液在攪拌條件下，緩慢加入80-120μ 1 2. 5%戊二醛水溶液；
(5)常溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，用0.45 μ m水相濾膜過濾，得到端基馬來(lái)酰亞胺化聚天冬氨酸基聚離子膠束Mal-PIC。
5
(f)R⑶一 PIC的制備步驟(e)獲得的Mal-PIC與C (RGDfC)五環(huán)肽按照馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)巰基為摩爾比3:1混合，避光磁力攪拌反應(yīng)過夜；反應(yīng)后的溶液過1.5 X 20 cm, Sepharose CL-4B柱除去未結(jié)合的C (RGDfC)；用0. 01 mol/L pH值為7. 4的PBS緩沖液洗脫，收集白色的RGD-PIC混懸液。其中，步驟(a)、(b)、(C)和(d)均為常規(guī)方法制備。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第三個(gè)目的，公開以下技術(shù)方案一種神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體，所述載體為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物 PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第四個(gè)目的，公開以下技術(shù)方案RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束在制備治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用，所述聚天冬氨酸離子復(fù)合物為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物 PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第五個(gè)目的，公開以下技術(shù)方案聚天冬氨酸離子復(fù)合物在制備治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物中作為載體的應(yīng)用，所述聚天冬氨酸離子復(fù)合物為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和 PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的藥物以RGD多肽為有效成份，以高分子聚合物為載體，靶向治療惡性膠質(zhì)瘤。該納米制劑可以順利透過血腦屏障及血腫瘤屏障，將RGD靶向聚集于腦內(nèi)膠質(zhì)瘤，特異性的引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，由于不含有其他藥物成分，本納米制劑沒有其他毒副作用，且對(duì)于瘤周正常組織沒有影響。本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單易行， 原料易得，制備過程重復(fù)性好，制得的納米膠束穩(wěn)定性良好，可以在不同的PH及鹽濃度下穩(wěn)定存在，且不破壞RGD多肽的結(jié)構(gòu)和功能，可以很好的保障RGD的生物學(xué)活性，有效治療惡性膠質(zhì)瘤。


圖1為Mal-PEG_NH2的合成示意圖。圖2為聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp的合成示意圖。圖3為c (RGDfC)五環(huán)肽結(jié)構(gòu)式。圖4為DLS測(cè)試RGD-PIC在不同PH值環(huán)境下的相對(duì)光強(qiáng)值。圖5為R⑶一 PIC對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞生存率的影響。圖6為不同濃度的RGD-PIC對(duì)于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率的影響。圖7為使用不同劑量的RGD-PIC分別處理大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 后，MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，實(shí)施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。
實(shí)施例1、RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束RGD — PIC的制備1
在IOOmL圓底燒瓶中，加入IOg (5mmol)Mal-PEGn，用40mL重蒸的DMF溶解得到無(wú)色透明溶液，磁力攪拌下迅速加入7. 68g(12mmol)三乙胺，冰乙醚和60°C除水甲苯純化后得到白色固態(tài)帶有Mal基團(tuán)的聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(PE&i-SC)。在50ml圓底燒瓶中加入IOmL除水二氯甲烷、3. 06mL(46mmol)乙二胺，IOmL除水二氯甲烷溶解的5g(2. 3mmol) PE&i-SC，常溫反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后過濾、沉淀重結(jié)晶，40°C干燥Mh，最后得到白色固態(tài)端基為馬來(lái)酰亞胺基及胺基化聚乙二醇(MAL-PEGn-NH2)4g，產(chǎn)率為80%，(n = 1000^50000) 0150mL三頸瓶中加入IOg L-天冬氨酸，0.89g磷酸(85%)，9.5g環(huán)丁砜與22g 1，3，5-三甲苯。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下升高溫度，180°C回流4. ^！。反應(yīng)結(jié)束后過濾，分離，丙酮洗滌3次除去表面的環(huán)丁砜和1，3，5-三甲苯，適量的DMF溶解，過濾除去未反應(yīng)的L-天冬氨酸，去離子水沉淀，抽濾，離心洗滌，產(chǎn)物60°C真空干燥M小時(shí)，得到白色固態(tài)聚琥珀酰亞胺(PSI)。IOmLDMF分別溶解一定量MAL_PEGn_NH2、PSI，60°C磁力攪拌8h，冰乙醚沉淀、THF 洗滌，除去未反應(yīng)的MAL-PE&1-NH2，最終產(chǎn)物在真空下40°C干燥Mh，得到白色固態(tài)端基馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇接枝聚琥珀酰亞胺(MAL-PEG-g-PSI)，取Ig分散在IOmL水，磁力攪拌lOmins，冰浴下緩慢滴加5g20%氫氧化鈉水溶液，滴加完畢后，在常溫下反應(yīng)他，此后加入0. IMHCl調(diào)節(jié)溶液pH值到中性，用MWCO 3500透析上述溶液4 后，冷凍干燥得到端基馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇接枝聚天冬氨酸(MAL-PEG-g-PAsp)。另取Ig分散于IOmLDMF 中，加入5mL乙二胺，，反應(yīng)他后，無(wú)水乙醚沉淀，無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)過量的乙二胺，最后產(chǎn)物在40°C干燥Mh，得到端基馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇接枝聚乙二胺基天冬酰胺 (MAL-PEG-g-PDEA)。各稱取 5mMPEG-g_PDEA 及 PEG-g-PAsp，溶解于 IOmLlOmM 的磷酸緩沖液(pH=7. 4)磁力攪拌，過濾，緩慢加入一定量戊二醛(2. 5%水溶液)，繼續(xù)常溫?cái)嚢?h，濾膜過濾得端基馬來(lái)酰亞胺化聚天冬氨酸基聚離子膠束(Mai PIC)0Mal-PIC與C(RGDfC)按照馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)/巰基=3 / 1混合，避光磁力攪拌反應(yīng)過夜；反應(yīng)后的溶液過1. 5 X 20 cm, Sepharose CL-4B柱除去未結(jié)合的C(RGDfC)；用 0. 01 mol/L PBS緩沖液(pH 7. 4)洗脫，收集白色的RGD-PIC混懸液。實(shí)施例2、RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束RGD — PIC的制備2
在IOOmL圓底燒瓶中，加入IOg (5mmo 1) Ma 1 -PEGn,用40mL重蒸的DMF溶解得到無(wú)色透明溶液，磁力攪拌下迅速加入8. 35mL(24mmol)三乙胺，反應(yīng)結(jié)束后，反復(fù)通過冰乙醚和60°C 除水甲苯純化后得到白色固態(tài)帶有Mal基團(tuán)的PEGn-SC。在50ml圓底燒瓶中加入IOmL除水二氯甲烷、3. 06mL(46謹(jǐn)ol)乙二胺，IOmL除水二氯甲烷溶解的5g (2. 3謹(jǐn)ol) PEGn-SC，常溫反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后過濾、沉淀重結(jié)晶，40°C干燥Mh，最后得到白色固態(tài)端基為馬來(lái)酰亞胺基及胺基化聚乙二醇(MAL-PEGn-NH2)4g，產(chǎn)率為80%，(n = 1000^50000) 0150mL三頸瓶中加入IOg L-天冬氨酸，0.89g磷酸(85%)，9.5g環(huán)丁砜與22g 1，3，5-三甲苯。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下升高溫度，180°C回流4. ^！。反應(yīng)結(jié)束后過濾，分離，丙酮洗滌3次除去表面的環(huán)丁砜和1，3，5-三甲苯，適量的DMF溶解，過濾除去未反應(yīng)的L-天冬氨酸，去離子水沉淀，抽濾，離心洗滌，產(chǎn)物60°C真空干燥M小時(shí)，得到白色固態(tài)聚琥珀酰亞胺(PSI)。IOmLDMF分別溶解一定量MAL_PEGn_NH2、PSI，60°C磁力攪拌8h，冰乙醚沉淀、THF洗滌，除去未反應(yīng)的MAL-PE&1-NH2，最終產(chǎn)物在真空下40°C干燥Mh，得到白色固態(tài)端基馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇接枝聚琥珀酰亞胺(MAL-PEG-g-PSI)，取Ig分散在IOmL水，磁力攪拌lOmins，冰浴下緩慢滴加5g20%氫氧化鈉水溶液，滴加完畢后，在常溫下反應(yīng)他，此后加入0. IMHCl調(diào)節(jié)溶液pH值到中性，用MWCO 3500透析上述溶液4 后，冷凍干燥得到端基馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇接枝聚天冬氨酸(MAL-PEG-g-PAsp)。另取Ig分散于IOmLDMF 中，加入5mL乙二胺，，反應(yīng)他后，無(wú)水乙醚沉淀，無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)過量的乙二胺，最后產(chǎn)物在40°C干燥Mh，得到端基馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇接枝聚乙二胺基天冬酰胺 (MAL-PEG-g-PDEA)。各稱取 5mMPEG-g_PDEA 及 PEG-g-PAsp，溶解于 IOmLlOmM 的磷酸緩沖液(pH=7. 4)磁力攪拌，過濾，緩慢加入一定量戊二醛(2. 5%水溶液)，繼續(xù)常溫?cái)嚢?h，濾膜過濾得端基馬來(lái)酰亞胺化聚天冬氨酸基聚離子膠束(Mai PIC)0Mal-PIC與C(RGDfC)按照馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)/巰基=3 / 1混合，避光磁力攪拌反應(yīng)過夜；反應(yīng)后的溶液過1. 5 X 20 cm, Sepharose CL-4B柱除去未結(jié)合的C(RGDfC)；用 0. Ol mol/L PBS緩沖液(pH 7. 4)洗脫，收集白色的RGD-PIC混懸液。實(shí)施例3、R⑶一 PIC的穩(wěn)定性試驗(yàn)
如圖4所示，我們研究了在不同PH值環(huán)境下的RGD-PIC溶液的穩(wěn)定情況，所選取的pH 值范圍是6. 5-12，在PB緩沖液中制備得到聚離子膠束溶液，調(diào)節(jié)不同的pH，用動(dòng)態(tài)光散射儀DLS進(jìn)行測(cè)試，對(duì)不同pH下溶液的光強(qiáng)進(jìn)行研究，選取最大光強(qiáng)處為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，用相對(duì)光強(qiáng)最為研究對(duì)象?？梢钥吹疆?dāng)pH>8. 5時(shí)，DSL測(cè)得的RGD-PIC的相對(duì)光強(qiáng)值減弱，為66. 73%, 并隨著PH的升高而減小，說明聚離子膠束不穩(wěn)定。當(dāng)pH值達(dá)到中性時(shí)(7 — 8)，RGD-PIC的相對(duì)光強(qiáng)值保持在90%以上。表明RGD - PIC的穩(wěn)定性在體液環(huán)境下幾乎不會(huì)受體液PH 值的影響。 實(shí)施例4、R⑶一 PIC的生物相容性試驗(yàn)
細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果提示，本發(fā)明對(duì)于大鼠神經(jīng)元、大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞、大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞、人腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞均有良好的生物相容性。對(duì)于大鼠神經(jīng)元生存率的檢測(cè)如圖5所示。大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)7天后隨機(jī)分為12組，分別給予Oumol/ml，50 umol/ ml, 150 umol/ml, 300 umol/ml 的 PIC，c (RGDfC)及 RGD-PIC 處理 4 小時(shí)，MTT 法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞生存率。其中，PIC為陰性對(duì)照組，c(RGDfC)為陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果顯示，各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞生存率無(wú)顯著性差異。實(shí)施例5、RGD — PIC的藥用效果試驗(yàn)
本發(fā)明對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞有殺傷作用，結(jié)果如圖6所示。培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87。隨機(jī)分為 12 組，分別給予 0umol/ml, 50 umol/ml, 150 umol/ml, 300 umol/ml 的 PIC, c (RGDfC)及 RGD-PIC處理4小時(shí)，PIC為陰性對(duì)照組，c (RGDfC)為陽(yáng)性對(duì)照組。MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存率。結(jié)果顯示RGD-PIC處理組膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率較PIC組有顯著差異，且存在劑效關(guān)系。大劑量組較小劑量組效果更好。由圖7可知，使用不同劑量的RGD-PIC分別處理大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87后，MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存率。結(jié)果顯示，相同劑量的RGD-PIC處理的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞和U87細(xì)胞生存率差異明顯。RGD-PIC對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用，而對(duì)于正常神經(jīng)元細(xì)胞的生存率沒有什么影響。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人
8員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物，其特征在于，所述藥物為RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物，其特征在于，所述聚天冬氨酸離子復(fù)合物為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG 構(gòu)成。
3.權(quán)利要求1所述的治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(a)制備端基為馬來(lái)酰亞胺基及胺基的聚乙二醇Mal-PEG-NH2；(b)制備聚乙二醇接枝聚琥珀酰亞胺PEG-g-PSI；(c)制備聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA；(d)制備PEG-g-PAsp ；(e)制備聚天冬氨酸基聚離子膠束PIC及其交聯(lián)；(f)制備RGD - PIC0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物的制備方法，其特征在于，步驟(e)聚天冬氨酸基聚離子膠束的制備包括以下步驟(1)PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp分別溶于pH值為7. 4的磷酸緩沖液中，PEG-g-PDEA和 PEG-g-PAsp與磷酸緩沖液的摩爾比為1 :2 ；(2)磁力攪拌下將PEG-g-PAsp溶液緩慢滴加到PEG-g-PDEA溶液中，PEG-g-PAsp溶液與PEG-g-PDEA溶液的摩爾比為1:1;(3)繼續(xù)攪拌半小時(shí)，用0.45 μ m水相濾膜過濾；(4)濾液在攪拌條件下，緩慢加入80-120μ 1 2. 5%戊二醛水溶液；(5)常溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，用0.45 μ m水相濾膜過濾，得到端基馬來(lái)酰亞胺化聚天冬氨酸基聚離子膠束Mal-PIC。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物的制備方法，其特征在于，步驟(f) RGD - PIC的制備包括以下步驟步驟(e)獲得的Mal-PIC與C(RGDfC)五環(huán)肽按照馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)巰基為摩爾比3 :1 混合，避光磁力攪拌反應(yīng)過夜；反應(yīng)后的溶液過1.5 X 20 cm, Sepharose CL-4B柱除去未結(jié)合的C(RGDfC)；用0.01 mol/L pH值為7. 4的PBS緩沖液洗脫，收集白色的RGD-PIC混懸液。
6.一種神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體，其特征在于，所述載體為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。
7.RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束在制備治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述聚天冬氨酸離子復(fù)合物為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。
8.聚天冬氨酸離子復(fù)合物在制備治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物中作為載體的應(yīng)用，其特征在于，所述聚天冬氨酸離子復(fù)合物為以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)封端的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物，所述共聚物由聚天冬氨酸衍生物PEG-g-PDEA和PEG-g-PAsp按照摩爾比1 :1通過靜電作用自組裝形成納米粒子，其中負(fù)電性的PAsp與正電性的PDEA靜電吸引形成疏水核，外層由生物相容的親水聚合物PEG構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物，以RGD多肽為有效成份，以聚天冬氨酸離子復(fù)合物為載體，靶向治療惡性膠質(zhì)瘤。該納米制劑可以順利透過血腦屏障及血腫瘤屏障，將RGD靶向聚集于腦內(nèi)膠質(zhì)瘤，特異性的引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單易行，原料易得，制備過程重復(fù)性好，制得的納米膠束穩(wěn)定性良好，可以在不同的pH及鹽濃度下穩(wěn)定存在，且不破壞RGD多肽的結(jié)構(gòu)和功能，可以很好的保障RGD的生物學(xué)活性，有效治療惡性膠質(zhì)瘤。
文檔編號(hào)A61K38/12GK102389573SQ20111036040
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者劉曉英, 洪震, 陳生弟 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院