專利名稱：使用連續(xù)傳代的細(xì)胞系制備新城疫病毒與疫苗的方法及其制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞新城疫病毒與疫苗的方法及其制品，特別是指一種用細(xì)胞系制備雞新城疫病毒與疫苗的方法及其制品。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(NDV)屬于副粘病毒科，是一種新城疫病毒單股負(fù)鏈RNA病毒。新城疫是NDV引起的一種急性敗血性、高度傳染性疾病，死亡率極高，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)危害性極大。防治NDV的措施主要靠疫苗接種，特別是弱毒疫苗的應(yīng)用。目前主要是用雞胚生產(chǎn)NDV疫苗，而用雞胚生產(chǎn)疫苗就有可能使疫苗中污染一些垂直傳播疾病的病原，致使這些疾病隨疫苗的應(yīng)用而發(fā)生傳播。使用異原傳代細(xì)胞制備NDV疫苗，可以避免散播其他疾病的危險(xiǎn)。但是新城疫病毒在上述傳代細(xì)胞中的繁殖不理想，不能實(shí)現(xiàn)新城疫病毒在傳代細(xì)胞中的有 效增殖，因此，目前新城疫病毒與新城疫疫苗的制備依然需要在雞胚中接種并繁殖，而如上所述的雞胚生產(chǎn)病毒與疫苗的缺點(diǎn)則限制了其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒與疫苗的方法，特別是使用常見易培養(yǎng)的細(xì)胞系如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒及疫苗的方法。該方法使用培養(yǎng)病毒的細(xì)胞系是成熟的商業(yè)化的細(xì)胞系，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn)的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，對(duì)新城疫強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。技術(shù)方案因此，本發(fā)明首先提供了一種用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒的方法，包括以下步驟I. 一種用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟I)細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞系經(jīng)消化傳代，以細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，形成生長(zhǎng)良好的細(xì)胞單層；2)病毒接種與吸附將新城疫病毒接種于上述生長(zhǎng)良好的細(xì)胞單層，進(jìn)行病毒吸附；3)細(xì)胞的孵育換用細(xì)胞維持液培養(yǎng)后，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量為維持液的0. 1% v/v)孵育；4)病毒的繁殖將上述孵育劑洗去，重新加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)細(xì)胞系以繁殖新城疫病毒;5)病毒的收獲收獲含有新城疫病毒的培養(yǎng)液。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的步驟2)中接種用的新城疫病毒是使用細(xì)胞系生產(chǎn)的新城
疫病毒。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的新城疫病毒是新城疫病毒Lasota株。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的細(xì)胞系為MDBK細(xì)胞系、VeroE6細(xì)胞系、BHK-21細(xì)胞系、PK-15細(xì)胞系、IBRS-2細(xì)胞系的任意一種或幾種。最優(yōu)選的，本發(fā)明所述的細(xì)胞系為BHK_21細(xì)胞系。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖；更優(yōu)選地，孵育劑為D-氨基葡萄糖。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的細(xì)胞孵育時(shí)間為20-40min，更優(yōu)選地，孵育時(shí)間為30min優(yōu)選的，本發(fā)明所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液的血清含量為1% -7% v/v ;更優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)液的血清含量為5^-6% v/v ;最優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)液的血清含量為6% v/v。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的細(xì)胞維持液為無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法制備的新城疫病毒，所述新城疫病毒為使用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒。本發(fā)明的又一目的在于提供一種用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫疫苗的方法，即使用上述方法獲得的新城疫病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑制備為新城疫疫苗。最后，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述方法制備的新城疫疫苗，由于新城疫病毒為使用細(xì)胞系生產(chǎn)的，因此，所述新城疫疫苗也是使用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫疫苗。由上可以看出，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)在雞新城疫病毒繁殖時(shí)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞孵育可以幫助雞新城疫病毒適應(yīng)細(xì)胞系，特別是通過在生產(chǎn)用毒種和制苗用病毒中均使用孵育劑進(jìn)行孵育，使得用細(xì)胞系繁殖雞新城疫病毒成為了可能，從而實(shí)現(xiàn)了用細(xì)胞系生產(chǎn)雞新城疫疫苗。而在現(xiàn)有技術(shù)中，國(guó)內(nèi)外范圍內(nèi)無論使用MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何種細(xì)胞系，或者使用同步培養(yǎng)、帶毒傳代等方法，都沒有實(shí)現(xiàn)雞新城疫病毒在細(xì)胞系中獲得有效的增殖，并達(dá)到利用細(xì)胞系生產(chǎn)雞新城疫疫苗的目的。其次，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的培養(yǎng)中使用低血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，而在細(xì)胞的孵育和病毒的增殖中換用無血清的細(xì)胞維持液，可以幫助雞新城疫病毒適應(yīng)細(xì)胞系，促進(jìn)病毒在細(xì)胞系的增殖，而在細(xì)胞生長(zhǎng)階段又不影響良好細(xì)胞單層的形成，因此本發(fā)明可以在不對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)整的情況下，進(jìn)行雞新城疫病毒的增殖。最后，本發(fā)明使用細(xì)胞系培養(yǎng)雞新城疫病毒與生產(chǎn)雞新城疫疫苗的方法，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn)的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，對(duì)新城疫強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的雞新城疫疫苗可以替代傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)獲得雞新城疫疫苗，避免了雞胚培養(yǎng)獲得的雞新城疫疫苗可能存在的垂直污染、病毒繁殖工藝受雞胚數(shù)量難以放大等缺點(diǎn)，適合工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)雞新城疫病毒與疫苗。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中使用了常見的商業(yè)化的容易培養(yǎng)的細(xì)胞系，如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2、SK6等細(xì)胞系，生產(chǎn)雞新城疫病毒及疫苗。上述細(xì)胞系均可以在市場(chǎng)上購買，屬于本領(lǐng)域常用的細(xì)胞系。
本發(fā)明實(shí)施例中接種用的雞新城疫病毒，優(yōu)選使用細(xì)胞系生產(chǎn)獲得的雞新城疫病毒；但是使用細(xì)胞系生產(chǎn)的接種用的雞新城疫病毒的目的僅為了提高接種用的雞新城疫病毒的效價(jià)和使得接種用的雞新城疫病毒更適應(yīng)在細(xì)胞中生長(zhǎng)，獲得疫苗的效力更佳。因此，本發(fā)明的接種用雞新城疫病毒并不限于使用經(jīng)細(xì)胞系培養(yǎng)的雞新城疫病毒，其他來源的雞新城疫病毒如組織來源的雞新城疫病毒液也可以用于接種細(xì)胞系生產(chǎn)雞新城疫病毒及疫苗。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)液中血清為胎牛血清，其他的動(dòng)物性血清如兔血清、羊血清等均可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)液，只要其血清含量比常規(guī)使用情況下的血清含量低，使得雞新城疫病毒更容易適應(yīng)在細(xì)胞中的生長(zhǎng)，而又不影響細(xì)胞本身形成良好單層細(xì)胞即可。本發(fā)明的疫苗為新城疫滅活疫苗或活疫苗，其他方法獲得的新城疫疫苗，如，使用弱化病毒制備活疫苗，或使用基因工程方法獲得轉(zhuǎn)基因病毒及疫苗，也可以使用本發(fā)明的細(xì)胞系培養(yǎng)方法制備獲得。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例I SK6細(xì)胞系生產(chǎn)雞新城疫病毒與雞新城疫疫苗本實(shí)施例中，選擇豬腎細(xì)胞系SK6(購自武漢大學(xué)中國(guó)典型微生物保藏中心)作為生產(chǎn)雞新城疫病毒與雞新城疫疫苗的細(xì)胞系，雞新城疫病毒Lasota毒種購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，以下為生產(chǎn)雞新城疫病毒與疫苗的具體步驟I)生產(chǎn)用雞新城疫病毒種的制備使用上述細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)SK6細(xì)胞至形成良好的細(xì)胞單層，接種雞新城疫病毒并進(jìn)行病毒吸附后，換用細(xì)胞維持液培養(yǎng)，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量為維持液的O. 1% v/v)孵育，將上述孵育劑洗去，重新加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液，即獲得生產(chǎn)用雞新城疫病毒種子，具體步驟為將雞新城疫病毒Lasota毒種，接種生長(zhǎng)良好的SK6單層細(xì)胞培養(yǎng)中，37 °C吸附1_2小時(shí)，然后加入細(xì)胞維持液(100% v/vMEM(Invitrogen公司生產(chǎn))液，不添加血清，pH值調(diào)整為7. 3)在37°C中培養(yǎng)。6個(gè)小時(shí)后加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量為維持液的O. 1% v/v)孵育半小時(shí)，后用pH7. 2磷酸鹽緩沖液沖洗三遍，繼續(xù)加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)。逐日觀察記錄，接毒后48-72小時(shí)(或細(xì)胞單層出現(xiàn)較多圓縮細(xì)胞時(shí))收毒，凍融3次后離心于_15°C保存,作為生產(chǎn)用毒種。2)制苗用雞新城疫病毒的制備使用細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞至形成良好的細(xì)胞單層，接種上述生產(chǎn)用雞新城疫病毒毒種并進(jìn)行病毒吸附后，換用細(xì)胞維持液培養(yǎng)，重新加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液，即獲得制苗用雞新城疫病毒，具體步驟為將豬腎SK6細(xì)胞系經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液(90% v/vMEM (Invitrogen公司生產(chǎn))液，9% v/v胎牛血清(PAA公司生產(chǎn))，pH值調(diào)整為7. 3)于37°C繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。將上述細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)良好的SK6細(xì)胞單層，加入含3 % v/v上述步驟獲得的生產(chǎn)用毒種的細(xì)胞維持液，置37°C吸附1-2小時(shí)；吸附病毒后,在SK6細(xì)胞系加入細(xì)胞維持液，在37°C中培養(yǎng)。6個(gè)小時(shí)后棄去細(xì)胞維持液，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量為維持液的O. 1% v/v)半小時(shí)。用pH7. 2磷酸鹽緩沖液沖洗三遍，將上述孵育劑洗去，重新加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)細(xì)胞系，并逐日觀察。接毒后48-72小時(shí)(或細(xì)胞單層出現(xiàn)較多圓縮細(xì)胞時(shí))，即可收獲含有雞新城疫病毒的培養(yǎng)液。凍融3次后離心即可得到雞新城疫病毒液。制苗用雞新城疫病毒液的檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)藥典》(2005年版)附錄進(jìn)行檢驗(yàn)HA效價(jià)及EID5tl的測(cè)定，HA效價(jià)凝集價(jià)為91og2，同時(shí)每O. Iml病毒液的病毒含量為IO9 0EID50將得到的雞新城疫病毒液置于_20°C進(jìn)行保存。3)疫苗的制備在上述收獲的含有雞新城疫病毒的培養(yǎng)液加入加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合甲醛溶液的終濃度為O. I %。加甲醛溶液后最好傾倒另一瓶中，以避免瓶頸附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。然后37°c滅活16h(以瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí))期間振搖3 4次。滅活后置2 8°C保存，保藏時(shí)間不超過I個(gè)月，滅活后加入獸藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑制備為成品雞新城疫疫苗，具體步驟如下水相制備分裝后2 8°C保存即可完成雞新城疫滅活疫苗的制備。4%加體積吐 溫-80，充分搖勻，使吐溫-80完全溶解，即為水相。油相制備白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸鋁I. 5份，將3種成分混合加熱完全溶解后，121°C高壓滅菌40min，冷卻后備用，即為油相。乳化按水相油相=I 2的比例乳化。將乳化機(jī)的轉(zhuǎn)子在75體積％酒精中浸泡過夜后備用。先加油相2份于滅菌容器中，開動(dòng)電機(jī)慢慢攪拌，然后徐徐加入水相I份，加完后再以2800rpm乳化4分鐘。在終止乳化前加入I體積％硫柳汞溶液,使其終濃度為O. 01體積％。制備三批，批號(hào)為SK601、SK602、SK6034) SK6細(xì)胞新城疫疫苗的安全性與效力檢驗(yàn)4. I安全性試驗(yàn)取3 6周齡SPF雞10只，每只肌肉分點(diǎn)注射二聯(lián)苗I. 0ml，連續(xù)觀察14天，應(yīng)不發(fā)生因注射疫苗而出現(xiàn)的任何局部及全身反應(yīng)，結(jié)過見表I。表I疫苗安全檢驗(yàn)
試驗(yàn)雞種觀察14曰結(jié)果
疫苗批號(hào) ^ 切日齡注射劑量注射部位----
類及數(shù)量全身反應(yīng)局部反應(yīng)
SK601 SPFlO 只 201.0ml 胸部肌肉 10/10 正常 10/10-
SK602 SPFlO 只 201.0ml 胸部肌肉 10/10 正常 10/10-
SK603 SPFlO 只 201.0ml 胸部肌肉 10/10 正常 10/10-
對(duì)照組 SPFlO只 20 1.0ml生胸部肌肉 10/10正常 10/10-
理鹽水"標(biāo)示沒有局部反應(yīng)4. 2免疫效力檢驗(yàn)30 60齡SPF雞，每組10只，皮下或肌肉注射苗7ul，設(shè)對(duì)照組10只不免疫。接種后21日后采血，分離血清，用雞新城疫抗原測(cè)定HI抗體效價(jià)。免疫組NDV的HI抗體效價(jià)的幾何平均值> 41og2,未免疫對(duì)照組HI抗體效價(jià)的幾何平均值< 21og2。結(jié)果見表2。表2疫苗的效力檢驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞系經(jīng)消化傳代，以細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，形成生長(zhǎng)良好的細(xì)胞單層； 2)病毒接種與吸附將新城疫病毒接種于上述生長(zhǎng)良好的細(xì)胞單層，進(jìn)行病毒吸附； 3)細(xì)胞的孵育換用細(xì)胞維持液培養(yǎng)后，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖孵育； 4)病毒的繁殖將上述孵育劑洗去，重新加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)細(xì)胞系以繁殖新城疫病毒； 5)病毒的收獲收獲含有新城疫病毒的培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)中接種用的新城疫病毒是使用細(xì)胞系生產(chǎn)的新城疫病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的新城疫病毒是新城疫病毒Lasota株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞系為MDBK細(xì)胞系、V eroE6細(xì)胞系、BHK-21細(xì)胞系、PK-15細(xì)胞系、IBRS-2細(xì)胞系的任意一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞系為BHK-21細(xì)胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞孵育時(shí)間為20_40mino
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液的血清含量為 I -7% v/vo
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞維持液為無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的方法制備的新城疫病毒，其特征在于，使用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒。
11.一種用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫疫苗的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求10所述的新城疫病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑制備為新城疫疫苗。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法制備的新城疫疫苗，其特征在于，使用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫疫苗。
全文摘要
本發(fā)明使用細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒與疫苗，特別是使用常見易培養(yǎng)的細(xì)胞系如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細(xì)胞系生產(chǎn)新城疫病毒及疫苗。本發(fā)明的方法使用培養(yǎng)病毒的細(xì)胞系是成熟的商業(yè)化的細(xì)胞系，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn)的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，對(duì)新城疫強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102978166SQ20111036434
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司