專利名稱：一種中藥組合物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物的新用途，特別涉及在治療感染性疾病的新用途。
背景技術(shù)：
炎癥反應(yīng)和免疫功能的紊亂在感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用， 多重耐藥菌感染亦不例外。其與非耐藥菌感染在感染后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)和免疫功能的紊亂是一致的，只是因為針對多重耐藥菌的治療不如非耐藥菌有效，不能及時有效地清除多重耐藥菌這一感染因素，也就意味著不能在短時間內(nèi)調(diào)整其引發(fā)的炎癥反應(yīng)和免疫功能的紊亂，從而導(dǎo)致多重耐藥菌感染遷延難愈，預(yù)后較差。多肽陣列技術(shù)能用多肽模擬蛋白抗原與自身抗體結(jié)合，被認為是后基因組時代與基因芯片、蛋白芯片相媲美的新型蛋白位點檢測技術(shù)?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于抗體研究、基因表達分析、發(fā)現(xiàn)新基因、疾病診斷及藥物篩選等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊。目前國內(nèi)該技術(shù)較多用于癌癥研究，如腫瘤患者自身抗體的早期監(jiān)測，抗體識別抗原表位的研究等，如應(yīng)用多肽芯片研究非小細胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗體；另有應(yīng)用抗體芯片來鑒定腎組織中的異常表達蛋白，進行慢性腎病的早期診斷和治療監(jiān)測等。目前在細菌感染的中醫(yī)中藥干預(yù)的基礎(chǔ)研究中，尚未檢索到相關(guān)應(yīng)用。目前現(xiàn)有技術(shù)沒有公開本發(fā)明組合物用于治療多重耐藥菌感染所致炎癥反應(yīng)和免疫功能紊亂。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種中藥組合物在制備抗感染藥、提高免疫功能藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種中藥組合物在制備抗感染藥物中應(yīng)用；本發(fā)明提供一種中藥組合物在制備抗感染和/或治療炎癥和/或提高免疫藥物中應(yīng)用；所述中藥組合物由如下原料藥制成生黃芪30-120重量份當歸5-20重量份金銀花10-25重量份青蒿 10-30重量份虎杖 5-20重量份。上述中藥組合物優(yōu)選由如下原料藥制成生黃芪40-110重量份當歸6-19重量份金銀花12-23重量份青蒿12- 重量份虎杖 5-20重量份。上述中藥組合物優(yōu)選由如下原料藥制成生黃芪55-95重量份當歸8-15重量份金銀花12-22重量份青蒿13-25重量份
虎杖 5-20重量份。上述中藥組合物優(yōu)選由如下原料藥制成生黃芪85重量份當歸15重量份金銀花18重量份青蒿22重量份虎杖 10重量份。上述中藥組合物優(yōu)選由如下原料藥制成生黃芪55重量份當歸19重量份金銀花M重量份青蒿15重量份虎杖 6重量份。上述中藥組合物優(yōu)選由如下原料藥制成生黃芪 110重量份當歸8重量份金銀花15重量份青蒿觀重量份虎杖 18重量份。上述應(yīng)用，其中的感染為銅綠假單胞菌所致；所述銅綠假單胞菌為CGMCC No. 5317。上述中藥組合物加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的水煎劑、膠囊劑、片劑、丸劑、口服液體制劑、注射劑、散劑等各種劑型。所述常規(guī)工藝方法包括水提取或醇提取或先水提取再醇提取或先醇提取后再水提?。唤?jīng)上述常規(guī)提取后還可以過大孔樹脂柱進一步富集有效成分。為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時加入藥學(xué)可接受的輔料，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括甜味劑及各種香精；防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、 苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括PEG6000，PEG4000，蟲蠟等。為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)中藥藥劑學(xué)，需在制備這些劑型時加入藥學(xué)可接受的其它輔料(范碧亭《中藥藥劑學(xué)》，上?？茖W(xué)出版社1997年12月第1版中各劑型記載的輔料)。本發(fā)明組合物扶正透邪方能降低腹腔感染大鼠的死亡率、調(diào)節(jié)感染后大鼠炎癥和免疫紊亂的作用。菌株保藏信息本發(fā)明所述多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株1643號的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2011年10月10日；編號CGMCC No. 5317 ；分類命名 銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa。
具體實施方式
實驗例1.材料與儀器1. 1干預(yù)藥物1. 1. 1扶正透邪方提取物按照實施例1的方法制備。低濃度0. 5g/ml、中濃度 0.99g/ml、高濃度1.98g/ml。本實驗所設(shè)大鼠扶正透邪方小劑量藥量相當于70kg成人用量的2. 15倍，中劑量相當于70kg成人用量的6. 3倍，大劑量藥量相當于70kg成人用量的 12. 6 倍。1. 1. 2注射用頭孢他啶深圳致君制藥有限公司產(chǎn)品批號E20100102。1. 1. 3注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品批號1039098。1. 1. 4注射用亞胺培南西司他丁鈉Merck&Co.，Inc. USA產(chǎn)品批號100231。1.2實驗動物SD大鼠，雌雄各半，清潔級，體重200 220g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，合格證號SCXK-(軍)2007-004。
類命名
司。

司。司。
司。
實驗菌株多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株1643號，編號CGMCC No. 5317 ；分 :111^11 Ifilii Pseudomonas aeruginosa,,
3主要試劑與儀器
3. IM-H瓊脂平板XW01100301賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。
3. 2RPMI-1640 培養(yǎng)基=Sigma0
3. 3刀豆蛋白A :Sigma。
3. 4 脂多糖Sigma。
3. 5MTT :Sigma。
3. 6小牛血清民海生物公司。
3. 7磷酸鹽緩沖液(PBS)粉末鼎國生物技術(shù)有限公司。 3. 8Tris 上?；瘜W(xué)試劑廠。 3. 9NH4C1 北京紅星化工廠。 3. 10 0. 01NH4C1-10% SDS :GIBC0o
3. 11 Rat IL-I β ELISA試劑盒96t ZABFBZAA01上海依科賽生物制品有限公
3.12Rat IL-2ELISA試劑盒96t ZJBFBZAZ03上海依科賽生物制品有限公司。
3.13Rat IL-4ELISA試劑盒96t ZCAABZAA03上海依科賽生物制品有限公司。
3.14Rat IL-10ELISA試劑盒96t ZLBGBZAZ02上海依科賽生物制品有限公
1. 3. 15 Rat IFN- y ELISA試劑盒96t ZCCZBZAA02上海依科賽生物制品有限公 1. 3. 16 Rat TNF- α ELISA試劑盒96t ZDBZBZAA02上海依科賽生物制品有限公
1. 3. 17比濁管。
1. 3. 18 微量移液器:GILS0N P 0. 1-1. 0ml。
1. 3. 19電子稱SC0UT SC6010梅特勒.托利多常州衡器有限公司,
1. 3. 20電子微量天平JA3003上海越平科學(xué)儀器有限公司。
5
1. 3. 21 體溫計MC140 0MR0N。1. 3. 22立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器AMA440N ATELL。1. 3. 23 電熱恒溫培養(yǎng)箱:DNP9162 JINGHONG。1. 3. 24 渦混合器V0RTEX_2 GENIE。1. 3. 25微量攪拌器75-2型上海醫(yī)用分析儀廠。1. 3. 26 低溫高速離心機Labofuge 400R Kendro。1. 3. 27超凈工作臺北京碧都。1. 3. 28 酶標分析儀DNM-9602 PROLONG。1. 3. 29全波長多功能酶標儀S印ctraMR MRff DYNEX1. 3. 30 全自動血細胞分析儀LH 750 ANALYZER BECKMANCOULTER。1.3.31 特種蛋白分析儀BN ProSpec SIEMENS。1. 3. 32 AutoSpot peptide synthesizer ；FX-7 ^ ψS^WMfi Χ,1. 3. 33 PEG 修飾纖維素膜，F(xiàn)moc-氨基酸，DCM，aminefreeDMF, 乙酉享，Acetic anhydride, Acetic anhydride, DIPEA(Diisopropylamine), DIC(Diisopropylcarbodiimide), BromophenolbIue, Piperidine 等。1. 4試劑配制1.5.1 10%水合氯醛溶液的配制水合氯醛 IOg加入蒸餾水 IOOml1. 5. 2 Tris-NH4Cl 溶液的配制Tris 溶液(0. 17mol/L) IOmlNH4Cl 溶液(0. 16mol/L) 90ml1. 6菌懸液的制備將實驗菌株接種于M-H瓊脂培養(yǎng)基活化，經(jīng)37°C恒溫培養(yǎng)18 24h后，用生理鹽水洗脫菌落，離心，3000rpm，20min，棄去上清，加入生理鹽水，混勻后吸出0. 5ml加入新的無菌試管中，加入適量生理鹽水，與比濁計進行比濁，將菌液稀釋成M X 108CFU/ml，用酶標儀檢測OD值為0. 675 士0. 005，再將其稀釋成0. 48X 108CFU/ml，作為實驗菌懸液。2實驗方法2. 1動物模型SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周，室溫控制在18°C 22°C之間，自由獲取食、水，采血前禁食過夜。按照楊鈞，張淑文，陰赪宏，等.耐藥菌腹腔感染兔動物模型的建立[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18 (9) :1129-1222報道的方法建立多重耐藥銅綠假單胞菌腹腔感染大鼠模型。具體方法如下常規(guī)飼養(yǎng)，將多重耐藥銅綠假單胞菌菌液(以下簡稱菌液)同 2.0%西黃芪膠1 1混合后，腹腔注射。注射后自由進食、飲水。對照組腹腔注射等體積的2.0%西黃芪膠。2. 2動物分組與處理2. 2. 1死亡率保護實驗SD大鼠88只，雌雄各半，隨機分對照組、模型組、扶正透邪方小劑量組、扶正透邪方中劑量組、扶正透邪方大劑量組(即B0、Bi、B2、B3、B4)，共5組，BO組8只，其余4組每組各20只。BO組腹腔注射西黃芪膠后(8ml/kg)，即給予0. 9%生理鹽水灌胃^il,每日一次。Bl組腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即給予0.9%生理鹽水灌胃anl，每日一次。B2、B3、B4 組腹腔注射菌液后(8ml/kg)，分別給予扶正透邪方提取物0. 5g/ml、0. 99g/ml、l. 98g/ml灌胃，每次anl，每日一次。以上各組分別于腹腔注射后6小時統(tǒng)計一次死亡率，其后每M小時統(tǒng)計一次死亡率，第5天為終末觀察點。篩選出扶正透邪方最佳給藥量為9. 9g/kg/天。SD大鼠96只，雌雄各半，隨機分模型組、西藥對照組、扶正透邪方最佳劑量組、中西醫(yī)結(jié)合治療組(即(1、02、03、(4)，共4組，每組各對只。Cl組腹腔注射菌液后(8ml/ kg)，即給予0.9%生理鹽水灌胃anl，每日一次。C2組腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即給予頭孢他啶，肌肉注射，0.45g/kg/次，每日兩次。C3組腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即給予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次anl，每日一次。C4組腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即給予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次anl，每日一次，同時予頭孢他啶，肌肉注射， 0. 45g/kg/次，每日兩次。以上各組分別于腹腔注射后6小時統(tǒng)計一次死亡率，其后每M小時統(tǒng)計一次死亡率，第5天為終末觀察點。2. 2. 2指標檢測實驗SD大鼠200只，雌雄各半，隨機分為空白組、模型組、西藥對照組、扶正透邪方最佳劑量組、中西醫(yī)結(jié)合治療組(即D1、D2、D3、D4)，共5組，每組各40只。對照組腹腔注射等體積的2.0%西黃芪膠后(5ml/kg)，即給予0.9%生理鹽水灌胃，每次anl，每日一次。D1、 D2、D3、D4組腹腔注射菌液均為5ml/kg，其余處理方法與死亡率觀察實驗相同。以上各組按時間點又分為腹腔注射后:3h、8h、ld、3d和5d組，每組各8只，各組按分組所示相應(yīng)時間點， 留取血及組織標本。ld、3d和5d組于留取血及組織標本前測量肛溫。雄性SD大鼠36只，隨機分為空白組、模型組、扶正透邪方最佳劑量組，共3組，每組各12只。模型組腹腔注射腹腔注射菌液后(5ml/kg)，即給予0.9%生理鹽水灌胃，每次 anl，每日一次。扶正透邪方最佳劑量組腹腔注射菌液后(5ml/kg)，即給予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次anl，每日一次。7d后留取以上各組大鼠血清標本，_20°C保存，供多肽陣列檢測使用。2. 3標本的采集與處理2. 3. 1 血標本予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4g/kg，麻醉后，常規(guī)消毒大鼠腹部皮膚，打開腹腔，分離腹主動脈，予一次性無菌采血針分別接anl EDTA-K3采血管和5ml空白采血管，進行取血。采血完畢后，EDTA-K3采血管送檢血常規(guī)，空白采血管室溫放置Ih后，再4°C放置 Ih,離心，2500rpm, 20min,分離血清，分裝后_70°C保存。2. 3. 2組織標本無菌留取肺、小腸組織放入4%甲醛固定液，進行切片、組織形態(tài)學(xué)觀察。2. 4檢測指標與方法2. 4. 1大鼠血清IL-I β的ELISA檢測1.準備工作
(1)提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。( 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1 20)。C3)標準品加入試劑稀釋液0.5ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)。然后根據(jù)2000、1000、500、250、125、62.5、 31.25、0pg/ml濃度進行稀釋。(4)生物素化抗體工作液使用前30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1 100)配置成生物素化抗體工作液。( 酶結(jié)合物工作液使用前 30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1 100)配置成酶結(jié)合物工作液，室溫避光放置。2.洗滌方法用自動洗板機，注入350μ 1洗滌液，注入與吸出間隔20-30秒。洗板4次。3.操作步驟(1)從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條。(2)留空白孔。(3)先按標準品稀釋方法加好標準品(100 μ 1/孔)，0pg/ml孔加試劑稀釋液(Assay Diluent) 100 μ 1 ； 在每個樣本孔中加入50 μ 1試劑稀釋液(Assay Diluent)和50 μ 1樣本(此時樣本已做了 1 2倍稀釋，計算結(jié)果時樣本含量要乘以2)；隨后在樣本和標準孔中加入50 μ 1生物素化抗體工作液，用封板膠紙封住反應(yīng)孔。(4)室溫O0-25°C )，使用微量振蕩儀(最低頻率， IOOrpm)，孵育120分鐘。(5)洗板5次。(6)除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100 μ 1/ 孔)，用封板膠封住反應(yīng)孔。(7)室溫Q0-25°C )，使用微量振蕩儀(最低頻率，IOOrpm)，孵育60分鐘。(8)洗板5次。⑶加入顯色底物(包括空白孔)100μ1/孔，室溫Q2-25°C)， 避光孵育10分鐘。(10)加入終止液(包括空白孔)100μ 1/孔，混勻后即刻測量0D450值 (10分鐘內(nèi))。4.結(jié)果判斷(1)每個標準品和標本的OD值減去零孔的OD值。(2)手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值在標準曲線上查出其濃度。C3)若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)當稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。2. 4. 2大鼠血清IL-10的ELISA檢測1.準備工作(1)提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。(2)將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1 20)。C3)標準品加入試劑稀釋液0.5ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為4000pg/ml)。然后根據(jù)4000、2000、1000、500、250、125、62. 5、 Opg/ml濃度進行稀釋。(4)生物素化抗體工作液使用前30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1 100)配置成生物素化抗體工作液。( 酶結(jié)合物工作液使用前30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1 100)配置成酶結(jié)合物工作液，室溫避光放置。2.洗滌方法用自動洗板機，注入350 μ 1洗滌液，注入與吸出間隔20-30秒。洗板4次。3.操作步驟(1)從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條。(2)留空白孔。(3)分別將標本或不同濃度標準品(Opg/ml孔加試劑稀釋液)加入相應(yīng)孔中(100 μ 1/孔)，用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90分鐘。(4)洗板5次。( 除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100 μ 1/孔)。用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育60分鐘。(6)洗板5次。(7)除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(ΙΟΟμΙ/孔)。用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵箱，避光孵育 30分鐘。(8)洗板5次。(9)加入顯色底物(包括空白孔)100μ1/孔，37°C孵箱，避光孵育 15分鐘。(10)加入終止液(包括空白孔)100 μ 1/孔，混勻后即刻測量0D450值(10分鐘內(nèi))。4.結(jié)果判斷同大鼠血清IL-I β的ELISA檢測。2. 4. 3ConA誘導(dǎo)的脾臟T細胞增殖能力測定采用MH法。無菌摘取大鼠脾臟(操作在冰浴中進行)，常規(guī)制備脾細胞懸液，計數(shù)脾細胞，再用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5X 106/mL，加至96板中，100 μ L/ 孔。分別加入含ConA完全RPMI1640溶液100 μ L/孔(ConA終濃度為5 μ g/mL)，每組設(shè)5 個復(fù)孔，并設(shè)無ConA細胞對照。將96孔板置37°C ,5%C02培養(yǎng)箱孵育68h，取出，每孔棄上清 100 μ L，加入 5mg/mL 的 MTTlO μ L (終濃度 0. 5mg/mL)，繼續(xù)孵育 4h，加入 0. OlN HC1-10% SDS 100 μ L/孔，振蕩搖勻，37°C過夜，酶標儀570nm下測定各孔A值。2. 4. 4LPS誘導(dǎo)的脾臟B淋巴細胞增殖能力的測定采用MTT法。無菌摘取大鼠脾臟(操作在冰浴中進行)，常規(guī)制備脾細胞懸液，計數(shù)脾細胞，再用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5 X 106/mL，加至96板中，100 μ L/ 孔。分別加入含LPS完全RPMI1640溶液100 μ L/孔(LPS終濃度為5 μ g/mL)，每組設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)無LPS細胞對照。將96孔板置37°C ,5%C02培養(yǎng)箱孵育68h，取出，每孔棄上清 100 μ L，加入 5mg/mL 的 MTTlO μ L(終濃度 0. 5mg/mL)，繼續(xù)孵育 4h，加入 0. OlN HC1-10% SDS100 μ L/孔，振蕩搖勻，37°C過夜，酶標儀570nm下測定各孔A值。2. 4. 5大鼠血清IFN- γ的ELISA檢測1.準備工作(1)提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。( 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1 20)。C3)標準品加入試劑稀釋液1.0ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)。然后根據(jù)2000、1000、500、250、125、62.5、 31.25、0pg/ml濃度進行稀釋。(4)生物素化抗體工作液使用前30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1 100)配置成生物素化抗體工作液。( 酶結(jié)合物工作液使用前 30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1 100)配置成酶結(jié)合物工作液，室溫避光放置。2.洗滌方法用自動洗板機，注入350 μ 1洗滌液，注入與吸出間隔20-30秒。洗板4次。3.操作步驟(1)從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條。(2)留空白孔。(3)先按標準品稀釋方法加好標準品(100 μ 1/孔)，0pg/ml孔加試劑稀釋液(Assay Diluent) 100 μ 1 ； 在每個樣本孔中加入50 μ 1試劑稀釋液(Assay Diluent)和50 μ 1樣本(此時樣本已做了 1 2倍稀釋，計算結(jié)果時樣本含量要乘以2)；隨后在樣本和標準孔中加入50 μ 1生物素化抗體工作液，用封板膠紙封住反應(yīng)孔。(4)室溫O0-25°C )，使用微量振蕩儀(最低頻率， IOOrpm)，孵育120分鐘。(5)洗板5次。(6)除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100 μ 1/ 孔)，用封板膠封住反應(yīng)孔。(7)室溫Q0-25°C )，使用微量振蕩儀(最低頻率，IOOrpm)，孵育60分鐘。(8)洗板5次。⑶加入顯色底物(包括空白孔)100μ1/孔，室溫Q2-25°C)， 避光孵育10分鐘。(10)加入終止液(包括空白孔)100μ1/孔，混勻后即刻測量0D450值(10分鐘內(nèi))。4.結(jié)果判斷同大鼠血清IL-I β的ELISA檢測。2. 4. 6大鼠血清IL-4的ELISA檢測1.準備工作(1)提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。( 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1 20)。C3)標準品加入試劑稀釋液1.0ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)。然后根據(jù)2000、1000、500、250、125、62.5、 31.25、0pg/ml濃度進行稀釋。(4)生物素化抗體工作液使用前30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1 100)配置成生物素化抗體工作液。( 酶結(jié)合物工作液使用前 30分鐘用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1 100)配置成酶結(jié)合物工作液，室溫避光放置。2.洗滌方法用自動洗板機，注入350 μ 1洗滌液，注入與吸出間隔20-30秒。洗板4次。3.操作步驟(1)從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條。(2)留空白孔。(3)分別將標本或不同濃度標準品(Opg/ml孔加試劑稀釋液)加入相應(yīng)孔中(100 μ 1/孔)，用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90分鐘。(4)洗板5次。( 除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100 μ 1/孔)。用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育60分鐘。(6)洗板5次。(7)除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(ΙΟΟμΙ/孔)。用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵箱，避光孵育 30分鐘。(8)洗板5次。(9)加入顯色底物(包括空白孔)100μ1/孔，37°C孵箱，避光孵育 15分鐘。(10)加入終止液(包括空白孔)100μ1/孔，混勻后即刻測量0D450值(10分鐘內(nèi))。4.結(jié)果判斷同大鼠血清IL-I β的ELISA檢測。2. 4. 7多肽陣列檢測耐藥蛋白抗體1.根據(jù)銅綠假單胞菌耐藥蛋白序列，選擇超廣譜內(nèi)酰胺酶(TEMs/ESBLs) TEM(ABB76656)，用多肽陣列技術(shù)制作了 9張多肽陣列。每種蛋白有3張重復(fù)多肽陣列每張TEM(ABB76656)蛋白多肽陣列上排列93條多肽，配置0. 3M Fmoc-氨基酸溶液，封閉液 I 2% (v/v)aceticanhydride in DMF，封閉液 II :2% (v/v)acetic anhydride+2% (v/v) DIPEAin DMF，去保護溶液(20% (v/v) piperidine in DMF)。把活化的PEG-纖維素膜放置在Autospotter上，根據(jù)程序自動移液30 μ 1的Fmoc-氨基酸溶液到活化的PEG-纖維素膜上的特定位置與膜進行反應(yīng)&20分鐘，然后把PEG-纖維素膜按序浸入封閉液I中(反應(yīng) 5分鐘)和封閉液II中(反應(yīng)20分鐘)，進行側(cè)鏈封閉，然后用DMF清洗4次，每次30秒。 然后加入去保護溶液中O次，每次5分鐘)，用于移除氨基端的Fmoc保護基團；去保護之后，用DMF清洗3次，每次30秒鐘，而后再用乙醇干燥。如果用于下一次的氨基酸合成，重復(fù)以上步驟，直至各個多肽全部合成。全部合成后，先用TFAcocktail去除側(cè)鏈保護基團， 再用CH2C12清洗4次，而后用乙醇干燥，-20°C保存用于下一步免疫反應(yīng)實驗。根據(jù)實驗設(shè)計，多肽自動合成儀合成多肽陣列，每張多肽陣列橫向為12個多肽點，縱向為8個多肽點。 (見附

圖1)2.封閉4% skim milk+5% sucrose in TBST buffer，室溫 4 小時。3. 一抗孵育大鼠血清1 200稀釋；與多肽陣列反應(yīng)，4°C下過夜。
下 2/J、
4.洗膜用TBSTbuffer漂洗，10分鐘X 3次。
5.二抗孵育二抗(羊抗鼠)IgG-HRP，用封閉液1
1000或1 2000稀釋，室
時c
6.洗膜用TBSTbuffer漂洗，10分鐘X 3次。
7.顯色加入ECL發(fā)光試劑，數(shù)字成像。 3統(tǒng)計學(xué)處理方法
采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件包，參數(shù)計量資料進行t檢驗、方差分析，計數(shù)資料使用 χ 2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。各計量資料用平均數(shù)士標準差(x±s )來表示，檢驗水準為α =0. 05。4 結(jié)果4. 1不同劑量扶正透邪方治療對腹腔感染大鼠死亡率保護的影響腹腔注射菌液后，Mi統(tǒng)計一次死亡率，其后每24h統(tǒng)計一次死亡率。對照組5天內(nèi)全部存活，模型組與扶正透邪方各劑量組大鼠在后開始出現(xiàn)死亡，隨著時間的延長，死亡率逐漸升高。他后各時間點扶正透邪方各劑量組大鼠的死亡率較模型組均有不同程度的降低。χ 2檢驗顯示，各劑量組相應(yīng)時間點組間比較，無顯著差異(見表1)。表1不同劑量扶正透邪方治療對腹腔感染大鼠死亡率保護的影響
組別
η
死亡率
6h
24h
48h
72h
96h 120h
對照組8000000模型組20065%75%80%80%85%扶正透邪方小劑量組20055%60%65%70%70%扶正透邪方中劑量組20045%50%55%55%60%扶正透邪方大劑量組20045%45%60%60%65%注與相同時間點模型組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 014. 2不同治療方法對腹腔感染大鼠死亡率保護的影響腹腔注射菌液后，Mi統(tǒng)計一次死亡率，其后每24h統(tǒng)計一次死亡率。各組大鼠在 6h后開始出現(xiàn)死亡，隨著時間的延長，死亡率逐漸升高。他后各時間點各治療組大鼠的死亡率較模型組均有不同程度的降低。X2檢驗顯示，4a!、7a!、120h，中西醫(yī)結(jié)合治療組大鼠的死亡率較模型組降低，差異顯著(P < 0. 05)，各治療組間比較，無顯著差異(見表2)。表2不同治療方法對腹腔感染大鼠死亡率保護的影響(n = 24)
權(quán)利要求
1.一種中藥組合物在制備抗感染和/或治療炎癥和/或提高免疫藥物中應(yīng)用，所述中藥組合物由如下原料藥制成生黃芪 30-120重量份當歸 5-20重量份金銀花 10-25重量份青蒿 10-30重量份虎杖 5-20重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下原料藥制成 生黃芪 40-110重量份當歸 6-19重量份金銀花 12-23重量份青蒿 12- 重量份虎杖 5-20重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下原料藥制成 生黃芪 55-95重量份當歸 8-15重量份金銀花 12-22重量份青蒿 13-25重量份虎杖 5-20重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下原料藥制成 生黃芪 85重量份當歸 15重量份金銀花 18重量份青蒿 22重量份虎杖 10重量份。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下原料藥制成 生黃芪 55重量份當歸 19重量份金銀花 M重量份青蒿 15重量份虎杖 6重量份。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下原料藥制成 生黃芪 Iio重量份當歸 8重量份金銀花 15重量份青蒿 28重量份虎杖 18重量份。
7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的感染為銅綠假單胞菌所致。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述銅綠假單胞菌為CGMCCNo. 5317。
9.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該中藥組合物加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開一種中藥組合物在制備抗感染和/或治療炎癥和/或提高免疫藥物中應(yīng)用，所述中藥組合物由生黃芪、當歸、金銀花、青蒿、虎杖等原料藥制成；本發(fā)明組合物具有明顯的抗感染、炎癥和調(diào)節(jié)免疫紊亂的作用。
文檔編號A61K36/704GK102379931SQ20111036510
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉清泉, 江其敏, 馬群 申請人:劉清泉