專利名稱：一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑，屬于生物學(xué)領(lǐng)域，特別是獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前市場(chǎng)流行的鼻炎滅活疫苗主要有兩種類型，包括油佐劑和鋁膠佐劑疫苗。油乳劑滅活疫苗抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，但是存在不同程度的副反應(yīng)。鋁膠佐劑滅活疫苗不存在副反應(yīng)現(xiàn)象，但是抗體效價(jià)低，持續(xù)時(shí)間短。本發(fā)明所述的新型佐劑制備而成的雞傳染性鼻炎滅活疫苗，具有安全性高、無(wú)副反應(yīng)、抗體產(chǎn)生快以及保護(hù)率高等優(yōu)勢(shì)，不但適用于雞群常規(guī)免疫，有效預(yù)防疫病的發(fā)生， 并且適用于發(fā)病雞群的緊急接種，對(duì)控制本病和防止復(fù)發(fā)有較好的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的佐劑，特別是提供適用于雞傳染性鼻炎滅活疫苗的佐劑，將其用于雞傳染性鼻炎滅活疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中，使生產(chǎn)的雞傳染性鼻炎滅活疫苗具有安全性高、無(wú)副反應(yīng)、抗體產(chǎn)生快以及保護(hù)率高等優(yōu)勢(shì)，既適合于正常預(yù)防也適合于發(fā)病時(shí)的緊急接種，對(duì)控制本病和防止復(fù)發(fā)有較好的作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的新的佐劑是由卡波姆、鉀鹽、鈉鹽以及去離子水配制而成。本發(fā)明所述的新的佐劑用于雞傳染性鼻炎滅活疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中，替代傳統(tǒng)佐劑，可使生產(chǎn)的雞傳染性鼻炎滅活疫苗具有安全性高、無(wú)副反應(yīng)、抗體產(chǎn)生快以及保護(hù)率高等優(yōu)勢(shì)，既適合于正常預(yù)防也適合于發(fā)病時(shí)的緊急接種。一、本發(fā)明的佐劑本發(fā)明的新型佐劑，其中卡波姆是含有聚烯基聚醚交聯(lián)的丙烯酸聚合物，很低的用量下(常規(guī)用量0. 25% 0. 5%)就能產(chǎn)生高效的增稠作用，常規(guī)用量在0. 2% 0.4%， 能替代3 % 7 %的常規(guī)乳化劑，可將雞傳染性鼻炎抗原包裹吸附住，接種后，在雞只體內(nèi)能緩慢釋放，可使抗體效價(jià)高，持續(xù)期長(zhǎng)。Na2HPO4和KH2PO4可以調(diào)節(jié)pH，起到緩沖液的作用。NaCl和KCl的主要作用是保持一定的離子濃度，以維持活性。本發(fā)明所述的新的佐劑的配制NaCl 5 IOg (無(wú)色立方結(jié)晶或白色結(jié)晶，上海國(guó)藥)，Na2HPO4 1.5 2g (白色粉末，上海國(guó)藥)，KC10.1 0.5g (無(wú)色立方晶體，常為長(zhǎng)柱狀，上海國(guó)藥)，KH2PO4 0. 1 0.5g (為無(wú)色結(jié)晶或白色顆粒狀粉末，上海國(guó)藥)，卡波姆3 7g(白色疏松狀粉末，北京國(guó)人逸康科技有限公司)，去離子水1000ml，溶解后經(jīng)121°C高壓30min滅菌后備用。常溫保存，不超過(guò)15天。二、疫苗制造1.疫苗生產(chǎn)檢驗(yàn)用菌種制造及檢驗(yàn)用菌種為副雞嗜血桿菌A型C-Hpg-8株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、 保管和供應(yīng)。2.疫苗制造(1)生產(chǎn)用種子制備1) 一級(jí)種子繁殖與鑒定取菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在含5% 10% CO2環(huán)境中37°C培養(yǎng)16 18小時(shí)后，挑選數(shù)個(gè)熒光性強(qiáng)的典型菌苔(菌落)接種于5日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，在37°C繼續(xù)孵育，收集30小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚卵黃液，經(jīng)純檢合格后，作為-級(jí)種子。在-20°C以下保存，應(yīng)不超過(guò)1個(gè)月，否則要再通過(guò)雞胚復(fù)壯，但不應(yīng)超過(guò)6 代。2) 二級(jí)種子繁殖取感染的雞胚卵黃液，劃線接種雞肉湯瓊脂乎板，在含5% 10% CO2條件下，37°C培養(yǎng)16 18小時(shí)，選熒光性強(qiáng)的典型菌苔(菌落)接種于雞肉湯培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)16 20小時(shí)，經(jīng)純檢合格后，即為二級(jí)種子。在2 8°C保存，不得超過(guò)6 8小時(shí)。(2)制苗用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，制造方法見附注4。(3)制苗菌液的制備1)菌液培養(yǎng)將IOOml種子液加入4000ml半合成培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)18 20 小時(shí)，其間接振培養(yǎng)瓶二次，經(jīng)純撿確認(rèn)無(wú)雜菌污染，加入0. 05%甲醛溶液，置2 8°C保存。2)制苗菌液的濃縮與滅活用中空纖維超濾器將純檢合格的菌液濃縮，然后再用 PH7. 2的PBS制成懸浮液，使每Iml至少含50億菌體(用生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品“中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比較，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管含副雞嗜血桿菌為觀億/ml)，再按體積比加入0. 15%甲醛溶液和0. 01%的硫柳汞，在2 8°C滅菌7日，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)作為制苗抗原。(4)佐劑的配制本發(fā)明所述的新的佐劑的配制NaCl 5 10g, Na2HPO4 1. 5 2g, KCl 0. 1 0. 5g, KH2PO4 0. 1 0. 5g，卡波姆 3 7g，去離子水1000ml，溶解后經(jīng)121°C高壓30min滅菌后備用。(5)配苗將濃縮鼻炎菌液用滅菌PBS (0. lmol/L, pH 7. 0 7. 2)稀釋一定比例后與新型佐劑按4 1比例進(jìn)行混合并攪拌搖勻，保證每Iml疫苗中含有10億菌數(shù)(用生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品“中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比較判定)。三、疫苗檢驗(yàn)1.無(wú)菌檢驗(yàn)按《規(guī)程》進(jìn)行，無(wú)菌生長(zhǎng)。2.安全檢驗(yàn)用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗lml，觀察14日， 應(yīng)無(wú)異常反應(yīng)。3.效力檢驗(yàn)用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1個(gè)月后，連同條件相同的對(duì)照雞4只，各眶下竇內(nèi)注射C-HpS-S菌株雞肉湯16小時(shí)培養(yǎng)物0. 2ml (50 100萬(wàn)活菌)，觀察14日，對(duì)照雞全部發(fā)病(面部出現(xiàn)一側(cè)或兩例眶下竇及周圍腫脹并有流鼻涕或兼有流淚者)，免疫雞至少保護(hù)6只，或?qū)φ针u3只發(fā)病，免疫雞至少保護(hù)7只為合格。4.甲醛、硫柳汞含量測(cè)定分別按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行，應(yīng)符合《制品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定》<0.4%。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及的一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑。本發(fā)明制備的佐劑用作雞傳染性鼻炎滅活疫苗的佐劑制成雞傳染性鼻炎滅活疫苗，可使接種雞只后產(chǎn)生的抗體效價(jià)高，抗體保護(hù)期長(zhǎng)，攻毒保護(hù)率高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例11 菌種制造及檢驗(yàn)用菌種為副雞嗜血桿菌A型C-Hpg-8株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、 保管和供應(yīng)。2疫苗制造(1)生產(chǎn)用種子制備1) 一級(jí)種子繁殖與鑒定取菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在含5% 10% CO2環(huán)境中37°C培養(yǎng)16 18小時(shí)后，挑選數(shù)個(gè)熒光性強(qiáng)的典型菌苔(菌落)接種于5日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，在37°C繼續(xù)孵育，收集30小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚卵黃液，經(jīng)純檢合格后，作為-級(jí)種子。在-20°C以下保存，應(yīng)不超過(guò)1個(gè)月，否則要再通過(guò)雞胚復(fù)壯，但不應(yīng)超過(guò)6 代。2) 二級(jí)種子繁殖取感染的雞胚卵黃液，劃線接種雞肉湯瓊脂乎板，在含5% 10% CO2條件下，37°C培養(yǎng)16 18小時(shí)，選熒光性強(qiáng)的典型菌苔(菌落)接種于雞肉湯培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)16 20小時(shí)，經(jīng)純檢合格后，即為二級(jí)種子。在2 8°C保存，不得超過(guò)6 8小時(shí)。(2)制苗用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，制造方法見附注4。(3)制苗菌液的制備1)菌液培養(yǎng)將IOOml種子液加入4000ml半合成培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)18 20 小時(shí)，其間接振培養(yǎng)瓶二次，經(jīng)純撿確認(rèn)無(wú)雜菌污染，加入0. 05%甲醛溶液，置2 8°C保存。2)制苗菌液的濃縮與滅活用中空纖維超濾器將純檢合格的菌液濃縮，然后再用 PH7. 2的PBS制成懸浮液，使每Iml至少含50億菌體(用生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品“中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比較，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管含副雞嗜血桿菌為觀億/ml)，再按體積比加入0. 15%甲醛溶液和0.01%的硫柳汞，在2 8°C滅菌7日，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)作為制苗抗原(參見《雞傳染性鼻炎滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》)。(4)佐劑的配制NaCl 5 IOg (無(wú)色立方結(jié)晶或白色結(jié)晶，上海國(guó)藥)，Na2HPO4 1. 5 2g (白色粉末，上海國(guó)藥)，KC10. 1 0.5g (無(wú)色立方晶體，常為長(zhǎng)柱狀，上海國(guó)藥)，KH2PO4 0. 1 0.5g (為無(wú)色結(jié)晶或白色顆粒狀粉末，上海國(guó)藥)，
卡波姆3 7g(白色疏松狀粉末，北京國(guó)人逸康科技有限公司)，去離子水1000ml，溶解后經(jīng)121°C高壓30min滅菌后備用。(5)配苗將濃縮鼻炎菌液用滅菌PBS (0. lmol/L, pH 7. 0 7. 2)稀釋一定比例后與新型佐劑按4 1比例進(jìn)行混合并攪拌搖勻，保證每Iml疫苗中含有10億菌數(shù)(用生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品“中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比較判定)。實(shí)施例2按照《雞傳染性鼻炎滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2000，本發(fā)明以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》)上的檢驗(yàn)方法對(duì)疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)。1.無(wú)菌檢驗(yàn)按《規(guī)程》進(jìn)行，無(wú)菌生長(zhǎng)。2.安全檢驗(yàn)用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗lml，觀察14日， 應(yīng)無(wú)異常反應(yīng)。3.效力檢驗(yàn)用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1個(gè)月后，連同條件相同的對(duì)照雞4只，各眶下竇內(nèi)注射C-HpS-S菌株雞肉湯16小時(shí)培養(yǎng)物 0. 2ml (50 100萬(wàn)活菌)，觀察14日，對(duì)照雞全部發(fā)病(面部出現(xiàn)一側(cè)或兩例眶下竇及周圍腫脹并有流鼻涕或兼有流淚者)，免疫雞至少保護(hù)6只，或?qū)φ针u3只發(fā)病，免疫雞至少保護(hù)7只為合格。4.甲醛、硫柳汞含量測(cè)定分別按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行，應(yīng)符合《制品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定》<0.4%。實(shí)施例31.疫苗安全性測(cè)定本疫苗經(jīng)頸部皮下和胸部肌肉途徑接種2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗1ml，觀察14日，試驗(yàn)雞飲食和健康狀況無(wú)異常反應(yīng)，處死后注射部位解剖，無(wú)肉芽增生等副反應(yīng)。2.免疫雞血清抗體的檢測(cè)疫苗經(jīng)翅根肌肉免疫63日齡SPF雞，0. 5ml/只，共8只，分別在免疫后不同時(shí)間段采血分離血清，用Hpg-8株檢測(cè)抗原檢測(cè)血清抗體，以抗原抗體50%出現(xiàn)凝集反應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù)定為血清的抗體效價(jià)。表1疫苗免疫后免疫雞血清抗體的檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑，其特征在于制備方法為取 NaCl 5 10g, Na2HPO4 1. 5 2g, KCl 0. 1 0. 5g, KH2PO4 0. 1 0. 5g,卡波姆 3 7g，溶于去離子水IOOOml中，溶解后經(jīng)121°C高壓30min滅菌后備用。
2.如權(quán)利要求1所述一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑的應(yīng)用，其特征在于將濃縮鼻炎菌液用滅菌PBS稀釋一定比例后與該雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑按4 1比例進(jìn)行混合并攪拌搖勻制備而成雞傳染性鼻炎滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及的一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗佐劑。本發(fā)明制備的佐劑用作雞傳染性鼻炎滅活疫苗的佐劑制成雞傳染性鼻炎滅活疫苗，可使接種雞只后產(chǎn)生的抗體效價(jià)高，抗體保護(hù)期長(zhǎng)，攻毒保護(hù)率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102406936SQ20111037296
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者周忠號(hào), 李平, 杜元釗, 韓建文 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司