專利名稱：用于siRNA傳遞的納米泡載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及用于SiRNA傳遞的納米泡載體。
背景技術(shù)：
siRNA中文名稱是小干擾脫氧核糖核酸，是基于基因沉默(RNAi)技術(shù)而設(shè)計的一種核酸活性成分。siRNA是人工合成的雙鏈RNA，是一種小RNA分子Ql-25核苷酸)，由 Dicer (RNAaseIII家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成。siRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補的目標mRNA的沉默。siRNA無論得到的方法如何，如化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、用RNAaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA、siRNA表達載體、病毒載體、siRNA表達框架，因為它們的分子結(jié)構(gòu)相同，理化性質(zhì)也一樣，只是產(chǎn)品形式可能有所不同，即保存在什么溶液中。siRNA自發(fā)現(xiàn)以來已獲得大量關(guān)注，但一直沒有作為新藥上市，最重要的問題是 siRNA作為核酸分子，很容易被體內(nèi)核酸酶降解，并且siRNA從注射部位到達作用部位要經(jīng)歷很多過程途徑，進入細胞后，還有從內(nèi)涵體或溶酶體中逃逸，進入胞漿，才能發(fā)揮作用。 siRNA的特殊性使其制劑研究非常困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)我們設(shè)計的一種納米泡載體，可以在體外和體內(nèi)傳遞 siRNA，并且在攜帶siRNA的納米泡經(jīng)過部位或作用部位施加超聲手段，可以促進siRNA的釋放，并起到相應的藥理作用。本發(fā)明公開的用于siRNA傳遞的納米泡載體，其特征是納米泡由聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和陽離子脂質(zhì)構(gòu)成外殼，內(nèi)部充填氣體或在正常體溫下轉(zhuǎn)化為氣體的液體。本發(fā)明中的siRNA根據(jù)所表達的功能特點而設(shè)計核苷酸序列，并通過生物技術(shù)公司合成得到。siRNA的功能包括各種疾病的治療用途，例如各種病毒性肝炎、腫瘤、心血管疾病、免疫性疾病。本發(fā)明中的聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物選自聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物，優(yōu)選的是聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物。聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物中聚乳酸羥基乙酸嵌段的分子量范圍是1000 20000， 優(yōu)選的是2000 10000，更優(yōu)選的是3000 10000 ；聚乙二醇嵌段的分子量范圍是500 10000，優(yōu)選的是1000 5000，更優(yōu)選的是1500 3000。聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物和聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物可以從市場上購買得到；或根據(jù)文獻合成方法，也可以自行合成得到。本發(fā)明中的陽離子脂質(zhì)選自1，2- 二油酰-3-三甲基胺基丙烷、雙十八烷基二甲基溴化銨、雙十烷基二甲基溴化銨、雙十二烷基二甲基溴化銨、尿嘧啶脂質(zhì)衍生物、1，4_ 二氫吡啶脂質(zhì)衍生物、二甲基羥乙基胺丙胺碳酰膽固醇酯、3 β _(N-(N’，N’ - 二甲基氨基乙烷) 碳酰)膽固醇、0，0’_雙十四酰-N-三甲基氨基乙酰二乙醇胺鹽酸鹽、十六烷基三甲基溴化
\銨(CTAB)、苯扎氯胺、魚精蛋白、硬脂胺、二油酰磷脂酰乙醇胺。這些陽離子脂質(zhì)都可以從市場上得到。本發(fā)明中的氣體選自空氣、、氮氣、氧氣、二氧化碳、全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化
硫ο本發(fā)明中的在正常體溫下轉(zhuǎn)化為氣體的液體是全氟戊烷。全氟戊烷的沸點是 29. 5 C- ο本發(fā)明公開的用于SiRNA傳遞的納米泡載體，其特征是納米泡粒徑范圍是20 700納米，優(yōu)選的是50 500納米，更優(yōu)選的是50 300納米，進一步優(yōu)選的是50 200 納米。由于SiRNA的水溶性，SiRNA無法包裹在納米泡內(nèi)部，而只能通過靜電作用，與納米泡外殼中的陽離子脂質(zhì)發(fā)生相互作用而進行包裹。本發(fā)明基于siRNA和納米泡的特點還專門設(shè)計了用于siRNA傳遞的納米泡載體的制備方法如下(1)將聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和陽離子脂質(zhì)溶解在有機溶劑中；(2)將含siRNA的水溶液在攪拌下加入上述溶液中；(3)揮發(fā)或透析除去有機溶劑得到含siRNA的膠束溶液；(4)在膠束溶液中加入氣體或在正常體溫下轉(zhuǎn)化為氣體的液體，并持續(xù)超聲，形成納米泡。上述制備方法中，有機溶劑優(yōu)選的是和水互溶的有機溶劑，選自乙醇、甲醇、丙酮、 異丙醇、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二氧六環(huán)、二甲基亞砜。加入的siRNA水溶液占分散介質(zhì)的有機溶液體積的5 80%，優(yōu)選的是10 50%。


圖 1. ELISA 檢測 HBsAg OD 值
具體實施例方式實施例1.載siRNA的納米泡將80mg 聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇(PLGA8000-PEG15000)、IOmgl，2- 二油 酰-3-三甲基胺基丙烷共同溶解于40mL 二甲基甲酰胺中，在磁力攪拌條件下加入5mg siRNA,轉(zhuǎn)移至截留分子量為7000的透析袋，于4L水中透析48小時，每隔12小時更換新鮮水，透析完成后，取出透析袋內(nèi)的溶液，在水浴超聲條件下，加入氣體或在正常體溫下轉(zhuǎn)化為氣體的液體，并持續(xù)超聲0. 5小時，形成納米泡。siRNA可選自各種治療疾病用siRNA，如針對乙型肝炎病毒(HBV)的序列序列1 :ACCCUUAUAAAGAAUUUGGdAdGdGdCUGGGAAUAUUUCUUAAACC序列2 :GCU⑶GCCUUGGGUGGCUUdTdTdTdTCGACACGGAACCCACCGAA序列3 :UACCGCAGAGUCUAGACUCdTdTdTdTAUGGC⑶CUCAGAUCUGAG還有抗腫瘤siRNA，如針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的siRNA。
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實驗例1.載siRNA的納米泡的體外轉(zhuǎn)染實驗1材料和方法1.1材料和儀器H印G2. 2. 15細胞株(HBV DNAayw亞型轉(zhuǎn)染肝母細胞瘤IfepG2細胞的細胞系，可分泌HBV各種病毒標志物及完整的Dane顆粒)，DMEM混合培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清，380 μ g/ mlG418，3%谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素)，乙肝病毒表面抗原、核心抗原檢測試劑盒。酶標儀，實時熒光定量PCR儀，高速臺式離心機，超低溫冰箱。載siRNA的納米泡由實施例1方法制備，siRNA序列為序列1 :ACCCUUAUAAAGAAUUUGGdAdGdGdCUGGGAAUAUUUCUUAAACC。采用的是全氟戊烷充填。1. 3HBV 的 siRNA 干擾試驗H印G2. 2. 15細胞接種到96孔板，轉(zhuǎn)染前一天換無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時。設(shè)置三組，包括載siRNA的納米泡、Lipofectamine 2000(陽性對照)、空白未給藥組，分別設(shè) 3復孔，繼續(xù)培養(yǎng)至72小時。1. 4ELISA檢測表抗與核抗及RT-PCR檢測HBV DNA的表達HBV表面抗原和核心抗原的檢測，參照試劑盒標準操作程序執(zhí)行；并用RNA抽提試劑盒分別提取各組轉(zhuǎn)染后的總RNA，進行RT-PCR的檢測。2結(jié)果與討論2. 1乙肝表面抗原檢測H印G2. 2. 15細胞與載siRNA的納米泡或其他對照一起孵育72小時，并在加入5分鐘后，37°C水浴超聲10分鐘，雙波長450/690nm讀取OD值。根據(jù)診斷試劑盒的判斷標準， 陰性對照OD值< 0. 1且陽性對照OD值> 0. 8時實驗正常，否則實驗無效，由此判斷本實驗有效。本發(fā)明中載siRNA的納米泡能明顯干擾HBsAg的復制，明顯優(yōu)于陽性對照(圖1)。2. 2RT-PCR定量檢測HBV DNA的表達參照2. 1的結(jié)果對抗HBsAg有效的實驗組進行了 RT-PCR檢測(表1)。載siRNA 的納米泡組可見明顯的DNA復制被抑制，證明其具有干擾HBV效應，明顯優(yōu)于陽性對照。表1. H印G2. 2. 15細胞中HBV DNA拷貝數(shù)
_干擾前_干擾后
陰性對照組2.47X 1051.38X 105
載 siRNA 的 Lipofectamin 1.91 X IO59.21 X IO3
載 siRNA 納米泡2.06X 1053.82X 103實驗例2.載siRNA的納米泡的體內(nèi)治療實驗1材料與方法1. 1材料與儀器采用實驗例1中的載siRNA納米泡，HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型(C57)，實時熒光定量PCR 儀。高速臺式離心機，超低溫冰箱。1. 2HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型的建立
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取4-8周18_19g的C57小鼠5只，采用水動力轉(zhuǎn)染法靜脈快速G 8s)注射含 10 μ gHBV基因組質(zhì)粒的生理鹽水(體積為小鼠體重的10% )，飼養(yǎng)兩天待用。1. 3給藥方案及血樣的制備將小鼠分為三組，每組三只陰性對照，給藥組，給藥超聲組。陰性組不做任何處理，給藥組小鼠將載siRNA納米泡經(jīng)尾靜脈注射給藥0. lmL。給藥超聲組在靜脈注射載 siRNA納米泡完畢30min后，將給藥組小鼠肝部位浸入100W超聲波清洗器37°C水浴中連續(xù)超聲30秒，分別于第五天及第十天眼眶取血0. 15mL，靜置3小時后于離心機上經(jīng)5000rpm 離心20分鐘，用移液器取血清置于0. 5mL離心管放置超低溫冰箱-70°C，待測。1.4血清樣品的測定將血清樣品用實時熒光定量PCR儀測定含量。2結(jié)果與討論2. IHBV轉(zhuǎn)染小鼠血清中HBV DNA含量變化HBV小鼠血清樣品經(jīng)PCR擴增儀進行擴增，擴增后HBV DNA含量反映藥物抑制 HBVDNA復制效果。數(shù)值越小表明LAPE自組裝體抑制HBV DNA復制效果越好。 表2. HBV轉(zhuǎn)染小鼠血液HBV DNA含量
權(quán)利要求
1.一種用于SiRNA傳遞的納米泡載體，其特征是納米泡由聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和陽離子脂質(zhì)構(gòu)成外殼，內(nèi)部充填氣體或在正常體溫下轉(zhuǎn)化為氣體的液體。
2.如權(quán)利要求1所述的用于siRNA傳遞的納米泡載體，其特征是聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物選自聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物。
3.如權(quán)利要求1所述的用于siRNA傳遞的納米泡載體，其特征是氣體選自空氣、氮氣、 氧氣、二氧化碳、全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫。
4.如權(quán)利要求1所述的用于siRNA傳遞的納米泡載體，其特征是在正常體溫下轉(zhuǎn)化為氣體的液體是全氟戊烷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米泡載體，可以在體外和體內(nèi)傳遞siRNA，并且在攜帶siRNA的納米泡經(jīng)過部位或作用部位施加超聲手段，可以促進siRNA的釋放，并起到相應的藥理作用。
文檔編號A61P1/16GK102441177SQ201110396478
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者杜麗娜, 王雙苗, 金義光 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所