專(zhuān)利名稱(chēng):大黃素在制備g蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及大黃素的新的藥用用途。
背景技術(shù):
平滑肌細(xì)胞存在于許多組織、器官之中,如消化道、血管、呼吸道、尿路平滑肌細(xì)胞等,在機(jī)體的功能活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)于胃腸平滑肌細(xì)胞而言,動(dòng)力(即收縮和舒張能力)是其功能的重要方面。通過(guò)胃腸平滑肌細(xì)胞的收縮和舒張,來(lái)實(shí)現(xiàn)消化道正常的生理功能,使胃腸內(nèi)容不斷向下傳送。研究表明調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有鈣信號(hào)介導(dǎo)和非鈣信號(hào)介導(dǎo)兩類(lèi)。非鈣信號(hào)介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞收縮的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制包括G蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制。G蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制具體如下肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)的磷酸化是決定肌球蛋白ATP酶活性的重要分子開(kāi)關(guān)。MLC^1磷酸化的狀態(tài)主要取決于 MLCK的活性,同時(shí)也受肌球蛋白激輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP) 活性的影響。傳統(tǒng)學(xué)說(shuō)認(rèn)為,肌球蛋白激輕鏈酶(myosin light chain kinase MLCK)對(duì) MLC20的磷酸化作用是鈣依賴(lài)性的。但近年來(lái)的體外研究已證明,高濃度的MLCK在無(wú)Ca++/ 鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)存在時(shí),也能使MLC^1磷酸化,這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因與無(wú)Ca++時(shí)高濃度MLCK的自動(dòng)磷酸化有關(guān),該磷酸化發(fā)生于MLCK分子自動(dòng)抑制區(qū)的第803位蘇氨酸上。MLCP由3個(gè)亞基組成130kD的肌球蛋白結(jié)合亞基,38kD的催化亞基和20kD功能未明的小亞基。細(xì)胞內(nèi)有多種途徑可抑制MLCP的活性,從而減少M(fèi)LC2tl脫磷酸化,增強(qiáng)平滑肌的收縮活動(dòng)。MLCK決定MLC的磷酸化,而MLCP可使MLC脫磷酸化。MLCK和MLCP的協(xié)同作用決定了 MLC的磷酸化程度。G蛋白耦聯(lián)的鈣敏感性調(diào)節(jié)就是通過(guò)調(diào)節(jié)MLCP活性而改變收縮單元對(duì)鈣的敏感性的一種調(diào)節(jié)方式。激動(dòng)劑通過(guò)G蛋白耦聯(lián)激活I(lǐng)^hoA(—種22-26KD的 small 611^86),隨之激活其下游的激酶1 01((詘0 associated kinase),磷酸化MLCP調(diào)節(jié)亞單位,從而抑制MLCP的活性抑制MLC2tl的脫磷酸化,增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞的收縮。綜上所述,使用G蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)劑可促進(jìn)胃腸平滑肌收縮,促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng),可有效治療胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病。
發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明人在既往的一系列研究中發(fā)現(xiàn)大黃素對(duì)大鼠胃腸平滑肌有收縮作用,但詳細(xì)的機(jī)理還不完全清楚。推測(cè)其作為G蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)劑來(lái)促進(jìn)胃腸平滑肌收縮。平滑肌細(xì)胞的收縮機(jī)制有[Ca2+] i的升高和鈣敏感性升高兩種。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)平滑肌細(xì)胞鈣鉗制技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)鈣離子鉗制在某一最佳濃度,這樣本發(fā)明所研究的細(xì)胞收縮都是通過(guò)影響細(xì)胞的鈣敏感性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)對(duì)大黃素組、大黃素+鳥(niǎo)苷二磷酸(guanosine diphosphate,⑶P)類(lèi)似物⑶P β S、⑶P類(lèi)似物⑶P β S、正常對(duì)照組這四組進(jìn)行組間及組內(nèi)不同濃度進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)大黃素對(duì)胃平滑肌細(xì)胞有收縮作用,并隨濃度的增加收縮幅度明顯增加,呈濃度依賴(lài)性;單獨(dú)應(yīng)用GDPi3 s對(duì)胃平滑肌細(xì)胞有舒張作用,并隨濃度的增加舒張幅度明顯增加,也呈濃度依賴(lài)性;GDP β s與大黃素同時(shí)應(yīng)用顯示其能拮抗抑大黃素對(duì)細(xì)胞的收縮作用,同樣也呈濃度依賴(lài)性。這就說(shuō)明大黃素能通過(guò)影響GDP起作用。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)使用I^hoA抑制劑C3_transf erase可明顯抑制大黃素的收縮作用,C3_transf erase組與對(duì)照組有明顯差異,也提示鈣敏感性調(diào)節(jié)也是大黃素發(fā)揮收縮作用的重要機(jī)制。激光掃描共聚焦顯微鏡和免疫熒光技術(shù)分析顯示MioA在平滑肌細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空分布發(fā)生明顯變化 靜息狀態(tài)下MioA主要分布在細(xì)胞漿內(nèi),當(dāng)應(yīng)用大黃素刺激后可引起MioA由胞漿向胞膜的移位,主要分布在細(xì)胞膜上。這也進(jìn)一步證明了大黃素收縮平滑肌細(xì)胞機(jī)制中包括鈣敏感性調(diào)節(jié)。從western blotting結(jié)果分析可知,大黃素組的MioA蛋白量與對(duì)照組的I^hoA蛋白量相比較明顯增高,這也更進(jìn)一步說(shuō)明大黃素能夠通過(guò)影響鈣敏感性來(lái)引起細(xì)胞收縮?;谝陨涎芯拷Y(jié)果,本發(fā)明的目的即在于提供大黃素在制備G蛋白偶聯(lián)的鈣敏感性調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。并進(jìn)一步提供一種治療胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙的靶向性更強(qiáng)的方法。
本發(fā)明附圖2幅,其中圖1是游離的平滑肌細(xì)胞顯微鏡照片。圖2是不同濃度大黃素作用下胃腸平滑肌細(xì)胞收縮變化趨勢(shì);
具體實(shí)施例方式
下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1(1)分離胃平滑肌細(xì)胞健康成年Wistar大鼠禁食兩天,脫頸處死,無(wú)菌操作取胃。生理鹽水徹底沖凈,刮去黏膜,將肌肉組織剪成約1 2mm3體積大小。應(yīng)用酶消化法收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,40g/L臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活力在95%以上。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,放入CO2孵箱培養(yǎng)。(2)制備可通透胃平滑肌細(xì)胞當(dāng)酶消化過(guò)程完成后,將消化液吸出,并用細(xì)胞質(zhì)緩沖液(mmoL/L :Nacl20,Kcl 100,Mgso45, Nah2po40. 96,Cacl2O. 61,EGTA 1,2% BSA, PH 7. 2)洗3次,洗液與消化液一起,1000r/min離心5min,棄上清,用2mL細(xì)胞質(zhì)緩沖液懸浮沉淀,并吹打成細(xì)胞懸液,細(xì)胞分散后,加入75u g/mL的皂苷孵育%iin,離心lOOOr/min 5min,沉淀重新懸浮于無(wú)皂苷含1. 5mmoL/LATP, 5mmoL/L磷酸肌酸,10U/mL肌酸磷酸激酶的細(xì)胞質(zhì)緩沖液中。(3)平滑肌細(xì)胞鈣鉗制技術(shù)及實(shí)驗(yàn)分組如上處理細(xì)胞后,根據(jù)Ca2+EGTA的平衡結(jié)合常數(shù)K進(jìn)行計(jì)算。將高濃度EGTA(IOmmoVL)和具一定Ca2+濃度的溶液按一定比例混合, 可獲得所需Ca2+濃度的溶液。將胞漿游離Ca2+濃度鉗制在某一要求的水平,這樣可以觀(guān)察不依賴(lài)胞漿游離Ca2+濃度的細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程。據(jù)文獻(xiàn)把[Ca2I1濃度鉗制在Pka = 6. 3這一最佳水平,并將實(shí)驗(yàn)分四組①大黃素,②大黃素+GDP類(lèi)似物⑶P β s,③⑶P類(lèi)似物⑶P β s, ④正常對(duì)照組。各組均分五個(gè)濃度梯度大黃素組為1,5,10,50,100 μ moL/L ;⑶P β s組為 10,50,100,500,1000 μ moL/L ;大黃素+GDP β s組為前兩組濃度相應(yīng)——配伍而成。
(4)測(cè)定平滑肌細(xì)胞收縮取0.25mL細(xì)胞懸液,按步驟(3)中分組要求加入相應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)試劑,30S后加入2. 5mL/L戊二醛終止反應(yīng)。對(duì)照組加入相同體積緩沖液,亦于 30S后加入戊二醛終止反應(yīng)。應(yīng)用圖象分析系統(tǒng)測(cè)定平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度,隨機(jī)測(cè)定50個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)度。平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)的計(jì)算公式為收縮變化百分?jǐn)?shù)=(用藥組平均長(zhǎng)度-對(duì)照組平均長(zhǎng)度)/對(duì)照組細(xì)胞平均長(zhǎng)度X 100%。(5)免疫熒光共聚焦顯微鏡MioA成像收集已鈣鉗制好的細(xì)胞接種于六孔板中的蓋玻片上,培養(yǎng)基為含20%胎牛血清的DMEM。用免疫熒光方法標(biāo)記4%多聚甲醛固定 IOmin, PBS 沖洗 3 次,5min/ 次;然后 0. 2% Triton-IOO 作用 IOmin, PBS 沖洗 3 次,5min/ 次;一抗鼠單克隆抗-MioA IgG 37°C孵育lh,PBS沖洗3次,5min/次;二抗孵育lh,PBS沖洗3次,5min/次;緩沖甘油封片,激光共聚焦顯微鏡檢測(cè),F(xiàn)ITC激發(fā)波長(zhǎng)為488nm,發(fā)射波長(zhǎng)為520nm??瞻讓?duì)照組只與與二抗孵育。沿細(xì)胞縱軸(Z-軸)以0.4μπι間距行斷層掃描,收集各縱軸平面I^hoA分布信息。設(shè)定膜周邊區(qū)(peripheral)為細(xì)胞外圍15%區(qū)域,其平均熒光強(qiáng)度值為P值,其余70 %區(qū)域?yàn)榘麧{區(qū)(cytosolic),其平均熒光強(qiáng)度值為C值。 不同平面的P/C值代表IihoA在平滑肌細(xì)胞內(nèi)的空間分布。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均以( 士幻表示,采用Mudent's t-test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。P <0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)檢測(cè)結(jié)果(7a)大黃素對(duì)胃平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度的影響倒置顯微鏡下,分離的正常胃平滑肌細(xì)胞呈梭形,長(zhǎng)度各異,有的處于舒張狀態(tài),有的處于不同程度的收縮狀態(tài)下,細(xì)胞的長(zhǎng)度在67 μ m 141 μ m之間,平均長(zhǎng)度為 96. 22士 16. 12 μ m,如附圖 1 所示。(7b)大黃素對(duì)胃平滑肌細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,可見(jiàn)大黃素對(duì)胃平滑肌細(xì)胞有收縮作用,與濃度正相關(guān); GDPi3 s對(duì)胃平滑肌細(xì)胞有舒張作用,也與濃度正相關(guān);GDPi3 s并能抑制大黃素的收縮作用,也呈濃度依賴(lài)性,各組間不同濃度SMC平均長(zhǎng)度(μπι)及各組間SMC平均長(zhǎng)度(μπι)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1。表 權(quán)利要求
1.大黃素在制備G蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)大黃素的新用途,即大黃素在制備G蛋白耦聯(lián)鈣敏感性調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。大黃素可通過(guò)促進(jìn)G蛋白耦聯(lián)的鈣敏感性發(fā)揮收縮作用,可用于制備G蛋白耦聯(lián)的鈣敏感性調(diào)節(jié)劑,并靶向性地用于促進(jìn)胃平滑肌細(xì)胞收縮。
文檔編號(hào)A61P1/06GK102406633SQ20111039716
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者吳斌, 齊清會(huì) 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院