專利名稱：一種灰樹花多糖zzk組分及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種灰樹花多糖TUL組分及其制備方法。對灰樹花子實體進行粉碎， 提取等步驟得到一種灰樹花多糖za(組分，該多糖主要由葡萄糖和甘露糖組成，可用于制作食品添加劑，各種藥物制劑。本發(fā)明屬于食品加工，醫(yī)藥工業(yè)相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自20世紀80年代始，國內(nèi)外學者對灰樹花多糖進行了大量研究，從灰樹花子實體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖，其中包括D-組分、MD組分、Grifolan組分、T-2組分等具有顯著生理活性的組分。這些組分的共同特征就是由β_1，3連接和β_1，6連接的葡萄糖組成，并含有一定量的蛋白質(zhì)。Nanba等從灰樹花中提取到的純化灰樹花多糖D-組分和MD-組分是成功的典范。 D-組分為灰樹花子實體的酸不溶、堿溶性熱水提取物，相對分子質(zhì)量約為1. 4Χ106,是一種由高度分化的β_1，3連接為主鏈和β-1，6為支鏈的蛋白聚糖，蛋白含量約為30%，提取率約為0.4%，D-組分進一步分離可以得到E、F等組分。MD-組分相對分子質(zhì)量約為1X106， 蛋白含量小于20%，來自于灰樹花子實體或菌絲體，是在改進D-組分提取工藝基礎(chǔ)上進一步純化的產(chǎn)物，與D-組分具有相同的β-葡聚糖結(jié)構(gòu)。ΜΤ-2組分即E-組分，也是一種酸不溶性、堿溶性多糖,是MT-I即D-組分經(jīng)kpharose CL-4B柱和DEAE-S印harose CL-6B柱進一步純化后的產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量約為2X106，蛋白含量0.6%，提取率約為0.014%，為含 β_1，3支鏈的β_1，6葡聚糖。Kubo等在進行灰樹花子實體多糖分離過程中，發(fā)現(xiàn)熱水提取物中加入一倍量乙醇后產(chǎn)生了懸浮物，離心分離后得到一種糖蛋白，即χ-組份(糖蛋白=65 35)，相對分子質(zhì)量5Χ105。結(jié)構(gòu)分析表明，X-組份為具有α-1，4分支的β-1， 6葡聚糖，口服給藥時具有顯著的降血糖活性。勞華均等(上海農(nóng)業(yè)學報，1997，13，(1) 25 30)從灰樹花子實體中提取得到灰樹花粗多糖GFP，實驗證明該粗多糖對于小鼠Lewis肺癌和Colon癌均有顯著的抑制作用。喬彥茹等(食用菌學報，2010，17 ) :48 51)從灰樹花子實體中提取得到一種灰樹花多糖GFP75-2-2B，該多糖由巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，其摩爾比為 1.0 1.3 3.6 4.0 4. 5，重均分子量小于8000道爾頓，該多糖具有明顯刺激巨噬細胞分泌NO的活性，NO的分泌能夠增強巨噬細胞對病原微生物、腫瘤細胞等有害物質(zhì)的作用，是巨噬細胞活化的主要特征之一。Feng jie-cui等從灰樹花中提取出來一種多糖蛋白(Toxicology in vitro 21，2007，417 427)，該多糖由α連接的葡萄糖、半乳糖為主鏈，支鏈由阿拉伯糖組成，蛋白含量約16%，重均分子量21KD。該多糖可以抑制SGC-7901 細胞的增長，具有一定的抗腫瘤活性。李小定等從灰樹花子實體中提取得到四個多糖組分 PGFl 4(華中農(nóng)業(yè)大學學報，2002年4月21卷第2期186 188)，對PGFl進行成分分析，結(jié)果表明PGFl是一種β葡聚糖，該多糖重均分子量11萬道爾頓，單糖組成為葡萄糖， 含有1. 的蛋白質(zhì)。作者未對PGFl多糖做進一步的純化得到純品多糖并進行結(jié)構(gòu)分析。目前國內(nèi)外學者對灰樹花多糖的研究還處于一個起步階段，通過對灰樹花粗多糖的分離得到各種組分如D組分等，這些組分實質(zhì)上仍然屬于灰樹花粗多糖。比如D組分還可以進一步純化為MD、E或F組分。沒有確定灰樹花多糖的確切有效單體成分及確切結(jié)構(gòu)。 這大大阻礙了灰樹花多糖做為藥品尤其是注射劑類藥品的開發(fā)。目前國內(nèi)已經(jīng)上市的多糖類藥品如注射用香菇多糖就具有明確化學結(jié)構(gòu)，有明確的重均分子量范圍。2002年浙江方格藥業(yè)有限公司第一個在國內(nèi)獲得灰樹花多糖藥品批準文號即國藥準字B20020023，使得灰樹花多糖真正成為上市藥品，劑型為膠囊劑，內(nèi)容物為灰樹花粗多糖。目前國內(nèi)市場上僅有方格藥業(yè)一家獲得灰樹花膠囊劑的藥品批文，沒有企業(yè)獲得灰樹花注射劑的批文。本發(fā)明所述灰樹花多糖組分是以灰樹花子實體為原料，經(jīng)干燥，粉碎，提取， 純化等工藝分離得到的一種β葡甘聚糖(zao，該組分在之前的文獻中未見報道。其主要單糖組成是葡萄糖和甘露糖，重均分子量在38 75萬道爾頓，具有顯著的抗腫瘤活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種灰樹花多糖TDL組分，該多糖組分是從灰樹花子實體中提取的一種特異性結(jié)構(gòu)多糖，該組分多糖此前未有文獻報道方法，屬于新發(fā)現(xiàn)的一種灰樹花多糖組分。本發(fā)明還提供了 za(組分的提取方法?；覙浠ㄗ訉嶓w經(jīng)干燥，粉碎，熱水提取，超濾濃縮，無水乙醇多次沉淀，大孔樹脂純化，Sephacryl凝膠純化分離，洗脫液干燥得到灰樹花多糖ZZk組分。動物實驗表明TUL組分具有顯著的抗腫瘤活性。制備灰樹花多糖ZZk組分的優(yōu)選的提取工藝具體步驟為一、灰樹花子實體的干燥，粉碎為了方便灰樹花子實體的粉碎，因此需要對灰樹花子實體進行充分干燥。干燥的溫度不宜過高，設(shè)定在50 60°C之間即可。干燥后的灰樹花子實體使用粉碎機粉碎為細粉 (能通過5號篩或80目的粉不少于95% )。二、提取灰樹花細粉適量，加10倍體積的熱水100°C提取2小時，采用離心或過濾方法進行固液分離，殘渣棄去，澄清的提取液備用。三、濃縮步驟“二、提取”中的提取液適量用超濾膜處理，膜孔徑為截留重均分子量80萬大小，能通過超濾膜的部分再用截留重均分子量20萬道爾頓大小孔徑的超濾膜反復處理，保留不能通過膜的部分(濃縮液)備用，此濃縮液主要含有重均分子量20 80萬道爾頓的灰樹花多糖。四、沉淀取步驟“三、濃縮”中濃縮液適量，加2倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜， 過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀研細，加30倍量的水100°C提取2小時，離心，上清加3倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜，過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀再次研細，加30倍量的水依上法復溶、沉淀、烘干即得灰樹花粗多糖。五、大孔樹脂純化取灰樹花粗多糖適量，加50倍量的水100°C提取2小時，離心，上清通過大孔樹脂DlOl所裝的柱子進行純化，洗脫液為水。收集洗脫液主峰，在下一步中用S^hacryl S-400HR繼續(xù)純化。六、Sephacryl 純化上述大孔樹脂洗脫液主峰用kphacryl S-400HR所裝的柱子進行純化，洗脫液為水。收集洗脫液峰面積最大的主峰，重復步驟“五、大孔樹脂純化”和“六、S^hacryl純化” 數(shù)次，直至kphacryl S-400HR洗脫圖譜只有一個均一的主峰為止。七、干燥取“六、S^hacryl純化”步驟獲得的均一主峰溶液，冷凍干燥即得灰樹花多糖ZI 組分。綜上所述的制備過程，優(yōu)選的工藝為灰樹花子實體經(jīng)50 60°C干燥，粉碎成細粉。加10倍體積的熱水100°C提取2小時，離心除去殘渣，離心所得上清液用截留重均分子量80萬道爾頓大小的超濾膜超濾，能通過膜的部分接著用截留重均分子量20萬道爾頓的超濾膜超濾濃縮，不能通過的部分即濃縮液。濃縮液加2倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。 靜置過夜，過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀研細，加 50倍量的水100°C提取2小時，離心，上清加3倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜， 過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀再次研細，加50倍量的水依上法復溶、沉淀、烘干即得灰樹花粗多糖。取灰樹花粗多糖適量，加50倍量的水 100°C提取2小時，離心，上清依次用大孔樹脂DlOl所裝的柱子和kphacryl S-400HR所裝的柱子反復純化3次，洗脫液為水。收集洗脫液峰中面積最大的主峰冷凍干燥即得灰樹花多糖ZI組分?；覙浠ǘ嗵荰Ok組分的結(jié)構(gòu)信息為1、單糖組成分析參照文獻(戴軍等，分析測試學報，第沈卷第2期P206 216)采用PMP (1_苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化分析方法對灰樹花多糖ZI組分進行單糖組成分析，結(jié)果表明ZI組分的單糖組成主要由葡萄糖和甘露糖組成，葡萄糖和甘露糖的量為1 1。2、連接方式# M(Jansson P E et al. A practical guide to the methylation analysis of carbohydrates. Chem. Commun. , 1976,8(15) :1 74)采用部分甲基化方法對灰樹花多糖ZI組分進行連接方式分析，結(jié)果表明Z3(組分是由1，3連接的葡萄糖和1，6 連接的甘露糖組成的葡甘聚糖。3、部分酸水解取灰樹花ZI組分0. 5克，加0. lmol/L硫酸溶液2mL，密封，80°C保溫15分鐘，用 0. 2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)溶液pH值至近中性。用截留重均分子量3000的透析袋流水透析過夜，袋內(nèi)液體干燥后得部分酸水解的ZI組分，對此組分進行糖組成和連接方式分析， 結(jié)果表明與未水解的Za(組分一致，即由1 1的1，3連接的葡萄糖和1，6連接的甘露糖組成。4、重均分子量以Dextran系列葡聚糖為對照品，測定5批TLY的重均分子量，結(jié)果表明5批TDk 的重均分子量分別為38萬，42萬，56萬，64萬和75萬。
5、紅外掃描(構(gòu)型)紅外掃描結(jié)果表明ZI樣品在890CHT1有弱吸收峰，840cm"1無吸收，說明ZI組分是β構(gòu)型，不含α構(gòu)型。6、紫外掃描紫外掃描結(jié)果表明ZI樣品在270 290區(qū)域無吸收峰，說明樣品中不含蛋白質(zhì)。7、含量測定采用硫酸苯酚法測定5個批次的TUk樣品多糖含量，結(jié)果表明多糖含量均在95% 以上。8、比旋度測定溫度按中國藥典為20°C，按中國藥典二部附錄依法測定，經(jīng)測定5批Ζ3(的比旋度分別為 3. 2,4. 3,2. 6,2. 5 和 3. 4。9、結(jié)構(gòu)分析通過上述1 7的實驗，可以得出ZI組分是1，3連接的葡萄糖和1，6連接的甘露糖組成的β-葡甘聚糖，兩種單糖摩爾比為1 1，重均分子量在38 75萬之間，具有如下重復單元-3Glc3 l_6Man3 1-所述的灰樹花多糖TUL組分可應用于制備抗腫瘤藥物，也可將這種灰樹花多糖 ZI用于制成食品、保健食品或食品添加物，應用于患有癌癥的病人。灰樹花多糖ZI組分腹腔注射Q0mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)給藥10天，香菇多糖(天地欣)為對照，結(jié)果表明灰樹花多糖ZI組分3種劑量對小鼠S-180瘤均具有顯著抑制作用。其中TUL組分50mg/kg與天地欣20mg/kg給藥劑量抑瘤率無顯著差別，均高于80%。提示灰樹花多糖TUL組分可以用于抗腫瘤藥物的制備。(四)說明書附圖
無
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1灰樹花多糖TDk組分的制備灰樹花子實體干品1公斤，在鼓風干燥箱內(nèi)50°C干燥5小時，用打粉機粉碎成細粉，過5號篩網(wǎng)得細粉0. 98公斤。加IOL熱水至細粉中，攪拌均勻，煮沸提取2小時，提取物用板框過濾除去殘渣得澄清提取液，提取液用截留重均分子量80萬大小的超濾膜超濾，能通過膜的部分(重均分子量小于80萬)接著用截留重均分子量20萬的超濾膜超濾濃縮，不能通過20萬的部分(重均分子量大于20萬)即濃縮液。濃縮液加2倍體積的無水乙醇， 邊加邊攪拌。靜置過夜，離心得沉淀，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C 烘干得沉淀5. 6克。干燥后的沉淀研細，加^OmL水100°C提取2小時，離心，上清加3倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜，過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2 次，80°C烘干。沉淀再次研細，加50倍量的水依上法復溶、沉淀、烘干即得灰樹花粗多糖共 3. 8克。取灰樹花粗多糖3. 8克，加190mL水100°C提取2小時，離心，上清依次用大孔樹脂DlOl所裝的柱子和kphacryl S-400HR所裝的柱子反復純化3次，洗脫液為水。收集洗脫液峰面積最大的主峰冷凍干燥即得灰樹花多糖TUL組分1. 5克。實施例2灰樹花多糖TUk組分的制備灰樹花子實體鮮品10公斤，在鼓風干燥箱內(nèi)60°C干燥15小時，用打粉機粉碎成細粉，過5號篩網(wǎng)得細粉1. 2公斤。加12L熱水至細粉中，攪拌均勻，煮沸提取2小時，提取物用板框過濾除去殘渣得澄清提取液，提取液用截留重均分子量80萬大小的超濾膜超濾，能通過膜的部分(重均分子量小于80萬)接著用截留重均分子量20萬的超濾膜超濾濃縮， 不能通過20萬的部分(重均分子量大于20萬)即濃縮液。濃縮液加2倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜，離心得沉淀，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次， 80°C烘干得沉淀6. 5克。干燥后的沉淀研細，加325mL水100°C提取2小時，離心，上清加3 倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜，過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀再次研細，加50倍量的水依上法復溶、沉淀、烘干即得灰樹花粗多糖共4. 7克。取灰樹花粗多糖4. 7克，加235mL水100°C提取2小時，離心，上清依次用大孔樹脂DlOl所裝的柱子和kphaCrylS-400HR所裝的柱子反復純化3次，洗脫液為水。收集洗脫液峰面積最大的主峰冷凍干燥即得灰樹花多糖TUL組分1. 7克。實施例3灰樹花多糖TUk組分的結(jié)構(gòu)分析取實施例1中Z3(組分3批(批號20100401，20100402，20100402)和實施例2中的 Za(組分3批(批號20100501，20100502)適量進行結(jié)構(gòu)分析。單糖組成分析采用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化法；單糖的連接方式采用部分甲基化部分乙?；ǚ治觯?多糖構(gòu)型采用紅外分析法；蛋白檢測采用紫外掃描；重均分子量采取高效液相凝膠滲透色譜法(GPC)測定，檢測器使用示差檢測器；按中國藥典二部規(guī)定對5批Z3(組分的比旋度依法測定，測定溫度20°C。5批樣品分別進行部分酸水解，具體為za(組分0.5克加0. Imol/ L硫酸溶液2mL，密封，80°C保溫15分鐘，用0. 2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)溶液pH值至近中性。用截留重均分子量3000的透析袋流水透析過夜，袋內(nèi)液體干燥后得部分酸水解的TUk 組分，對此組分進行糖組成和連接方式分析。以上測試結(jié)果如下5批ZI組分單糖組成測定結(jié)果如下表1 表 權(quán)利要求
1.一種灰樹花多糖ZI組分，其特征在于所述的灰樹花多糖是由1，3連接的葡萄糖和 1，6連接的甘露糖組成的β-葡甘聚糖，兩種單糖的摩爾比例為1 1，重均分子量在38 75萬道爾頓之間，具有如下重復單元-3Glc3 l-6Man β 1-
2.制備如權(quán)利要求1所述的制備灰樹花多糖TDk組分的方法，其特征在于灰樹花子實體經(jīng)干燥，粉碎，熱水提取，離心，膜分離截留重均分子量20 80萬道爾頓范圍，乙醇沉淀， 水復溶再次乙醇沉淀，大孔樹脂DlOl柱子和kphacrylS-400HR柱子反復純化，收集洗脫液峰面積中最大的主峰冷凍干燥即得灰樹花多糖TUL組分。
3.如權(quán)利要求1 2所述的灰樹花多糖TUL組分所用的提取原料是灰樹花子實體。
4.如權(quán)利要求1 2所述的灰樹花多糖TUk組分的制備方法，其特征在于所述的方法如下灰樹花子實體經(jīng)50 60°C干燥，粉碎成細粉。加10倍體積的熱水100%提取2小時，離心除去殘渣，離心所得上清液用截留分子量80萬道爾頓大小的超濾膜超濾，能通過膜的部分接著用截留分子量20萬道爾頓的超濾膜超濾，不能通過的部分即濃縮液，分子量在20 80萬道爾頓。濃縮液加2倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜，過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀研細，加50倍量的水100°C提取2小時，離心，上清加3倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過夜，過濾，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌2次，80°C烘干。沉淀再次研細，加50倍量的水依上法復溶、乙醇沉淀、烘干即得灰樹花粗多糖。取灰樹花粗多糖適量，加50倍量的水100°C提取2小時， 離心，上清依次用大孔樹脂DlOl所裝的柱子和kphacryl S-400HR所裝的柱子反復純化3 次，洗脫液為水。收集洗脫液峰面積中最大的主峰冷凍干燥即得灰樹花多糖TUL組分。
5.如權(quán)利要求1 2所述的灰樹花多糖TEk組分在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種灰樹花多糖ZZK組分及其制備方法。以灰樹花中子實體為原料，經(jīng)干燥，粉碎，提取，純化等工藝分離得到的一種β葡甘聚糖(ZZK)。其主要單糖組成是葡萄糖和甘露糖，重均分子量在38～75萬道爾頓，具有顯著的抗腫瘤活性。
文檔編號A61K31/736GK102408494SQ20111039899
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者張萍, 楊勇杰, 楊小麗, 毛延卿, 鄭寶芬 申請人:杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司