專利名稱：用于哮喘預(yù)防和免疫治療的嵌合型DNA疫苗Hsp70/CD80的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種哮喘預(yù)防和免疫治療的嵌合型DNA疫苗Hsp70/CD80。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘(哮喘)是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的一種慢性疾病。目前，全球已有約3億哮喘患者，而我國(guó)有約2千萬(wàn)哮喘患者。哮喘患者隨著疾病的進(jìn)展，其肺功能進(jìn)行性惡化，治療難度增加，亦影響疾病的轉(zhuǎn)歸。當(dāng)前認(rèn)為，這主要在于氣道持續(xù)性損傷和結(jié)構(gòu)改變，即氣道重塑，因而引起廣泛的重視。上皮腺體增生和黏液性化生，導(dǎo)致黏液分泌過多，黏液栓阻塞氣道，促使支氣管狹窄，甚至閉塞，以及基底膜的增厚和氣道平滑肌的增生與肥大，促使氣道壁的增厚是慢性哮喘和重癥難治性哮喘的重要特征，在致死性哮喘中尤為關(guān)出。目前治療哮喘的常用藥物對(duì)氣道重塑的治療作用有限，早期使用糖皮質(zhì)激素可能對(duì)網(wǎng)狀基底膜增厚有一定作用，且長(zhǎng)期使用可產(chǎn)生副作用。過敏原特異性防治可以使病人癥狀達(dá)到較長(zhǎng)期的緩解，但對(duì)適應(yīng)癥有一定要求(如高IgE病人)，需長(zhǎng)期使用并有一定的危險(xiǎn)(甚至造成病人死亡)。一般認(rèn)為氣道重塑一旦發(fā)生即難以逆轉(zhuǎn)，所以深刻理解哮喘氣道重塑的發(fā)病學(xué)以及尋求更安全、有效的防治方法對(duì)其控制和治愈是當(dāng)前迫切需要解決的重要問題。哮喘的氣道重塑的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，但免疫反應(yīng)異常在其發(fā)病過程中起重要作用。調(diào)節(jié)哮喘機(jī)體的免疫平衡是重要的防治策略，也是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。Mosmann等提出的Thl/Th2細(xì)胞平衡理論一直作為哮喘發(fā)病機(jī)制的核心。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Thl細(xì)胞是前炎癥細(xì)胞，其促炎癥作用超過了抗炎癥作用，與Thl細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)并不下調(diào)哮喘，而在Th2細(xì)胞免疫介導(dǎo)的疾病中哮喘的發(fā)病率也并未增高。因此，單純的Thl/Th2細(xì)胞平衡理論不足以解釋哮喘全部的發(fā)生發(fā)展過程。有研究證明哮喘患者肺泡灌洗液中CD4T細(xì)胞增加，說明CD4細(xì)胞在哮喘發(fā)病中也起到了作用。實(shí)際上，CD4T細(xì)胞至少包括了 4個(gè)亞群。輔助作用是CD4T細(xì)胞的重要功能，CD4T細(xì)胞的各個(gè)亞群主要通過輔助功能調(diào)節(jié)著機(jī)體的免疫反應(yīng)。近年來研究表明，除Thl和Th2效應(yīng)細(xì)胞外，其它一些⑶4T細(xì)胞亞群在哮喘發(fā)病中也起了重要作用。如CD17與嗜中性細(xì)胞炎癥有關(guān)；與免疫耐受有關(guān)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在控制哮喘的發(fā)病中起重要作用。這些細(xì)胞亞群可由于接受信號(hào)的差異、信號(hào)傳導(dǎo)途徑的不同、轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)、分泌不同細(xì)胞因子等加以區(qū)別，這些CD4T細(xì)胞亞群的分析探討也是近年來哮喘研究中逐步開始的熱點(diǎn)。調(diào)節(jié)哮喘機(jī)體的免疫平衡的方法大體分為過敏原特異性的防治和過敏原非特異性防治兩類，過敏原非特異性防治方法能從各種變應(yīng)原所致免疫反應(yīng)的共同途徑著手進(jìn)行干預(yù)，是支氣管哮喘免疫 防治的重要策略。DNA疫苗是近年來研究的一種新型疫苗，具有成分清楚、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而成為免疫調(diào)節(jié)劑的較好選擇，其獨(dú)特的免疫方式和良好的免疫效果而倍受關(guān)注。
熱休克蛋白是一類具有重要生物和免疫功能的高度保守的蛋白質(zhì)，存在于原核和真核細(xì)胞中。分支桿菌HSP70包含多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，具有免疫優(yōu)勢(shì)抗原的特點(diǎn)，能誘導(dǎo)出明顯的Thl型細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。CD80是重要的具有免疫活化功能的共刺激分子之一。⑶80與其共刺激受體⑶28和/或CTLA-4間相互作用可提供T細(xì)胞活化所必需的協(xié)同刺激信號(hào)，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫具有全面的活化作用。在之前公開的專利CN1562362A中，將結(jié)核桿菌HSP70基因與人CD80基因拼接構(gòu)成結(jié)核菌HSP70/人CD80嵌合DNA真核表達(dá)質(zhì)粒，即HSP70/CD80嵌合DNA疫苗。其中具體使用的質(zhì)粒載體為pcDNA3.1 (+)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該嵌合DNA質(zhì)粒，對(duì)結(jié)核菌有很強(qiáng)的抑制作用，顯示出明顯免疫預(yù)防及治療作用?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，我們認(rèn)為HSP70/CD80嵌合DNA疫苗可能從干預(yù)各種變應(yīng)原所致免疫反應(yīng)的共同途徑著手，形成防治哮喘的另一方法。也在實(shí)驗(yàn)中證明了其功效，并發(fā)表于《中華結(jié)核和呼吸病雜志》2009年第9期。PVAXI是在載體pcDNA3.1的基礎(chǔ)上改建而成的一種真核表達(dá)載體，大小為3.0kb。該質(zhì)粒用卡那霉素抗性篩選基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性篩選基因，能最大程度地減少抗性篩選基因和人類基因組發(fā)生重組的可能性。PVAXl含有多個(gè)克隆酶切位點(diǎn)允許同時(shí)克隆多個(gè)大片段的目的基因，強(qiáng)含一段KozaK的翻譯起始序列和一個(gè)起始密碼子(ATG)以引導(dǎo)正確的翻譯，典型的KozaK共有序列為“ANNATGG”，其-3位中的A啟動(dòng)子pCMV和BGH poly A信號(hào)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白。pVAXI又是一種非融合載體，在插入序列中還需包括一個(gè)終止密碼子以正確終止基因表達(dá)。PVAXl是由美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì)(FDA)推薦的可以應(yīng)用于人體實(shí)驗(yàn)的載體質(zhì)粒。但是，由于該先前報(bào)道的HSP70/CD80嵌合DNA疫苗中使用的載體均是pcDNA3.1，但是該載體具有氨芐青霉素的抗性，進(jìn)行藥品的制備時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)氨芐青霉素敏感的生產(chǎn)者過敏反應(yīng)，另外，該疫苗的應(yīng)用效果也還不夠理想。但pVAXI能否適用于裝載HSP70/⑶80嵌合蛋白的編碼基因，轉(zhuǎn)載之后會(huì)有何效果，均無(wú)報(bào)道，也難以推斷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有的pcDNA3.1-HSP70/⑶80嵌合疫苗藥效還不夠理想以及安全性不夠好。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種新的嵌合型DNA疫苗。該嵌合型DNA疫苗為含有如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的編碼基因并能在體內(nèi)將其表達(dá)的的pVAXI質(zhì)粒:(a) SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)；(b)在SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與(a)所述的蛋白質(zhì)具有相同或相似功能的蛋白質(zhì)。其中，上述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所述。其中，上述的編碼基因連接在pVAXI質(zhì)粒上，由pVAXI質(zhì)粒的CMV啟動(dòng)子控制其表達(dá)。具體可以連接在連接在pVAXI質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，由CMV啟動(dòng)子操縱其表達(dá)；如使用Xbal和Hind III雙酶切的方式連入。其中，上述嵌合型DNA疫苗中所述pVAXI質(zhì)粒的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。本發(fā)明還提供了上述的嵌合型DNA疫苗在制備預(yù)防或免疫治療哮喘的藥物中的用途。
本發(fā)明同時(shí)也提供了以上述的嵌合型DNA疫苗為主要活性成分制備成的預(yù)防或免疫治療哮喘的藥物。上述嵌合型DNA疫苗中的蛋白質(zhì)編碼基因序列是可操作地連于pVAXI質(zhì)粒中，以使其能啟動(dòng)該蛋白質(zhì)編碼基因序列的轉(zhuǎn)錄。在以前于結(jié)核病及哮喘的防治研究中使用的載體是pcDNA3.1(+)，但是由于該載體具有氨芐青霉素的抗性，在大規(guī)模制備該載體以用于藥品生產(chǎn)的過程中會(huì)導(dǎo)致對(duì)氨芐青霉素敏感的生產(chǎn)者過敏反應(yīng)，所以考慮轉(zhuǎn)用其他的載體進(jìn)行嵌合型DNA疫苗的制備。在研發(fā)過程中意外的發(fā)現(xiàn)，并經(jīng)過后繼的實(shí)驗(yàn)證明使用PVAXI載體替換pcDNA3.1 (+)載體裝載結(jié)核菌HSP70/人CD80嵌合蛋白的編碼基因所制備成的嵌合型DNA疫苗，在用于哮踹的預(yù)防和治療具有明顯更好的效果，尤其是能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的Thl型反應(yīng)，也使實(shí)驗(yàn)對(duì)象的IFN-Y明顯增高。在提高了嵌合疫苗的安全性的同時(shí)，還出人意料的大幅度地提高了藥效，具有更好應(yīng)用前景。


圖1、pVAX1-Hsp70/CD80經(jīng)內(nèi)切酶Hind III和Xba I雙酶切前后的瓊脂糖電泳圖。圖2、Western blot 檢測(cè) pVAXl_Hsp70/CD80 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞的蛋白質(zhì) 24、46、72 小
時(shí)真核表達(dá)結(jié)果。圖3、pVAX1-Hsp70/CD80mRNA各時(shí)段體內(nèi)表達(dá)分布的RT-PCR結(jié)果。分別表示接種7天、接種15天、30天、180天后在體內(nèi)體內(nèi)表達(dá)分布的情況。圖4、Rear time PCR檢測(cè)IFN- Y和IL-4基因表達(dá)的結(jié)果。圖5、預(yù)防性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織切片HEX400。A對(duì)照組氣道周圍少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)哮喘組氣管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其中有大量的嗜酸性粒細(xì)胞，氣道上皮有損傷、斷裂；C載體組氣管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其中有大量的嗜酸性粒細(xì)胞；D疫苗組氣管周圍有炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。圖6、不同濃度乙酰甲膽堿(mg/ml)刺激后各組氣道阻力的變化圖7、預(yù)防性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)各組小鼠BALF中IFN- Y和PGE2 (前列腺素2)水平。A:與哮喘組比較，HSP70/⑶80嵌合質(zhì)粒組和對(duì)照組小鼠BALF中IFN-Y水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義/P < 0.05，η = 10 ；B:與哮喘組小鼠比較，HSP70/⑶80嵌合質(zhì)粒組PGE2水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.*P > 0.05，η = 10。圖8、預(yù)防性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)各組小鼠BALF中IFN-Y和IL_4水平。A 與哮喘組比較，疫苗組和對(duì)照組小鼠BALF中IFN-Y水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P
<0.050，η = 5 ；B:與哮喘組小鼠比較，疫苗組IL-4水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P >
0.050，η = 5。圖9、預(yù)防性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)各組小鼠T-bet、GATA_3基因的表達(dá)水平。與哮喘組相比，疫苗組GATA-3降低，T-bet/GATA-3升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.050);各組T-bet差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.050)。圖10、治療性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織切片X400。圖11、治療性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)各組小鼠CCR3和CCR5在脾臟組織的表達(dá)水平。疫苗組和哮喘組比較，CCR5/CCR3的比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖12、治療性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)AB-PAS染色肺組織杯狀細(xì)胞切片X400。圖13、治療性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)各組小鼠T-bet及GATA-3在脾臟組織的表達(dá)水平。疫苗組和哮喘組比較，T-bet/GATA-3的比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如 Sambrook J, Russell D.W., 2001,Molecular Cloning:A laboratory manual (3rded), Spring Harbor Laboratory Press中所述的條件。或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一本發(fā)明pVAX1-Hsp70/⑶80載體的構(gòu)建和鑒定(一 )材料及試劑:pVAXI 質(zhì)粒(invitrogen 公司)，LIP0FECTAMINE 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試齊[J(invitrogen 公司)內(nèi)切酶 Hind II1、Xba I 和 T4 連接酶(NEB 公司)。PcDNA3.rHsp70/0)80質(zhì)粒根據(jù)背景技術(shù)的記載構(gòu)建。Hsp70單抗(Lifespan Biosciences公司)，0)80單抗(abeam公司)，Western blot試劑(上海碧云天生物公司)。( 二)構(gòu)建過程將PcDNA3—Hsp70/CD80質(zhì)粒、載體pVAXI經(jīng)過內(nèi)切酶Hind III和Xba I雙酶切后，用T4連接酶將 目的基因Hsp70/⑶80連接到pVAXI上，構(gòu)建成pVAX1-Hsp70/⑶80。將構(gòu)建成的質(zhì)粒送上海生工生物公司測(cè)序驗(yàn)證。(三)pVAXI_Hsp70/CD80鑒定:pVAX1-Hsp70/CD80經(jīng)內(nèi)切酶Hind III和Xba I雙酶切前后的瓊脂糖電泳圖見圖1。電泳結(jié)果符合預(yù)期，表明其建立成功。送上海生工生物公司測(cè)序后證實(shí)該質(zhì)粒構(gòu)建成功，其核苷酸序列見SEQ ID N0.3。實(shí)施例二本發(fā)明pVAX1-Hsp70/⑶80表達(dá)及生物分布檢測(cè)(一 )真核表達(dá)驗(yàn)證將pVAX1-Hsp70/CD80 質(zhì)粒 4 μ g (2 μ I)用 LIP0FECTAMINE 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑10 μ I包裹后轉(zhuǎn)染到293Τ細(xì)胞，分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)收獲細(xì)胞，加入裂解液釋放蛋白質(zhì)，離心取上清與5χ上樣緩沖液混勻并煮沸使蛋白質(zhì)變性。SDS-page電泳、轉(zhuǎn)膜。分別加入Hsp70、⑶80 —抗4°C孵育過夜，洗膜后二抗孵育一小時(shí)。洗膜后用化學(xué)發(fā)光法見70kD(Hsp70)和32KD(CD80)有單一條帶(結(jié)果見圖2)，說明該載體能同時(shí)表達(dá)Hsp70和CD80蛋白。(二)體內(nèi)表達(dá)及分布檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:近交系BALB/c小鼠20只(第三軍醫(yī)大學(xué))，6 8周齡，體重18 20g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在獨(dú)立通風(fēng)換氣籠(individually ventilated IVC)中飼養(yǎng)。純化的pVAXI_Hsp70/0)80質(zhì)粒DNA根據(jù)EndoFree質(zhì)粒提取說明書(Qiagen公司，英國(guó))獲得，260/280nm的比例為=1.80。分裝成IOOy g/ΙΟΟμ I存儲(chǔ)于_80°C保存。實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按接種時(shí)間分為5組(每組3只)-J天組、15天組、30天組和180天組；陰性對(duì)照小鼠為生理鹽水組。布比卡因(Bbupivacaine)與質(zhì)粒DNA結(jié)合后形成復(fù)合體保護(hù)并能夠釋放DNA,同時(shí)是一種麻醉劑，可刺激肌細(xì)胞再生，從而提高肌肉組織細(xì)胞吸入DNA和表達(dá)的能力，所以在此實(shí)驗(yàn)中作為佐劑。分別給每組小鼠股四頭肌注射嵌合疫苗100 μ I和7.5g/L步比卡因混懸液25 μ 1，即(4: I)，共125 μ 1，含質(zhì)粒100 μ g。對(duì)照組注射的是注射用水100 μ I。RNA的分離:pVAXl-Hsp70/CD80嵌合疫苗接種小鼠后分別于7、15、30、180天取眼球血以及肌肉、淋巴節(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織，凍存-80°C?？俁NA的提取按照北京天根生物技術(shù)有限公司動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒進(jìn)行，RT-PCR細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄oligodT引物，按大連寶生物公司RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR結(jié)果(參見圖3):接種7天組和接種15天組肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織均有Hsp70和⑶80表達(dá)。接種30天組在肌肉、肺和肝有Hsp70表達(dá)，未見CD80表達(dá)。180天組Hsp70/CD80天未檢測(cè)出表達(dá)。Real-time-PCR(實(shí)時(shí)PCR)結(jié)果(參見圖4):取7天和15天和30天和180天組小鼠脾臟cDNA用Real-time-PCR檢測(cè)IFN-Y (y干擾素)和IL_4(白介素_4).其結(jié)果為七天和15天IFN- Y有高水平表達(dá)。pVAXl-Hsp70/CD80在小鼠體內(nèi)分布檢測(cè)結(jié)果:提取接種pVAXl_Hsp70/CD80的小鼠在7、15、30、180天的肌肉、淋巴節(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織DNA，用Hsp70、CD80引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出Hsp70、⑶80基因。Hsp70 引物:上游(SEQ ID N0.4) AAT CgT gCg TgA CAT CAA AgA ；下游(SEQID N0.5):CCA AgaA Agg AAg get ggA AAA。CD80 引物:上游(SEQ ID N0.6) AgA ATg ATT ATC AAT CAC ；下游(SEQID N0.7):TTA gAT ATg CTg CAg AAg。說明Hsp70、⑶80質(zhì)粒直到180天仍然分布在小鼠體內(nèi)肌肉、淋巴節(jié)、骨髓、脾、肝、
肺、腎、胸腺組織。實(shí)施例三pVAX1-Hsp70/⑶80嵌合DNA疫苗對(duì)哮喘免疫保護(hù)作用及機(jī)制研究(一)試驗(yàn)方法。1、實(shí)驗(yàn)材料:兔抗小鼠PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)單克隆抗體(mAb，北京博奧森公司)。去內(nèi)毒素級(jí)質(zhì)粒純化系統(tǒng)(Qiagen 公司)。IFN- y , IL-4、IL-5，IL-9，IL-10，IL-13，IL-17，IL-23，TGF- β，OVA-sIgE ELISA檢測(cè)試劑盒(ADL公司)，⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec公司)。SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠。雞卵清蛋白(OVA, Sigma產(chǎn)品)。402A霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)。DNA質(zhì)粒的制備:用去內(nèi)毒素級(jí)質(zhì)粒純化系統(tǒng)制備pVAX1-Hsp70/⑶80和PcDNA3.「HspTO/CDSO 質(zhì)粒。⑶4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞制備:乙醚麻醉小鼠后，(5-1agen公司)制備超螺旋質(zhì)粒DNA,以1000 μ g/ml濃度溶于生理鹽水，分裝后儲(chǔ)_70°C，。雌性BALB/c小鼠分別于兩側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉共注射7.5g/L布比卡因混和100μ g(0.1ml)質(zhì)粒pVAXl，pVAXl/HSP70/CD80125 μ I混懸物(4: I)三次，隔周一次。6周后處死小鼠，用⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec公司)從脾臟組織中分離⑶4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。2、實(shí)驗(yàn)分組造模及處理:
動(dòng)物分組:雌性BALB/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組，空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)、哮喘實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M(簡(jiǎn)稱哮喘組)、pcDNA3.1-Hsp70/CD80嵌合DNA載體組(簡(jiǎn)稱載體組)和pVAXl-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗組(簡(jiǎn)稱疫苗組)，每組10-20只。(1)預(yù)防性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn):免疫:乙醚麻醉小鼠后，分別于致敏前第42天，第28和第14天在載體組、疫苗組小鼠兩側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉共三次，每次)注射7.5g/L布比卡因混和100 μ g (0.1ml)pcDNA3.1-Hsp70/CD80，為小鼠股四頭肌注射嵌合疫苗和7.5g/L疫苗100 μ I，步比卡因25 μ 1 (4: 1)，共125 μ 1，含質(zhì)粒100 μ g。pVAXl-Hsp70/CD80和步比卡因混懸物(4:1)共125 μ 1 ;對(duì)照組和哮喘組注射生理鹽水和7.5g/L布比卡因混懸物(4:1)(是pVAXl-Hsp70/CD80 (4)和步比卡因混懸物(1)比。共125μ1。免疫:乙醚麻醉小鼠后，分別于致敏前第42天，第28和第14天分別在載體組、疫苗組小鼠兩側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉各注射7.5g/L布比卡因混和100μ g(0.lml)pcDNA3.l_Hsp70/CD80的混懸物(4: 1) 125μ 1,7.5g/L布比卡因混和pVAXl_Hsp70/CD80的混懸物(4: 1) 125μ 1 ;對(duì)照組和哮喘組分別注射生理鹽水和7.5g/L布比卡因的混懸物(4: 1)125 μ 1。致敏(開始致敏時(shí)為O天):小鼠于第O天，14天用新鮮配制的OVA和鋁佐劑混懸物腹腔注射致敏。腹腔注射含雞卵清蛋白(OVA) 100 μ g，氫氧化鋁(Al (OH) 3) Img混合的生理鹽水混懸液200 μ 1。對(duì)照組用生理鹽水200 μ I腹腔注射。激發(fā)(開始激發(fā)為28天):第28天開始以500 μ g/ml OVA液霧化吸入激發(fā)，隔天I次，每次30分鐘，共吸入7次。對(duì)照組則以生理鹽水代替OVA液霧化吸入。(2)預(yù)防性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)免疫方法同上。致敏(開始致敏為O天):方法同上。激發(fā)(開始激發(fā)為28天):第28天開始以500 μ g/ml OVA液霧化吸入激發(fā)。于第28-32天，每天一次，每次30分鐘。于35-70天，每周3次，連續(xù)6周。對(duì)照組則以生理鹽水代替OVA液霧化吸入。(3)治療性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)致敏(開始致敏為O天)方法同上。激發(fā)(開始激發(fā)為28天):第28天開始以500 μ g/ml OVA液霧化吸入激發(fā)，隔天I次，每次30分鐘，共吸入7次。對(duì)照組則以生理鹽水代替OVA液霧化吸入。治療(開始治療為第27天):第27天、第34天在載體組、疫苗組小鼠兩側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射 7.5g/L 布比卡因(25 μ 1)和 100μ g(100μ l)pcDNA3.l_Hsp70/CD80 共125 μ 1 的混懸物、7.5g/L(25 μ 1布比卡因和 100 μ g(100 μ l)pVAXl/Hsp70/CD80 的混懸物125 μ 1 ;對(duì)照組和哮喘組分別注射生理鹽水(100 μ I)和7.5g/L(25y 1)布比卡因的混懸物共 125 μ 1。(4)治療性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)致敏(開始致敏為O天):方法同上。激發(fā)(開始激發(fā)為28天):第28開始以500 μ g/ml OVA液霧化吸入激發(fā)。于第28-32天，每天一次，每次30分鐘。于35-77天，每周3次，連續(xù)6周。對(duì)照組則以生理鹽水代替OVA液霧化吸入。治療(開始治療為第56天):第56天，第63天和第70天，方法同上。3、指標(biāo)檢測(cè)方法(I)吸入乙酰甲膽堿(methacholine)后氣道反應(yīng):末次激發(fā)后24h后，通過全身體積描記儀檢測(cè)吸入乙酰甲膽堿后小鼠氣道反應(yīng)性，乙酰甲膽堿依次由低濃度開始激發(fā)，觀察小鼠反應(yīng)，BUXCO無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀記錄小鼠氣道反應(yīng)性監(jiān)測(cè)指標(biāo)Penh (enhancedpause)。在吸入乙酰甲膽堿檢測(cè)氣道反應(yīng)后處死動(dòng)物進(jìn)行有關(guān)研究。(2)血清中OVA特異性IgE的測(cè)定:各組在戊巴比妥鈉麻醉下小鼠眼球取血，離心取血清，轉(zhuǎn)移到EP管中，保存于-80°C。采取血清標(biāo)本后I個(gè)月內(nèi)用ELISA法按操作說明測(cè)定。

(3)支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集:各組小鼠末次致敏24h后用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉，在環(huán)狀軟骨上用止血鉗固定，其下方作橫切口，置入連接注射器的硅膠管，注入37°C生理鹽水400 μ 1，反復(fù)抽吸3次，回收BALF置于冰上，并記錄回收量。BALF離心，取上清轉(zhuǎn)移到EP管中，保存于_80°C。(4) IFN- Y、PGE2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10，IL-13，IL-17，IL-23 濃度測(cè)定:將 BALF以1200rpm/min，離心lOmin，取上清液貯存于_80°C冰箱，在I個(gè)月內(nèi)用ELISA法按操作說明測(cè)定各細(xì)胞因子的濃度。(5)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中WBC的計(jì)數(shù)與分類:用PBS重懸BALF中沉淀細(xì)胞作總細(xì)胞計(jì)數(shù)。另取細(xì)胞懸液涂于載玻片上，經(jīng)姬母莎染液染色后對(duì)BALF中的WBC進(jìn)行分類、計(jì)數(shù)。取重懸液50 μ 1，按1: 5比例加嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)稀釋液，用計(jì)數(shù)板直接計(jì)EOS 數(shù)。(6)組織學(xué)檢查:處死小鼠后將肺組織置于4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)制備病理切片，HE染色后，觀察切片氣道重塑形態(tài)學(xué)改變情況。用過碘雪夫酸(PAS)染色檢測(cè)杯狀細(xì)胞分泌黏液情況。Masson三色染色觀察上皮下膠原沉積情況。采用免疫組化，檢測(cè)支氣管平滑肌PCNA的表達(dá)。檢測(cè)支氣管平滑肌凋亡情況。(7)脾臟，胸腺和肺組織的處理及檢測(cè)指標(biāo)取血后處死小鼠，打開腹腔和胸腔，分別摘取脾臟組織，胸腺組織和肺組織，將部分組織在低溫下勻漿，離心后取上清。通過ELISA檢測(cè)脾臟、胸腺和肺組織中IL-17，IL-23等表達(dá)水平。部分標(biāo)本置于凍存管中，立即置于液氮中保存。通過Real-time PCR分別檢測(cè)脾臟，胸腺和肺組織中T-bet、GATA-3、R0Ryt、Foxp3、IL-17A、IL-23等基因的表達(dá)水平。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.預(yù)防性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用OVA誘發(fā)建立的哮喘小鼠模型，其氣道炎癥、氣道反應(yīng)性增高，BALF中IFN-Y降低等變化均為急性哮喘的典型改變。本研究在OVA致敏前用HSP70/CD80嵌合DNA疫苗連續(xù)三次免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗能明顯抑制小鼠氣道、肺泡和血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(P < 0.05)(見圖5)，而且表現(xiàn)為氣道阻力降低(P
<0.05)(見圖6)，BALF上清液中IFN1、PGE2明顯升高(P < 0.05)(見圖7)。說明HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗能上調(diào)Thl反應(yīng)，抑制Th2反應(yīng)，促使IFN- Y分泌增多，不僅抑制了哮喘小鼠炎癥反應(yīng)，而且還降低哮喘小鼠的氣道阻力。2.預(yù)防性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)用雞卵清蛋白誘發(fā)建立慢性哮喘小鼠模型，慢性哮喘組小鼠氣道反應(yīng)性明顯增高(P < 0.050);氣道壁增厚，外徑/內(nèi)徑(Po/Pi)等明顯增加(P < 0.050);支氣管上皮中PAS染色陽(yáng)性的杯狀細(xì)胞明顯增多(P < 0.050);小支氣管上皮下呈藍(lán)色的膠原纖維明顯增厚；支氣管上皮下肌層增生明顯，總平滑肌細(xì)胞和PCNA陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞明顯增多(P
<0.050)。這些變化均為哮喘氣道重建的典型改變。在雞卵清蛋白致敏前用HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗連續(xù)三次免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗能明顯減輕慢性哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性(P < 0.050)，降低外徑/內(nèi)徑(Po/Pi)等氣道重建相關(guān)的半定量參數(shù)水平(P < 0.050)，降低氣道黏液分泌(P < 0.050)，阻止氣道上皮下纖維化，減輕氣道平滑肌增生(P < 0.050)，對(duì)慢性哮喘氣道重建表現(xiàn)出了顯著的抑制作用。且BALF上清液中IFN- Y ,IFN- Y /IL-4明顯升高(P < 0.050)(參見圖8);脾臟組織T-bet/GATA-3基因表達(dá)比率升高(參見圖9)，可能說明高表達(dá)T-bet能通過調(diào)節(jié)IFN-Y的生成上調(diào)Thl反應(yīng)，低表達(dá)GATA-3則抑制IL-4的生成抑制Th2反應(yīng)。

3.治療性免疫+短期模型實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用OVA誘發(fā)建立的哮喘小鼠模型，其外周血中IgE水平明顯增高，氣道炎癥、氣道反應(yīng)性增高，BALF中IFN-Y降低等變化均為急性哮喘的典型改變。OVA致敏后用HSP70/CD80嵌合DNA疫苗連續(xù)二次干預(yù)小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗能明顯抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(參見圖10)，且氣道阻力降低。脾臟組織CCR5/CCR3基因表達(dá)比率升高(參見圖11)，可能說明肥 70/^80嵌合DNA疫苗能上調(diào)Thl反應(yīng)，抑制Th2反應(yīng)，不僅抑制了哮喘小鼠炎癥反應(yīng)，而且還降低哮喘小鼠的氣道阻力。4.治療性免疫+長(zhǎng)期模型實(shí)驗(yàn)慢性哮喘小鼠模型，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多(P < 0.05);外周眼球血血清中IgE水平明顯增高(P < 0.05);氣道壁外徑/內(nèi)徑(Po/Pi)增加，(P < 0.05);支氣管上皮中AB-PAS染色陽(yáng)性的杯狀細(xì)胞數(shù)目增多明顯(P<0.05);小支氣管上皮下藍(lán)色的膠原纖維增厚明顯；支氣管上皮下肌層增生明顯，總平滑肌細(xì)胞和PCNA陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P < 0.05)。在雞卵清蛋白致敏小鼠后用HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗連續(xù)二次干預(yù)小鼠后，發(fā)現(xiàn)HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗能明顯減輕小氣道炎癥作用(P < 0.05)，降低慢性哮喘小鼠血清中IgE的水平(表2)，降低氣道外徑/內(nèi)徑(Po/Pi)的比值(P < 0.05)，減少杯狀細(xì)胞的增生(P < 0.05)，減輕氣道平滑肌增生(P < 0.05)，對(duì)慢性哮喘氣道重塑表現(xiàn)出了明顯的抑制作用(圖12)。且HSP70/CD80嵌合DNA疫苗使BALF上清液中IL-5明顯升高(P < 0.050)(表I) ；T-bet/GATA-3比率升高(圖13)。本實(shí)驗(yàn)從特異性調(diào)控ThO細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3入手，上調(diào)T-bet/GATA-3，進(jìn)而去掉Th2的優(yōu)勢(shì)地位，增加Thl的生成。表I各組小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-5含量的比較(pg/ml，)
權(quán)利要求
1.嵌合型DNA疫苗，其特征在于:為含有如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的編碼基因的PVAXI質(zhì)粒: (a)SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)； (b)在SEQID N0.2限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與(a)所述的蛋白質(zhì)具有相同或相似功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所述。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于:所述的編碼基因由pVAXI質(zhì)粒上的CMV啟動(dòng)子控制其表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于:所述pVAXI質(zhì)粒的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
5.權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的嵌合型DNA疫苗在制備預(yù)防或免疫治療哮喘的藥物中的用途。
6.由權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的嵌合型DNA疫苗為主要活性成分制備成的預(yù)防或免疫治療哮喘的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于哮喘預(yù)防和免疫治療的嵌合型DNA疫苗。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有的pcDNA3.1-HSP70/CD80嵌合疫苗藥效還不夠理想以及安全性不好。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種新的嵌合型DNA疫苗。該嵌合型DNA疫苗為含有HSP70/CD80嵌合蛋白的編碼基因并能在體內(nèi)將其表達(dá)的的pVAXI質(zhì)粒。使用pVAXI載體替換現(xiàn)有技術(shù)的pcDNA3.1(+)載體后，在哮踹的預(yù)防和治療上具有更好的效果。尤其是能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的Th1型反應(yīng)，也使實(shí)驗(yàn)對(duì)象的IFN-γ明顯增高。另外該載體具有的是卡納霉素的抗性，不會(huì)導(dǎo)致任何過敏反應(yīng)，能更好哮喘預(yù)防和免疫治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103157113SQ20111040657
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者鐘森, 史小玲, 鐘林 申請(qǐng)人:鐘森, 史小玲