專(zhuān)利名稱(chēng)：基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明主要涉及一種基于癌癥早期檢測(cè)、診斷和治療一體的復(fù)合新材料-金納米籠/納米氧化鐵，屬于納米科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:生物活性物質(zhì)如抗體蛋白等，由于自身可檢測(cè)的信號(hào)比較弱，難以定量分析或檢測(cè)。癌癥是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，每年全球癌癥新發(fā)病例1000多萬(wàn)，死亡700多萬(wàn)，男性530萬(wàn)，女性470萬(wàn)。占總死亡人數(shù)的12%。預(yù)期到2020年，全球每年新發(fā)病例將達(dá)1500萬(wàn)。腫瘤病人總數(shù)，在發(fā)展中國(guó)家將增長(zhǎng)73%，而發(fā)達(dá)國(guó)家增長(zhǎng)29%。癌癥是我國(guó)居民死亡的主要原因之一。到2008年年底，我國(guó)癌癥每年新發(fā)病例為220萬(wàn)，因癌癥 死亡人數(shù)為160萬(wàn)，在近30年間居民惡性腫瘤的發(fā)病率男性增長(zhǎng)了 37%，女性上升了 44.76%，且處于最佳勞動(dòng)狀態(tài)的20至60歲者占到40%。預(yù)計(jì)2015年全世界將有900萬(wàn)人死于癌癥，2030年將有1200萬(wàn)人死于癌癥。在所有癌癥的死亡病例中，有70%發(fā)生在中等收入和低收入國(guó)家。因此癌癥的控制是世界各國(guó)政府的衛(wèi)生戰(zhàn)略重點(diǎn)，癌癥的治療成為世界所關(guān)注的研究課題。惡性腫瘤(癌癥)的早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療是治療腫瘤的關(guān)鍵。目前的常規(guī)診斷方法靈敏度和特異性比較低，在腫瘤發(fā)生早期很難檢測(cè)，還有靶向輸送效果差、強(qiáng)烈的毒副作用以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性等，難以達(dá)到預(yù)期的治療效果。因此，發(fā)展靈敏度高、特異性強(qiáng)的早期診斷方法以及開(kāi)發(fā)具有高的腫瘤靶向性、安全、有效、經(jīng)濟(jì)的抗腫瘤藥物體系已經(jīng)成為目前癌癥研究的熱點(diǎn)，對(duì)癌癥的早期診斷和治療有著重要的意義?，F(xiàn)階段Au Nanocages納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要集中在暗場(chǎng)成像領(lǐng)域，即以Au Nanocages為光散射探針，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行甄別。而靈敏度是進(jìn)行腫瘤診斷的一個(gè)重要方面，癌癥越早被發(fā)現(xiàn)和診斷，則越容易治愈，病人康復(fù)率就越高。因此，高的靈敏度在腫瘤成像探針研究中是一個(gè)很重要的參數(shù)。如何同時(shí)實(shí)現(xiàn)癌癥的高靈敏度診斷、給藥、治療，是納米技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的一個(gè)主要問(wèn)題。Au Nanocages具有優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，可作為暗場(chǎng)成像探針和熒光探針。磁性納米顆粒是一類(lèi)智能型的材料，具有磁響應(yīng)性、超順磁性和優(yōu)異的生物相容性，以生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?yàn)槔言诤舜殴舱癯上?MRI)、磁靶向藥物、在腫瘤磁靶向化療和熱療方面得到廣泛關(guān)注。磁性納米顆粒的內(nèi)在化可作為藥物進(jìn)入細(xì)胞的載體。如果將兩者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)納米材料的多功能化。預(yù)期達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行磁共振成像、熒光成像、暗場(chǎng)成像、特異性靶向多功能的診斷，通過(guò)磁、光成像可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而提高癌細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性和治療的先進(jìn)性。人們?cè)?jīng)認(rèn)為癌癥是不治之癥，但是如今大多數(shù)被診斷為早期癌癥的病人都能夠和癌癥長(zhǎng)期共存。這大部分歸功于癌癥診斷和治療在近幾十年中的發(fā)展進(jìn)步。尤其是納米科學(xué)技術(shù)的發(fā)展為腫瘤的早期診斷，預(yù)防和治療提供了新的希望
發(fā)明內(nèi)容
:
發(fā)明目的:本發(fā)明提出了一種基于癌癥早期檢測(cè)、診治一體的復(fù)合納米新材料，其目的是:制備出一種基于癌癥早期診斷的可同時(shí)實(shí)現(xiàn)癌癥的高靈敏度、高準(zhǔn)確率診斷、靶向給藥、光熱治療的新試劑。技術(shù)方案:一種基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料，其特征在于:所述的復(fù)合納米新材料為金納米籠/納米氧化鐵，納米氧化鐵填充在中空金納米籠內(nèi)，外層用生物分子封裝，生物分子表面修飾有生物靶向分子；所述的金納米顆粒為中空金納米籠或中空金納米立方盒；所述的納米氧化鐵為納米四氧化三鐵、三氧化二鐵或二者混合物。納米氧化鐵粒徑4-1000nm,金納米籠粒徑10_2000nm。生物分子包括:二氧化硅、2，3-二巰基丁二酸(DMSA)、PEDOT/PSS [poly (3，4-ethylenedioxythiophene)poly (styrenesulfonate)]> PDADMAC (poly dialIyIdimethy lammonium chioride)、聚乙二醇(PEG)、己二酸、聚乙二醇單甲醚(mPEG)、聚乙烯醇、葡聚糖、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原。生物靶向分子包括:殼聚糖、葉酸、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原。一種如上所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料的制備方法，其特征在于:具體步驟如下:(I)、以銀納米立方體為模板，加入AuCV和AuCly制備出中空金納米立方盒狀顆粒(nanoboxes)和中空多孔金納米籠狀顆粒(nanocages),將中空金納米立方盒狀顆粒用H2O2腐蝕，得到消角的中空金納米立方盒狀顆粒；(2)、在步驟(I)得到的中空金納米立方盒狀顆粒和中空多孔金納米籠狀顆粒溶液中加入0.02molFeCl2.6H20溶于200mL去離子水和FeCl3.4H20, Fe3+與Fe2+的摩爾比是
1.75，快速攪拌反應(yīng)前驅(qū)物溶液，超聲振蕩，確保Fe2+和Fe3+溶液能進(jìn)入中空的金納米籠或中空金納米立方盒粒子空腔內(nèi)，然后再快速加入30ml氨水或氫氧化鈉，納米氧化鐵在金納米立方盒或多孔金納米籠內(nèi)部成核，生長(zhǎng)；(3)、在步驟(2)反應(yīng)液中加入分散劑葡聚糖、殼聚糖、淀粉、明膠、聚乙二醇、油酸、白蛋白或乳膠表面活性劑，調(diào)控納米氧化鐵的粒徑，使得納米氧化鐵的粒徑大于金納米籠或金納米立方盒孔徑，得到在金納米籠或金納米立方盒內(nèi)生長(zhǎng)的納米氧化鐵就被裝載在金納米籠的空心籠芯或金納米立方盒內(nèi)，將金納米籠外面的納米氧化鐵經(jīng)多次洗滌后去掉，干燥后得到復(fù)合納米顆粒；(4)、將步驟(3)得到的復(fù)合納米顆粒用生物分子封裝，得到金納米籠/納米氧化鐵顆粒；(5)、將步驟(4)得到的金納米籠/納米氧化鐵顆粒與生物靶向分子反應(yīng)，得到用于基于癌癥早期檢測(cè)、診治一體的復(fù)合納米新材料。納米氧化鐵被包覆在中空金納米籠內(nèi)部。生物探針?lè)肿颖话苍谥锌战鸺{米籠或中空金納米立方盒內(nèi)部；生物探針?lè)肿訛闊晒馊玖螩y5或卟啉。

優(yōu)點(diǎn)及效果:
本發(fā)明提出了一種基于癌癥早期檢測(cè)、診治一體的復(fù)合納米新材料，具有如下優(yōu)
占-
^ \\\.
I)中空多孔金納米籠狀顆粒(Au Nanocages)的LSPR光譜可以從可見(jiàn)光區(qū)連續(xù)地調(diào)控到近紅外光區(qū)，并且該紅移現(xiàn)象表現(xiàn)的尤其明顯，但同時(shí)金納米籠的形狀和大小基本保持不變，這是其他結(jié)構(gòu)金納米顆粒(金納米棒和金納米殼結(jié)構(gòu))不具備的，Au Nanocages的LSPR光譜調(diào)控是通過(guò)控制內(nèi)部空腔大小，表面壁厚以及表面孔徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，可以進(jìn)行精確調(diào)控，因此性能更加穩(wěn)定；2)金納米籠/納米氧化鐵的熱穩(wěn)定性、靶向性高于金納米籠；3)金納米籠/納米氧化鐵可實(shí)現(xiàn)早期腫瘤磁光的聯(lián)合診斷，可實(shí)現(xiàn)的早期腫瘤高靈敏度的檢測(cè)；4)金納米籠/納米氧化鐵可實(shí)現(xiàn)早期腫瘤診斷的多元化，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)磁共振成像、熒光成像、暗場(chǎng)成像，提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。本發(fā)明主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于:(I)相對(duì)于普通的腫瘤光-磁診斷試劑相比,Au Nanocages/Fe304復(fù)合納米新材料更具有磁光聯(lián)和性能，其靈敏度和準(zhǔn)確率更高；(2)和普通的材料合成方法不同，本發(fā)明提出一種創(chuàng)新性的材料設(shè)計(jì)方法-材料的組裝是由外到內(nèi)的組裝方法，可以避免表面復(fù)雜的修飾對(duì)材料性能的影響，材料的合成易于控制，使得復(fù)合納米新材料的性能穩(wěn)定；(3)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的高靈敏度多元化聯(lián)合診斷、光熱治療以及靶向藥物的，為腫瘤的早期診斷，早期治療提供依據(jù)。


:圖1 為 Au Nanocages/Fe304 制備不意圖；圖2暗場(chǎng)的熒光成像照片；圖3 \加權(quán)成像圖；圖4為每個(gè)細(xì)胞吞噬鐵離子質(zhì)量的對(duì)比圖；圖5是未受到近紅外激光照射的熒光顯微鏡照片；圖6受到近紅外激光照射后熒光顯微鏡照片。
具體實(shí)施方式
:一種基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料，其特征在于:所述的復(fù)合納米新材料為金納米籠/納米氧化鐵，納米氧化鐵填充在中空金納米籠內(nèi)，外層用生物分子封裝，生物分子表面修飾有生物靶向分子；所述的金納米顆粒為中空金納米籠或中空金納米立方盒；所述的納米氧化鐵為納米四氧化三鐵、三氧化二鐵或二者混合物。納米氧化鐵粒徑4-1000nm,金納米籠粒徑10_2000nm。生物分子包括:二氧化硅、2，3-二巰基丁二酸(DMSA)、PEDOT/PSS [poly (3，4-ethylenedioxythiophene)poly(styrenesulfonate)]> PDADMAC (poly dialIyIdimethy lammonium chioride)、聚乙二醇(PEG)、己二酸、聚乙二醇單甲醚(mPEG)、聚乙烯醇、葡聚糖、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原。
生物靶向分子包括:殼聚糖、葉酸、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原。一種如上所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料的制備方法，其特征在于:具體步驟如下:(I)、以銀納米立方體為模板，加入AuCV和AuCly制備出中空金納米立方盒狀顆粒(nanoboxes)和中空多孔金納米籠狀顆粒(nanocages),將中空金納米立方盒狀顆粒用H2O2腐蝕，得到消角的中空金納米立方盒狀顆粒，如圖1中所不；(2)、在步驟(I)得到的中空金納米立方盒狀顆粒和中空多孔金納米籠狀顆粒溶液中加入0.02molFeCl2.6H20溶于200mL去離子水和FeCl3.4H20, Fe3+與Fe2+的摩爾比是1.75，快速攪拌反應(yīng)前驅(qū)物溶液，超聲振蕩，確保Fe2+和Fe3+溶液能進(jìn)入中空的金納米籠或金納米立方盒粒子空腔內(nèi)，然后再快速加入30ml氨水或氫氧化鈉，納米氧化鐵在金納米立方盒或多孔金納米籠內(nèi)部成核，生長(zhǎng)；(3)、在步驟(2)反應(yīng)液中加入分散劑葡聚糖、殼聚糖、淀粉、明膠、聚乙二醇、油酸、白蛋白或乳膠表面活性劑，調(diào)控納米氧化鐵的粒徑，使得納米氧化鐵的粒徑大于金納米籠或金納米立方盒孔徑，得到在金納米籠或金納米立方盒內(nèi)生長(zhǎng)的納米氧化鐵就被裝載在金納米籠的空心籠芯或金納米立方盒內(nèi)，將金納米籠外面的納米氧化鐵經(jīng)多次洗滌后去掉，干燥后得到復(fù)合納米顆粒；(4)、將步驟(3)得到的復(fù)合納米顆粒用生物分子封裝，得到金納米籠/納米氧化鐵顆粒，如圖1中所示；(5)、將步驟(4)得到的金納米籠/納米氧化鐵顆粒與生物靶向分子反應(yīng)，得到用于基于癌癥早期檢測(cè)、診治一體的復(fù)合納米新材料。納米氧化鐵被包覆在中空金納米籠內(nèi)部。生物探針?lè)肿颖话苍诮鸺{米籠或金納米立方盒內(nèi)部；生物探針?lè)肿訛闊晒馊玖螩y5或卟啉。與以往的金納米粒子進(jìn)行腫瘤的診斷和光熱治療的研究不同，本發(fā)明是利用金納米籠(金納米立方盒)與納米氧化鐵納米進(jìn)行組裝，合成金納米籠(盒)/納米氧化鐵復(fù)合粒子，并且采用由外到內(nèi)的組裝方法，首先制備金納米籠(盒)，其次氧化鐵在金納米籠(盒)內(nèi)成核長(zhǎng)大，通過(guò)表面活性劑(如葡聚糖等)得到單分散的納米氧化鐵，用生物分子封裝，得到金納米籠(盒)/納米氧化鐵復(fù)合粒子，最后用生物靶向分子進(jìn)行表面修飾，用于腫瘤的磁共振成像、熒光成像、暗場(chǎng)成像、特異性靶向多功能的診斷，光熱治療和作為靶向藥物載體。制備過(guò)程如圖1所示，具體步驟如下:1)金納米籠(盒)狀顆粒制備以銀納米立方體(nanocubes)為模板，分別采用AuC12_或者AuC14_為反應(yīng)前驅(qū)物，通過(guò)簡(jiǎn)單的置換反應(yīng)(I和II式)可分別制備出中空金納米立方盒狀顆粒(nanoboxes)和中空多孔金納米籠狀顆粒(nanocages)。3Ag(s)+AuCl4^(aq) — Au(s)+3AgCl(s)+Cr(aq), IAg(s)+AuCl2^(aq) ^ Au(s)+AgCl(s)+Cr(aq).1I2)不同壁厚的Au Nanocages的制備
利用I)中制備的金納米籠(盒)狀顆粒，采用腐蝕劑H2O2 (或者過(guò)硫酸鹽、CN-和O2)制備不同壁厚的Au Nanocages的實(shí)驗(yàn)分為兩步；第一電流置換反應(yīng)制備出LSPR譜峰在不同位置的金銀合金納米立方盒(Au-AgAlloy Nanoboxe),采用的是用過(guò)量的H2O2氧化溶解Au-AgAlloy Nanoboxes中的銀原子。而在制Alloy Nanoboxes的反應(yīng)過(guò)程中，一個(gè)三價(jià)的金離子置換三個(gè)零價(jià)的銀，銀原子在內(nèi)部被氧化成了而還原得到金原子則大多沉積在AgNanocubes的表面，從而形成了內(nèi)部為空腔的的納米立方盒結(jié)構(gòu)。反應(yīng)初始階段加入少量的HAuNanocubes的表面會(huì)形成一個(gè)小坑,銀原子正是從這個(gè)小坑中不斷地解出來(lái),隨著加入的HAuCl4量的增多,Ag Nanocubes的坑逐漸演變成內(nèi)部的空腔,最后形成Au Nanocages2Ag+H202 — 2Ag++20H_H2O2會(huì)和Au-AgAlloy Nanoboxes中的銀原子反應(yīng),依據(jù)的反應(yīng)是:殘留在Au-AgAlloy Nanoboxes中的銀原子包括合金層中的銀原子會(huì)被過(guò)量的H2O2溶解,而不會(huì)引入其他新的元素，因此反應(yīng)得到的Au Nanocages的壁厚和表面孔徑都可以得到很好的控制。3)金納米籠狀顆粒與磁性納米材料的組裝Au Nanocages與磁性納米材料的組裝,我們提出一種創(chuàng)新性的材料設(shè)計(jì)方法-材料組裝的順序是由外到內(nèi)的材料組裝方 法。首先利用步驟2),在精確調(diào)控Au Nanocages粒徑(大于40nm)和孔徑(大于4nm)的基礎(chǔ)上，然后在溶液中加入FeCl2 MH2C^PFeCl3.6Η20，快速攪拌反應(yīng)前驅(qū)物溶液，超聲振蕩，確保Fe2+和Fe3+溶液能進(jìn)入中空的Au Nanocages粒子空腔內(nèi)，快速加入氨水(或氫氧化鈉)，F(xiàn)e3O4成核，生長(zhǎng)，在反應(yīng)機(jī)理如下:Fe2++2Fe3++80!T — Fe304+4H20(I)FeCl2+2FeCl3+8NaOH — Fe304+8NaCl+4H20(2)組裝過(guò)程中，在上述反應(yīng)液中加入分散劑葡聚糖(或殼聚糖、淀粉、明膠、聚乙二醇、油酸、白蛋白、乳膠等)，使納米Fe3O4在Au Nanocages溶液中(金納米籠內(nèi)和籠外)成核、分散、生長(zhǎng)，精確調(diào)控Fe3O4的粒徑，最后得到粒徑為10 IOOOnm Fe3O4,因?yàn)榧{米Fe3O4的粒徑小于金納米籠的孔徑)，這樣在金納米籠內(nèi)生長(zhǎng)的Fe3O4就被裝載在Au Nanocages的空心籠芯內(nèi)，將Au Nanocages外面的Fe3O4經(jīng)多次洗漆后去掉,得到Au Nanocages/Fe304組裝體。4)在步驟3)制備Au Nanocages/Fe304組裝體基礎(chǔ)上,利用生物分子封裝,生物分子包括氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原、二氧化硅、熒光染料、近紅外染料Cy5,制備出Au Nanocages/Fe304復(fù)合納米粒子。實(shí)施例1以Au Nanocages/Fe304為例制備生物探針(I)參照文獻(xiàn)[Chinese Sci Bull, 2010, 55]制備納米 Fe3O4 顆粒，參照文獻(xiàn)[AdvMater, 2008, 20]制備金納米籠或金納米立方盒。(2)取(I)Au Nanocages 顆粒 2g IOmmol,加入 0.02mol FeCl3.6H20 溶于 200mL去離子水配成0.lmol/L的溶液中，F(xiàn)e3+與Fe2+的摩爾比是1.75，反應(yīng)起始60°C時(shí)，先加入氨水30mL，升溫到80°C時(shí)再加入表面活性劑0.5mL,陳化時(shí)間是40 130min ;攪拌速度接近300r/min,得到復(fù)合納米粒子。(3)室溫下，將20%濃度的TODAC水溶液1.5mL加入5mL去離子水中快速攪拌，隨后緩慢加入(2)中制備的7nM的納米Au Nanocages/Fe304溶液5mL，繼續(xù)攪拌兩小時(shí)后，15000rpm離心30分鐘，去除上層多余的I3DDAC溶液，即得到生物分子I3DDAC封裝的Au
Nanocages/Fe304 溶液。4)將 3) 50nM 包覆了 I3DDAC 的 Au Nanocages/Fe304 溶液與 0.2mM 的生物素或牛血清蛋白-生物素一比一混合，加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為酸堿中性，震蕩三分鐘后靜置半個(gè)小時(shí)。最后將反應(yīng)液以80的rmp的速度離心10分鐘以去除剩余的生物分子。5)抗體與F1DDAC封裝的Au Nanocages/Fe304溶液的連接同牛血清蛋白。6)取ImL的PSS溶液加入到IOmL去離子水溶液中快速攪拌，隨后緩慢加入50nM在步驟3)中溶液lmL，攪拌2小時(shí)后，IOOOOrpm離心兩次，以去除溶液中多余的PSS，得到包覆PSS的復(fù)合納米顆粒。包覆了一層PSS后，復(fù)合納米顆粒的表面電性變?yōu)樨?fù)電。實(shí)施例2合成2，3- 二巰基丁二酸(DMSA)修飾的納米復(fù)合材料(I)參考文獻(xiàn)[J Colloid Interface Sc1.1997,194:427-433]方法，將 ImLDMSA溶液(3mM)加入到1.5mL的納米復(fù)合材料膠體溶液中(7.0 X 1012particles/mL)，輕微攪拌2小時(shí)，得DMSA修飾的 復(fù)合納米材料。(2)將⑴使用Mill1-Q水離心洗滌除去未反應(yīng)的DMSA(3000rpm)。再將納米材料重新分散于3mL水溶液中備用。實(shí)施例3DNA修飾的復(fù)合納米顆粒(I)將巰基 DNA (5' -SH-CCC CCC CCC CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTT T-3')根據(jù)文獻(xiàn)[Nat.protoc.2006，1,324]進(jìn)行活化。(2)將在實(shí)施例1中制備的復(fù)合納米顆粒經(jīng)HOOOrpm離心lOmin，然后與活化后的DNA在25°C下孵育24h，復(fù)合納米顆粒的終濃度為2nM，DNA的終濃度是1.32X 1(Γ6Μ。(3)將⑵中過(guò)量的DNA通過(guò)HOOOrpm離心IOmin除去，下層復(fù)合納米顆粒重懸在等量的超純水中，得到DNA修飾的復(fù)合納米顆粒。實(shí)施例4組氨酸對(duì)復(fù)合納米顆粒的修飾(I)利用實(shí)施例1中制得的復(fù)合納米粒子10μ g以8000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，最后分散在高純水中，最終制得的復(fù)合納米粒子溶膠的濃度為290 μ Μ,將pH值用NaOH調(diào)到
9.6。(2)將(I)中加入100 μ M的組氨酸溶液，反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，得到的組氨酸修飾的復(fù)合納米粒子溶膠的濃度為0.25mM。實(shí)施例5合成mPEG修飾的復(fù)合納米顆粒(I)參考文獻(xiàn)[Nucleic Acids Res.2007.35:3668]合成 LA-NHS，在干燥的三頸燒瓶中加入2.06g(0.0lmol) LA和1.28g(0.011mol)NHS，再加入20mL無(wú)水四氫吠喃(簡(jiǎn)稱(chēng)THF)，攪拌溶解，冷卻至O °C。(2)將 2.06g(0.0lmol) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶于 IOmL 無(wú)水 THF，0°C下，向
(I)反應(yīng)瓶中緩慢滴加含有DCC的四氫峽喃溶液后，攪拌2小時(shí)，升溫至20°C 25°C，反應(yīng)4 6h后，過(guò)濾，蒸餾，用乙酸乙酷重結(jié)晶得產(chǎn)物黃色硫辛-N-琥珀酰亞胺基酯(LA-NHS)針狀晶體，真空干燥。(3) LA-mPE 的合成參考文獻(xiàn)[Bioconjug Chem.2006，17:603]，取mPEGlIOO-NH2(0.275g,0.25mmol)和步驟(2)LA-NHS(143mg，0.5mmol)置于二頸燒瓶中，溶于IOmL的無(wú)水二氯甲烷中，攪拌，逐滴加入無(wú)水三乙胺0.5mL ;常溫反應(yīng)12小時(shí)，用預(yù)冷的冰乙醚重沉淀，真空干燥，得LA-mPEG粗產(chǎn)品。 (4)將(3) LA-mPEG (0.5mM)水溶液加入到ImL的復(fù)合納米顆粒水溶液中(1.68 X IO11個(gè)/mL)，常溫?cái)嚢?小時(shí)；在3700rpm下洗滌3次，將mPEG@復(fù)合納米顆粒重新分散在ImL水溶液中，儲(chǔ)藏在4°C冰箱中備用。實(shí)施例6復(fù)合納米粒子表面修飾SiO2納米粒子(I)參考文獻(xiàn)[J.Colloid Interface Sci，1986，26，62]制備 SiO2，用 3.0mL 的25%氨水作為催化劑加入到50mL乙醇溶液中，放入45mL的水溶液密封的玻璃瓶中20°C下攪拌I小時(shí)，接著將0.2mL的TEOS加入到反應(yīng)瓶中，550rpm下攪拌12小時(shí)得SiO2納米粒子。(2)將150μ L和300μ L的APTES分別加入至Ij (I)制備的50 ml SiO2膠體溶液中，常溫下攪拌2小時(shí)，在70°C加熱回流I小時(shí)，在2000rpm下，得到APTES@Si02納米粒子，并用150mL無(wú)水乙醇分3次洗漆,最后分散到IOmL無(wú)水乙醇溶液中。(3)取(2)得到的3.0mL APTESiSiO2納米粒子加入到30mL的復(fù)合納米顆粒溶液中，常溫?cái)嚢鐸 2小時(shí)后，2500rpm下，洗滌3次，得到表面修飾SiO2納米粒子的復(fù)合納米粒子。 實(shí)施例7利用金納米籠制備的復(fù)合材料用于光學(xué)成像和磁共振成像(I)將HeLa (人體宮頸癌)和MCF_7(人體乳腺癌)各50mL放入含10%胎牛血清(FCS)、100U/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素及I %谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件是:37°C>5% CO2、飽和濕度，每48小時(shí)傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。(2)分別在HeLa和MCF-7細(xì)胞系中加入不同濃度復(fù)合納米粒子的PBS溶液配成含有0、1、10、30、5(^8/1^樣品的細(xì)胞培養(yǎng)基，在371:孵育3h，然后將孵育過(guò)的兩組細(xì)胞用PBS緩沖液洗三次，再將其懸浮于PBS緩沖液中(I X 106cells/mL)，準(zhǔn)備測(cè)試磁共振成像。(3)將(2)吞噬了復(fù)合納米粒子的細(xì)胞在濃硝酸和高氯酸的混合酸(摩爾比為4: I)中加熱到90°C，蒸干，瓶底出現(xiàn)白色結(jié)晶后，用水溶解，定容，測(cè)試鐵離子的濃度，計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞吞噬鐵離子的質(zhì)量。(4)將不同濃度的復(fù)合納米粒子樣品置分別0.5T和3.0T磁共振成像兩個(gè)中磁場(chǎng)下按下列參數(shù)掃描T1加權(quán)成像。結(jié)果顯示:復(fù)合納米材料具有較高的縱向弛豫率:在3.0T磁場(chǎng)下，Γι為
1.47mM_1s_1 ;在0.5T磁場(chǎng)下,!T1為2.1mlT1S'可以進(jìn)行良好的T1磁共振成像(見(jiàn)圖3 \加權(quán)成像圖)和熒光成像(見(jiàn)圖2暗場(chǎng)的熒光成像照片)，圖4為每個(gè)細(xì)胞吞噬鐵離子質(zhì)量的對(duì)比圖。兩種功能的成像優(yōu)勢(shì)的結(jié)合提高了檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的靈敏度和準(zhǔn)確度。實(shí)施例8
以合成多肽(A54)修飾的納米復(fù)合材料進(jìn)行肝癌的光熱治療(I)使用參考文獻(xiàn)[Journal of Nanoparticle Research.2009,11:1321]方法制備A54合成多肽，向ImL的復(fù)合納米離子水溶液中(1.68 X IO11個(gè)/mL)加入100 μ L的多肽水溶液(100 μ Μ)。合液在常溫下輕微攪拌3小時(shí)，然后使用截留分子量(MWCO) 3000的超濾離心管離心除去未反應(yīng)的多肽Α54，最后將修飾好的GNs分散于ImL去離子水中，儲(chǔ)藏在4 °C冰箱中備用。(2)肝癌細(xì)胞BEL-7404在37°C下含有5%0)2潮濕的環(huán)境中培養(yǎng)，使用RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中覆蓋到80%的面積以后，移去培養(yǎng)基，PBS洗凈殘存的血清后，加入ImL的0.1 %胰酶消化溶液，培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。(3)將⑵接種于覆有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，每孔接種2.5X IO5個(gè)細(xì)胞，在37°C下含有5%濃度CO2潮濕空氣環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)基，加入lmLA54@納米復(fù)合粒子(3.0X 101°個(gè)/mL)的培養(yǎng)基，在37°C下含有5%濃度CO2潮濕空氣環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，用PBS (pH = 7.4)對(duì)蓋玻片沖洗3次后備用。(4)將(3)用近紅外激光器(1.07W、807nm)在距蓋玻片Icm中心處垂直照射7分鐘，取出蓋玻片后，用PBS (pH = 7.4)小心沖洗以后，用95%乙醇來(lái)固化30分鐘，用1%冰醋酸浸泡30秒,備用。(5)將(4)置于 100 μ g/mL濃度的AO溶液中染色15分鐘，用PBS (pH = 4.8)小心沖洗，浸入0.1M氯化鈣 溶液45秒，再用PBS (pH = 7.4)洗滌后，鋪蓋于載玻片上。結(jié)果顯示:圖5是未受到近紅外激光照射的熒光顯微鏡照片，圖6受到近紅外激光照射后熒光顯微鏡照片。細(xì)胞在激光照射后，細(xì)胞上富集大量的納米復(fù)合粒子，使周?chē)沫h(huán)境升溫(> 50°C )，造成大部分的細(xì)胞壞死。納米復(fù)合材料進(jìn)行肝癌的光熱治療。實(shí)施例9阿霉素修飾的納米復(fù)合材料進(jìn)行肝癌的靶向藥物治療(I)參考文獻(xiàn)[Biomacromolecules.2010，11:2094]的方法合成 Cys-PEG-Dox，將PEG2000 (10.0g，IOmmol)和新蒸吡啶(3.955g,50mmol)加入 70mL 的二氯甲烷(DCM)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴下將溶解在IOmL DCM中p_NPC(8.07g,40mmol)逐滴加入，常溫反應(yīng)24小時(shí)，用預(yù)冷的冰乙醚重沉淀，真空干燥后備用。(2)將胱胺鹽酸鹽(0.612g，2.72mmol)和 ΤΕΑ(0.568g，5.61mmol)溶解于 5mL 的DMF中，在常溫氮?dú)獗Ｗo(hù)，將(1)PEG-NPC(2.787g，0.540mmol)的DMF溶液(IOmL)逐滴加入到燒瓶中，反應(yīng)12小時(shí)，使用預(yù)冷的冰乙醚重沉淀兩次后真空干燥得Cys-PEG-NPC粗產(chǎn)品。(3)將(2) Cys-PEG-NPC (0.2g, 0.08mmol)溶解在 IOmL DMSO 中，再加入 50mg 的鹽酸阿霉素(0.08mmol)和57 μ L TEA，氮?dú)獗Ｗo(hù)，常溫反應(yīng)48小時(shí)后，加入30mL水溶液，使用截留分子量1000的透析袋透析3天，冷凍干燥得到Cys-PEG-Dox干粉。(4)將(3)水溶液ImM加入IOmM DTT，生成SH-PEG-Dox，用截留分子量1000的透析袋透析,加入到ImL復(fù)合納米顆粒(1.68X IO11個(gè)/mL)水溶液中，常溫?cái)嚢?小時(shí)，離心分離，將修飾好的DoxO復(fù)合納米材料分散于ImL去離子水中，儲(chǔ)藏在4°C冰箱中備用。(5)阿霉素體外釋放測(cè)定參照文獻(xiàn)[J Mater Chem.2009，19:7879]方法進(jìn)行體外藥物釋放測(cè)定，取二份20mg的Cys-PEG-Dox樣品，加IOOml水，裝入截留分子量1000的透析袋中，分別置于盛有50mL醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.3)和磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)離心管中。然后將其置于恒溫振動(dòng)箱中，37°C,40°C,43°C, IOOrpm轉(zhuǎn)速條件下,定時(shí)取ImL釋放液,并立即補(bǔ)加等量的緩沖溶液。結(jié)果顯示:復(fù)合材料具有很好的藥物溫控釋放性。實(shí)施例10阿霉素修飾的納米復(fù)合材料進(jìn)行肝癌體外的熱療-化療(1)將實(shí)施例3中(4)與碘化丙陡(PI)直接在37°C培養(yǎng)6小時(shí)后。(2)將(1)與DoxOGNs共培養(yǎng)的BEL-7402在43°C培養(yǎng)30分鐘后，再在37°C培養(yǎng)
5.5小時(shí)備用。(3)將(2)使用PBS洗滌3次，洗去未粘附到細(xì)胞上的DoxO復(fù)合納米材料，用4%的多聚甲醛溶液固15分鐘，最后使用封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。(4)將⑵使用PBS洗滌3次，PI染色，封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果顯示:光學(xué)照片可見(jiàn)細(xì)胞明顯出現(xiàn)出芽起泡的現(xiàn)象，少許細(xì)胞由梭形變園。PI染色的熒光照片可見(jiàn)只有少量細(xì)胞顯紅色熒光。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明:相比未經(jīng)熱處理的對(duì)照組，熱療組凋亡 的和死亡細(xì)胞量增加了 16%左右。證明了熱處理可以有效增強(qiáng)阿霉素化療的療效，同時(shí)由于納米核殼復(fù)合材料的簡(jiǎn)便的和可控制的加熱作用(腫瘤部位)，既可以降低對(duì)正常細(xì)胞的傷害，又增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的傷害，是極具潛力的腫瘤治療新方法。
權(quán)利要求
1.一種基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料，其特征在于:所述的復(fù)合納米新材料為金納米籠/納米氧化鐵，納米氧化鐵填充在中空金納米籠內(nèi)，外層用生物分子封裝，生物分子表面修飾有生物靶向分子；所述的金納米顆粒為中空金納米籠或中空金納米立方盒；所述的納米氧化鐵為納米四氧化三鐵、三氧化二鐵或二者混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料，其特征在于:納米氧化鐵粒徑4-1000nm,金納米籠粒徑10-2000nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料，其特征在于:生物分子包括:二氧化硅、2，3- 二巰基丁二酸(DMSA)、PEDOT/PSS [poly (3，4-ethylenedioxythiophene)poly(styrenesulfonate)]> PDADMAC (poly dialIyIdimethylammonium chioride)、聚乙二醇(PEG)、己二酸、聚乙二醇單甲醚(mPEG)、聚乙烯醇、葡聚糖、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料，其特征在于:生物靶向分子包括:殼聚糖、葉酸、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-親和素、抗體-抗原。
5.一種如權(quán)利要求1所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)、以銀納米立方體為模板,加入AuCV和AuCV，制備出中空金納米立方盒狀顆粒(nanoboxes)和中空多孔金納米籠狀顆粒(nanocages),將中空金納米立方盒狀顆粒用H2O2腐蝕，得到消角的中空金納米立方盒狀顆粒； (2)、在步驟(I)得到的中空金納米立方盒狀顆粒和中空多孔金納米籠狀顆粒溶液中加入 0.02molFeCl2.6Η20 溶于 200mL 去離子水和 FeCl3.4Η20，F(xiàn)e3+ 與 Fe2+ 的摩爾比是 1.75，快速攪拌反應(yīng)前驅(qū)物溶液，超聲振蕩，確保Fe2+和Fe3+溶液能進(jìn)入中空的金納米籠或金納米立方盒粒子空腔內(nèi)，然后再快速加入30ml氨水或氫氧化鈉，納米氧化鐵在金納米立方盒或多孔金納米籠內(nèi)部成核,生長(zhǎng)； (3)、在步驟(2)反應(yīng)液中加入分散劑葡聚糖、殼聚糖、淀粉、明膠、聚乙二醇、油酸、白蛋白或乳膠表面活性劑，調(diào)控納米氧化鐵的粒徑，使得納米氧化鐵的粒徑大于金納米籠或金納米立方盒孔徑，得到在金納米籠或金納米立方盒內(nèi)生長(zhǎng)的納米氧化鐵就被裝載在金納米籠的空心籠芯或金納米立方盒內(nèi)，將金納米籠外面的納米氧化鐵經(jīng)多次洗滌后去掉，干燥后得到復(fù)合納米顆粒； (4)、將步驟(3)得到的復(fù)合納米顆粒用生物分子封裝，得到金納米籠/納米氧化鐵顆粒; (5)、將步驟(4)得到的金納米籠/納米氧化鐵顆粒與生物靶向分子反應(yīng)，得到用于基于癌癥早期檢測(cè)、診治一體的復(fù)合納米新材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料的制備方法，其特征在于:納米氧化鐵被包覆在中空金納米籠內(nèi)部。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料的制備方法，其特征在于:生物探針?lè)肿颖话苍谥锌战鸺{米籠或中空金納米立方盒內(nèi)部；生物探針?lè)肿訛闊晒馊玖螩y5或卟啉。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種基于癌癥早期檢測(cè)診治一體的復(fù)合納米新材料及制備方法，利用金納米籠(金納米盒)與納米氧化鐵納米進(jìn)行組裝，合成金納米籠(盒)/納米氧化鐵復(fù)合粒子，并且采用由外到內(nèi)的組裝方法，首先制備金納米籠(盒)，其次氧化鐵在金納米籠(盒)內(nèi)成核長(zhǎng)大，通過(guò)表面活性劑(如葡聚糖等)得到單分散的納米氧化鐵，用生物分子封裝，得到金納米籠(盒)/納米氧化鐵復(fù)合粒子，最后用生物靶向分子(抗體或DNA分子)進(jìn)行表面修飾，用于腫瘤的磁共振成像、熒光成像、暗場(chǎng)成像、特異性靶向多功能的診斷，光熱治療和作為靶向藥物載體。
文檔編號(hào)A61K47/02GK103157118SQ20111041044
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者楊玉東 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)工業(yè)大學(xué)