專利名稱：一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
組織工程是二十一世紀(jì)生命科學(xué)一大熱點(diǎn)。它的核心內(nèi)容是體外細(xì)胞三維培養(yǎng)，它的基本方法是將種子細(xì)胞與可降解生物材料組成復(fù)合體，替代受損組織器官?？勺⑸湫徒M織工程骨是利用初始狀態(tài)為液態(tài)的可降解生物材料，與種子細(xì)胞有機(jī)復(fù)合，制備成液態(tài)可注射的組織工程骨，并且在完全填充骨缺損的過程中，逐步固化形成凝膠或固態(tài)的組織工程骨修復(fù)骨缺損?？勺⑸涔且子谒苄危c種子細(xì)胞、生長因子復(fù)合便捷，且具有組織損傷小、不破壞修復(fù)區(qū)血供、操作簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)了微創(chuàng)外科技術(shù)發(fā)展的要求，因此正逐步引起國內(nèi)外諸多學(xué)者的髙度關(guān)注。目前，用于可注射骨的材料多為凝膠類，主要包括纖維蛋白凝膠，聚氧化乙烯水凝膠，藻酸鹽凝膠等，這些生物材料注入體內(nèi)后為凝膠狀，并不具備生物力學(xué)強(qiáng)度，雖然復(fù)合種子細(xì)胞植入體內(nèi)后都有一定的成骨效果，但距理想的可注射骨支架材料還有相當(dāng)?shù)木嚯x。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，該骨修復(fù)材料為可注射性材料復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細(xì)胞簡便，在一定時(shí)間內(nèi)可完全降解吸收，誘導(dǎo)成骨效應(yīng)明顯，成本較低廉。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法的制備方法，包括如下步驟:
1)種子細(xì)胞的培養(yǎng):抽取骨髓，以全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，所用的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代IO7數(shù)量級；
2)可注射性支架材料的制備:將殼聚糖與β-磷酸三鈣按Iml:0.5g的比例于體外復(fù)合形成殼聚糖-β -磷酸三鈣復(fù)合物；
3)種子細(xì)胞的處理:將培養(yǎng)至第三代IO7數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用0.3ml的DMEM混
勻；
4)種子細(xì)胞與殼聚糖-β-磷酸三鈣的復(fù)合:殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合8分鐘后立即加入步驟(3)處理后的種子細(xì)胞，加入量比例為殼聚糖、β-磷酸三鈣、DMEM按3ml: 1.5g:
0.3ml充分混勻，即獲得所述的組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法。本發(fā)明所釆用的殼聚糖是甲殼素部分脫乙酰基后的衍生物，為天然髙分子聚合物，具有良好的生物降解性，降解產(chǎn)物無毒副作用。本發(fā)明所釆用的β_磷酸三鈣屬于鈣磷陶瓷類，具有和自然骨相似的化學(xué)成份、良好的生物相容性和生物降解性。本發(fā)明將兩者復(fù)合而成為較理想的組織工程骨可注射性支架材料。以往對殼聚糖交聯(lián)所釆用的交聯(lián)劑為戊二醛，但戊二醛被證實(shí)有細(xì)胞毒性，故本發(fā)明中釆用檸檬酸作為殼聚糖的交聯(lián)劑。檸檬酸是人骨有機(jī)質(zhì)的重要組成部分，占到全身的70%，其對糖、脂肪、蛋白質(zhì)的氧化代謝過程有重要作用。由于檸檬酸中含有羧基，可以與殼聚糖中的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，未反應(yīng)的羧基將與殼聚糖中的氨基作用形成鹽鍵。通過此鍵，使殼聚糖交聯(lián)形成有機(jī)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明選用殼聚糖為有機(jī)相，β -磷酸三鈣為無機(jī)相，β -磷酸三鈣與殼聚糖復(fù)合后，分散在有機(jī)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，復(fù)合物最初為液態(tài)，逐慚固化形成固態(tài)、多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且具有一定的生物力學(xué)強(qiáng)度，從而制備了一種新型有機(jī)/無機(jī)復(fù)合的可注射材料。本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果是:
I)本發(fā)明骨修復(fù)材料為可注射性材料復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細(xì)胞簡便，在一定時(shí)間內(nèi)可完全降解吸收，誘導(dǎo)成骨效應(yīng)明顯，成本較低廉。2)本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合支架材料與BMSCs的相容性良好，是一種可行的可注射型組織 工程骨支架材料。以這種復(fù)合材料構(gòu)建的可注射組織工程骨具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
:
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。實(shí)施例1
組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法的制備 包括如下步驟:
1)種子細(xì)胞的培養(yǎng):抽取骨髓，以全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，所用的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代IO7數(shù)量級；
2)可注射性支架材料的制備:將殼聚糖與β-磷酸三鈣按Iml:0.5g的比例于體外復(fù)合形成殼聚糖-β -磷酸三鈣復(fù)合物；
3)種子細(xì)胞的處理:將培養(yǎng)至第三代IO7數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用0.3ml的DMEM混
勻；
4)種子細(xì)胞與殼聚糖-β-磷酸三鈣的復(fù)合:殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合8分鐘后立即加入步驟(3)處理后的種子細(xì)胞，加入量比例為殼聚糖、β-磷酸三鈣、DMEM按3ml: 1.5g:
0.3ml充分混勻，即獲得所述的組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法。實(shí)施例2
MTT法分析BMSCs與殼聚糖-β -磷酸三鈣復(fù)合材料復(fù)合培養(yǎng)后的成活和增殖能力接種細(xì)胞后，于第2、4、6、8天棄原培養(yǎng)基，加入無血清DMEMlml和MTT (5mg/mol) 10 μ 1，在37°C的CO2孵箱內(nèi)孵育4小時(shí)，小心吸去MTT后，加入二甲基亞砜0.5ml振蕩15分鐘，酶標(biāo)儀上選擇波長570nm，測定光吸收值。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組D570逐漸增加，到第8天最髙，殼聚糖-β -磷酸三鈣組在各時(shí)間點(diǎn)與對照組均無顯著性差異(> 0.05)(表I)。表I兩組MTT法測定吸光度值
權(quán)利要求
1.一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，包括如下步驟: 1)種子細(xì)胞的培養(yǎng):抽取骨髓，以全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，所用的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代IO7數(shù)量級； 2)可注射性支架材料的制備:將殼聚糖與β-磷酸三鈣按Iml:0.5g的比例于體外復(fù)合形成殼聚糖-β -磷酸三鈣復(fù)合物； 3)種子細(xì)胞的處理:將培養(yǎng)至第三代IO7數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用0.3ml的DMEM混勻； 4)種子細(xì)胞與殼聚糖-β-磷酸三鈣的復(fù)合:殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合8分鐘后立即加入步驟(3)處理后的種子細(xì)胞，按比例加入殼聚糖、β-磷酸三鈣、DMEM，充分混勻，即獲得所述的組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(4)中殼聚糖、β -磷酸三鈣、 DMEM的比例為3ml: 1.5g:0.3ml。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，包括1)種子細(xì)胞的培養(yǎng)；2)可注射性支架材料的制備；3)種子細(xì)胞的處理；4)種子細(xì)胞與殼聚糖-β-磷酸三鈣的復(fù)合等步驟。本發(fā)明骨修復(fù)材料為可注射性材料復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細(xì)胞簡便，在一定時(shí)間內(nèi)可完全降解吸收，誘導(dǎo)成骨效應(yīng)明顯，成本較低廉。
文檔編號A61L27/38GK103157138SQ201110417699
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者孫葉芳 申請人:西安瑞捷生物科技有限公司