專利名稱：甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)系甘草的主要成分甘草酸加水分解而來， 也是甘草酸在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，是一種五環(huán)三萜類化合物。GA又稱甘草亭酸，分子式 % C30H46O4,白色針狀晶體，熔點(diǎn)沘9 291°C。結(jié)構(gòu)如下式所示
現(xiàn)代研究表明甘草次酸除具有抗炎、抗?jié)?、抗過敏、抗病毒、降血脂、止咳、平喘、止痛等作用外還具有抗腫瘤增生的作用[劉彬，齊云。甘草酸及甘草次酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展。國外醫(yī)藥 植物藥分冊(cè)，2006，21 (3):100-104.]。研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸對(duì)鼠肝細(xì)胞癌、人肝癌細(xì)胞、艾氏腹水癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、人乳腺癌細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、艾滋病等均有顯著的抑制作用。[1，黃煒等.18β_甘草次酸和甘草酸對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的抑制和誘導(dǎo)分化作用.中國中醫(yī)藥科技.2009, 9(2) :92-95 ；2,Rene Csuk, Stefan Schwarz, Ralph Kluge,
Dieter Strohl. Synthesis and biological activity of some antitumor active derivatives from glycyrrhetinic acid, European Journal of Medicinal Chemistry,
2010， 45: 5718-5723.]。甘草次酸已引起了國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)工作者的廣泛興趣。日本正在研究用甘草次酸來治療癌癥，臨床上已有抗肝癌制劑。美國國家癌癥研究中心也正在研究甘草里的“三萜類化合物”抑制癌細(xì)胞生長的效果及預(yù)防蛀牙。西方國家大量進(jìn)口甘草，從中提取甘草次酸治療艾滋病。近年來，我國也開始重視和加強(qiáng)甘草次酸的研究開發(fā)。由于甘草次酸為水不溶性化合物，口服后體內(nèi)吸收差，生物利用度低，且個(gè)體差異性大。作為一種抗癌制劑，延長藥物體內(nèi)滯留時(shí)間并使其能濃集于治療部位，對(duì)于增強(qiáng)藥物療效，提高藥物生物利用度具有重要意義。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一類新型給藥系統(tǒng)，它是將藥物包載于類脂核中形成的粒徑在50-1000nm之間的膠體給藥系統(tǒng)。SLN具有穩(wěn)定性好、藥物載藥量高，同時(shí)又具有脂質(zhì)體的毒性低、能大規(guī)模生產(chǎn)、靴向、緩釋等優(yōu)點(diǎn)[Muller R H, et al. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery a review of the state of the art.Eur J Pharm Biopharm,2000，50(1) 161-177]。普通固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)入體循環(huán)易被巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，在巨噬細(xì)胞體內(nèi)經(jīng)溶酶體作用而釋放藥物，使其具有被動(dòng)靶向性，容易聚集到肝、脾、淋巴結(jié)內(nèi)。為了延長納米粒在體內(nèi)的作用時(shí)間，通?？梢詫?duì)納米粒進(jìn)行PEG修飾，增加其表面親水性，形成立體位阻， 使納米粒躲過單核巨噬細(xì)胞系(MPS)的識(shí)別，延長納米粒在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間，使其以更充足的時(shí)間到達(dá)靶向部位，從而達(dá)到主動(dòng)靶向的目的[Gref R, et al. "Stealth" corona-core nanoparticles surface modified by polyethylene glycol ( PEG): influences of the corona(PEG chain length and surface density) and of the core composition on phagocyt ic uptake and plasma protein adsorption [J]. Colloid Surf B, 2000，18(3 - 4): 301- 313]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種性質(zhì)穩(wěn)定并適合工業(yè)化生產(chǎn)的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法。本發(fā)明的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒是將甘草次酸包裹于類脂核中，具有穩(wěn)定性好、包封率高，可達(dá)到靶向、緩釋等效果。本發(fā)明的甘草次酸固體脂質(zhì)納米?？梢酝ㄟ^多種方法制備，包括乳化蒸發(fā)-高壓乳勻或超聲、薄膜分散-高壓乳勻或超聲以及熔融-高壓乳勻法制備甘草次酸的固體脂質(zhì)納米粒溶液，進(jìn)一步通過加入支架劑冷凍干燥得到方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)母什荽嗡峁腆w脂質(zhì)納米粒的凍干粉。本發(fā)明的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒由治療有效劑量的活性成分包裹在類脂核中構(gòu)成。具體地，其中各成分質(zhì)量百分比如下
甘草次酸ι-ιο%
磷脂10-80%
類脂5-50%
表面活性劑10-50%
當(dāng)處方中所用表面活性劑為聚乙二醇(PEG)修飾材料時(shí)，即為甘草次酸長循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒。常用聚乙二醇修飾材料為PEG的類脂衍生物如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 (mPEG-PE)、甲氧基聚乙二醇-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、聚乙二醇單甲醚膽固醇琥珀酸酯(PEGCHS)等中的一種。所述磷脂可以為蛋黃卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、二磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等。所述的類脂包括甘油脂類，其中包括單硬脂酸甘油酯、雙硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、單棕櫚酸甘油酯、雙棕櫚酸甘油酯、三棕櫚酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三油酸甘油酯、山崳酸甘油酯及其混合物；脂肪酸類，其中包括硬脂酸、棕櫚酸、油酸、山崳酸、癸酸及其混合物；固醇類，包括膽固醇等；蠟質(zhì)類，包括鯨蠟醇棕櫚酸酯、鯨蠟醇十六酸酯以及微晶石蠟。所述表面活性劑可以為聚乙二醇衍生物類，包括聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 (mPEG-PE )、甲氧基聚乙二醇-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE )、聚乙二醇單甲醚膽固醇琥珀酸酯(PEGCHS)等；膽酸鹽類，包括膽酸鈉、苷膽酸鈉、?；悄懰徕c；脫氧膽酸鹽類，包括脫氧膽酸鈉、?；侨パ跄懰徕c；泊洛沙姆類，包括泊洛沙姆108、188、407、908 ；聚山梨醇類，包括吐溫 80、85、65、60、40。用本發(fā)明方法所制得的固體脂質(zhì)納米粒粒徑可控，可根據(jù)需求制備出從50nm到 SOOnm之間不同粒徑大小并且粒徑均一的納米粒。上述甘草次酸固體脂質(zhì)納米?？刹捎萌缦路椒ㄖ苽?br> 方法一按比例稱取甘草次酸和磷脂、類脂及表面活性劑，溶于有機(jī)溶劑；減壓蒸發(fā)， 除去有機(jī)溶劑，在容器壁上形成薄膜，注入PH6-8的水溶液，使得膜材溶解，水化1- ；所形成的乳劑進(jìn)一步通過高壓乳勻或超聲來減小納米粒徑，再過微孔過濾器，即得粒徑均一、 大小可控的固體脂質(zhì)納米粒溶液。方法二 按比例稱取甘草次酸和磷脂、類脂及表面活性劑，溶于有機(jī)溶劑；在攪拌下將有機(jī)溶液直接注入PH6-8的水溶液，使其形成乳液，再減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；所形成的乳劑進(jìn)一步通過高壓乳勻或超聲來減小納米粒徑，再過微孔過濾器，即得粒徑均一、大小可控的固體脂質(zhì)納米粒溶液。方法三按比例稱取甘草次酸和磷脂、類脂及表面活性劑，直接加熱熔融；
在攪拌狀態(tài)下將PH6-8的水溶液注入熔融的混合物中；所形成的乳劑進(jìn)一步通過高壓乳勻或超聲來減小納米粒徑，再過微孔過濾器，即得粒徑均一、大小可控的固體脂質(zhì)納米粒溶液。為便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，可將甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒溶液通過噴霧干燥或冷凍干燥成固體粉末，其中需加入賦形劑。所用賦形劑包括甘露醇、葡萄糖、環(huán)糊精、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化鈉等
本發(fā)明方法，所用有機(jī)溶劑可以使用通常的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、 乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一種或其混合物。所用的pH6-8的水溶液可以使用蒸餾水、注射用水、磷酸緩沖液以及含β-環(huán)糊精、羥丙基β-環(huán)糊精或甲基β-環(huán)糊精的水溶液或磷酸緩沖液。本發(fā)明的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒制劑可用于治療肝炎、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃炎、胃癌、卵巢癌、白血病及艾滋病等疾病。本發(fā)明方法簡單易行，易消毒，適合大規(guī)模生產(chǎn)。所制備的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒粒徑均一，包封率高，穩(wěn)定性好，適合口服或注射等多種給藥途徑，所選的載體材料安全、 無毒、生理相容性好，能靶向于炎癥或癌變部位，并能緩慢釋放藥物，達(dá)到長效的目的。


圖1實(shí)施例1中甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒透射電鏡照片。圖2實(shí)施例1中甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布圖。圖3實(shí)施例1制備甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒過CL-4B凝膠柱洗脫曲線。圖4甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的體外溶出曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1配方質(zhì)量百分比(％)
甘草次酸5
蛋黃卵磷脂40
硬脂酸30
mPEG-DSPE25
稱取甘草次酸、蛋黃卵磷脂、硬脂酸和mPEG-DSPE，溶于2ml乙醇，超聲使其溶解形成透明溶液，將其注入50ml 50°C的蒸餾水中，持續(xù)攪拌30分鐘后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)，進(jìn)一步揮發(fā)有機(jī)溶劑，然后經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)循環(huán)勻質(zhì)3-5次后，室溫放冷，過0. 45Mffl濾膜，即得甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的膠體溶液，該膠體溶液呈半透明、藍(lán)色乳光。用反相高效液相色譜柱測定內(nèi)藥物含量。色譜柱選用ODS C18柱(4.6M50mm，5Mm)，流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(體積比為89:10:1)，流速1.01111/1^11，檢測波長250nm，進(jìn)樣量ΙΟμ 。建立甘草次酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明甘草次酸在lPg/mL-SOPg/mL范圍類線性關(guān)系良好。將所得脂質(zhì)體溶液取0. 2ml過瓊脂糖CL-4B凝膠柱，以pH7. 4的磷酸緩沖液為洗脫液，按每試管 Iml的量收集流出液，根據(jù)洗脫曲線求算包封率達(dá)94. 6%，甘草次酸脂質(zhì)體過CL-4B凝膠柱洗脫曲線見圖3所示。用kta電位粒度測定儀測定其粒徑130. lnm, Zeta電位為-36. 2mv。實(shí)施例2
配方質(zhì)量百分比(％)
甘草次酸1
蛋黃卵磷脂80
油酸9
PEGCHS10
稱取甘草次酸、蛋黃卵磷脂、油酸及mPEG-DSPE置于50ml圓底燒瓶中，加入2ml氯仿使其溶解，40°C水浴置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收有機(jī)溶劑，在瓶壁形成一層膜，進(jìn)一步置于減壓干燥器中完全除去有機(jī)溶劑。注入PH8的磷酸緩沖液水化lh，置于探頭超聲波破碎儀中超聲10-30分鐘，過0.45Mm濾膜，將所得脂質(zhì)體溶液定容，加入10% (g/ml)的蔗糖，經(jīng)冷凍干燥得甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒凍干粉。復(fù)溶后取0. 2ml過瓊脂糖CL-4B凝膠柱，以 PH7. 4的磷酸緩沖液為洗脫液，按每試管Iml的量收集流出液，根據(jù)洗脫曲線求算包封率達(dá) 90%。同樣如實(shí)例1用高效液相色譜法測定固體脂質(zhì)納米粒中甘草次酸含量。測得納米粒粒徑 178. 2nm, Zeta 電位-30. 6mv。實(shí)施例3
配方質(zhì)量百分比(％)
甘草次酸4
大豆磷脂46
棕櫚酸甘油酯5
泊洛沙姆50
稱取甘草次酸、蛋黃卵磷脂、棕櫚酸甘油酯、泊洛沙姆，于60°C熔融混勻，攪拌下將 600C的水注入熔融液中，繼續(xù)攪拌30分鐘，高壓勻質(zhì)機(jī)循環(huán)勻質(zhì)3-5次后，室溫放冷，過 0. 45Mffl濾膜，將超聲所得固體脂質(zhì)納米粒定容，加入5% (g/ml)甘露醇，冷凍干燥，得甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的凍干粉。加蒸餾水復(fù)溶后，取0. 2ml過瓊脂糖CL-4B凝膠柱，以pH7. 4
6的磷酸緩沖液為洗脫液，按每試管Iml的量收集流出液，根據(jù)洗脫曲線求算包封率達(dá)98%。 測定納米粒粒徑為231. 7nm, Zeta電位為-33. 15mv。
實(shí)施例4 配方
甘草次酸氫化大豆磷脂
單硬酯酸甘油酯吐溫80
稱取甘草次酸、蛋黃卵磷脂、
質(zhì)量百分比(％) 10 40 40 10
L硬酯酸甘油酯加入5ml乙酸乙酯使其溶解，用注射器緩慢注入磁力攪拌下的60°C含吐溫80的水溶液，繼續(xù)攪拌30分鐘后，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中， 揮發(fā)有機(jī)溶劑直至完全除去，經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)循環(huán)勻質(zhì)3-5次后，室溫放冷，過0. SMffl濾膜，即得甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的膠體溶液，取0. 2ml過瓊脂糖CL-4B凝膠柱，以pH7. 4的磷酸緩沖液為洗脫液，按每試管Iml的量收集流出液，根據(jù)洗脫曲線求算包封率達(dá)87. 3%。測得粒徑384. lnm, Zeta電位-25. 12mv。加入10% (g/ml)的乳糖，經(jīng)噴霧干燥得甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒固體粉末，該固體粉末可進(jìn)一步制備成膠囊或片劑。實(shí)施例5
質(zhì)量百分比(％) 5 10 50 35
稱取甘草次酸、氫化蛋黃卵磷脂、硬脂酸及mPEG-DSPE置于50ml圓底燒瓶中，加入2ml 二氯乙烷使其溶解，40°C水浴置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收有機(jī)溶劑，在瓶壁形成一層膜，進(jìn)一步置于減壓干燥器中完全除去有機(jī)溶劑。注入含脫氧膽酸鈉的水溶液中水化lh，超聲 10-30分鐘，過0. 45Mffl濾膜，將所得固體脂質(zhì)納米粒溶液定容，根據(jù)洗脫曲線求算包封率達(dá)92. 4%。測得粒徑155. 3nm, Zeta電位-26. 57mv。加入10% (g/ml)的海藻糖，經(jīng)冷凍干燥得甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒凍干粉。該凍干粉可進(jìn)一步制備成膠囊或片劑。實(shí)施例6
質(zhì)量百分比(％) 3
47 15
配方
甘草次酸氫化蛋黃卵磷脂硬酯酸脫氧膽酸鈉
配方
甘草次酸氫化蛋黃卵磷脂癸酸
mPEG-DSPE
35
稱取甘草次酸、氫化蛋黃卵磷脂、膽固醇及mPEG-DSPE置于50ml圓底燒瓶中，加入2ml 氯仿使其溶解，40°C水浴置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收有機(jī)溶劑，在瓶壁形成一層膜，進(jìn)一步置于減壓干燥器中完全除去有機(jī)溶劑。注入含有0. IM β -環(huán)糊精的ρΗ8的水溶液中水化 Ih,反復(fù)凍融3次后過高壓擠壓器，將所得固體脂質(zhì)納米粒溶液定容，根據(jù)洗脫曲線求算包封率達(dá)95. 7%ο測得粒徑152. 6nm, Zeta電位-23. 15mv。 實(shí)施例7甘草次酸固體脂質(zhì)納米體外釋放度的測定。以200mL含0. 5%(g/ml)的十二烷基硫酸鈉和30%(g/ml)乙醇的pH7. 4的PBS溶液為介質(zhì)，精密移取2mL甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒溶液，置于透析袋中(截留分子量3000)，磁力攪拌。分別于0.5、1、2、3、4、6、 8、10、12、M、48小時(shí)取釋放液0. 5mL，過0. 45Mm的微孔濾膜，進(jìn)行HPLC分析，同時(shí)補(bǔ)充同溫度的溶出介質(zhì)lmL。測定GA濃度，計(jì)算累積釋放百分率。按公式Q(%)=(；/(；X 100%計(jì)算釋放量。其中Ct為釋放的藥物量，Ctl為脂質(zhì)體中初始藥物量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積釋放百分率為縱坐標(biāo)，繪制體外釋藥曲線，詳見圖4。將所得數(shù)據(jù)按一級(jí)、Higuchi及Weibull方程進(jìn)行擬合，相關(guān)方程及擬合度見表1。結(jié)果表明其釋放規(guī)律更符合一級(jí)速率過程，說明甘草次酸在固體脂質(zhì)納米中主要以被動(dòng)擴(kuò)散的方式向溶出介質(zhì)中釋放。
表1甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的體外釋藥曲線擬合
權(quán)利要求
1.一種甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒，由治療有效劑量的活性成分包裹在類脂核中構(gòu)成， 其特征在于，其中各成分質(zhì)量百分比如下甘草次酸1-10%磷脂10-80%類脂5-80%表面活性劑10-50%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒，其特征在于，所述磷脂為天然磷脂或合成磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒，其特征在于，所述的類脂包括甘油脂類，脂肪酸類、固醇類或蠟質(zhì)類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒，其特征在于，所述表面活性劑為聚乙二醇衍生物類，膽酸鹽類，脫氧膽酸鹽類，泊洛沙姆類或聚山梨醇類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒，其特征在于，其粒徑在50-1000nm 之間。
6.權(quán)利要求1所述甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，其特征在于，按比例稱取甘草次酸和磷脂、類脂及表面活性劑，溶于有機(jī)溶劑；減壓蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，在容器壁上形成薄膜，注入pH6-8的水溶液，使得膜材溶解，水化1- ；所形成的乳劑進(jìn)一步通過高壓乳勻或超聲來減小納米粒徑，再過微孔過濾器，即得粒徑均一、大小可控的固體脂質(zhì)納米粒溶液。
7.權(quán)利要求1所述甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，其特征在于，按比例稱取甘草次酸和磷脂、類脂及表面活性劑，溶于有機(jī)溶劑；在攪拌下將有機(jī)溶液直接注入PH6-8的水溶液中，使其形成乳液，再減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；所形成的乳劑進(jìn)一步通過高壓乳勻或超聲來減小納米粒徑，再過微孔過濾器，即得粒徑均一、大小可控的固體脂質(zhì)納米粒溶液。
8.權(quán)利要求1所述甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，其特征在于，按比例稱取甘草次酸和磷脂、類脂及表面活性劑，直接加熱熔融；在攪拌狀態(tài)下將PH6-8的水溶液注入熔融的混合物中；所形成的乳劑進(jìn)一步通過高壓乳勻或超聲來減小納米粒徑，再過微孔過濾器，即得粒徑均一、大小可控的固體脂質(zhì)納米粒溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，屬于藥物制劑領(lǐng)域。本發(fā)明的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒主要成分包括活性原料甘草次酸、可藥用的磷脂、脂質(zhì)材料、表面活性劑。本發(fā)明制備的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒溶液及其凍干粉針劑，其粒徑小，包封率高，穩(wěn)定性好，可用于口服和注射給藥等多種給藥途徑。本發(fā)明的甘草次酸固體脂質(zhì)納米粒，不僅可以減少用藥劑量，增強(qiáng)療效，而且可以降低藥物的毒副作用，適用于治療肝炎、肝癌、肺癌、卵巢癌、胃炎、胃癌、白血病及艾滋病等多種疾病。
文檔編號(hào)A61K31/56GK102512369SQ20111042559
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者周小菊, 王炯, 胡先明 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)