專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能型檢測(cè)微針技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針及其制備方法。
背景技術(shù)：
監(jiān)測(cè)內(nèi)源或外源分子在靶器官中的分布比測(cè)定他們?cè)谘褐械臐舛雀幸饬x，包括理解生理機(jī)制如神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)和評(píng)價(jià)藥物生物利用度如癌癥化療等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的原位分析方法由于其侵入性或復(fù)雜的樣品制備，不能完全滿(mǎn)足這種監(jiān)測(cè)要求。拉曼光譜技術(shù)可以提供基于分子振動(dòng)的化學(xué)和物理信息，因?yàn)槔鼨z測(cè)時(shí)不需考慮樣品的狀態(tài)，溫度，形態(tài)和大小等物理狀態(tài)，所以該技術(shù)是理想的實(shí)時(shí)原位監(jiān)測(cè)生物樣品的技術(shù)。通過(guò)對(duì)納米材料進(jìn)行設(shè)計(jì)和制造可以使納米材料具有表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)效應(yīng)，在樣品濃度較低時(shí)仍能得到強(qiáng)度較高的增強(qiáng)拉曼信號(hào)，因此這些納米材料常被作為定性或半定量的超靈敏檢測(cè)分析工具。目前科學(xué)家就使用拉曼光譜檢測(cè)體內(nèi)的目標(biāo)分子已進(jìn)行許多嘗試，但如何獲得活體樣本相關(guān)的表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。例如，如何在不損壞機(jī)體和材料的情況下，植入并取出具有增強(qiáng)拉曼信號(hào)的材料，如何避免機(jī)體對(duì)具有增強(qiáng)拉曼信號(hào)的材料產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，以及如何在活體中收集可分辨的增強(qiáng)拉曼信號(hào)。另外在一般情況下，紅外激光器往往作為激發(fā)源，它可以幾乎無(wú)衰減的穿透一些生物組織，但相應(yīng)的拉曼信號(hào)卻很難穿透這些組織。因此如何得到一定深度的皮下組織的增強(qiáng)拉曼信號(hào)也是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。在中醫(yī)中通過(guò)將針灸針插入人體來(lái)進(jìn)行治療的方法已使用了幾千年，它的主要特點(diǎn)是治療過(guò)程中的微創(chuàng)性，所以針灸針是一種出入人體的理想的微創(chuàng)的工具。在這里，針灸針被用作載體荷載具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的活性納米材料形成出入人體的檢測(cè)微針。當(dāng)微針進(jìn)入體內(nèi)或組織時(shí)，組織液會(huì)擴(kuò)散到金納米殼之間的間隙內(nèi)，當(dāng)微針被拔出時(shí)可以將組織液中的待測(cè)分子攜帶出來(lái)。體外的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)可避免增強(qiáng)拉曼信號(hào)在組織中的衰減，同時(shí)根據(jù)檢測(cè)微針刺入的深度可以得到一定深度的皮下組織的增強(qiáng)拉曼信號(hào)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將醫(yī)用針灸針作為檢測(cè)微針的制備主體，利用檢測(cè)探針針身覆蓋的金屬納米材料的增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的作用測(cè)定探針表面生物分子的拉曼和熒光信號(hào)，發(fā)明一種可用于體外和體內(nèi)的快速微創(chuàng)的檢測(cè)方法。技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)探針及其制備方法，具有用于體內(nèi)或體外分子拉曼和熒光檢測(cè)的特點(diǎn)。技術(shù)方案本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，其針身和針尖部分的表面覆蓋有金屬納米材料層，金屬納米顆粒直徑為20-1000 nm，金屬納米材料層表面又覆蓋有高分子材料層。本發(fā)明所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針制備方法
步驟1)在微針的針身和針尖表面至少修飾氨基、醛基、羧基和羥基中的一種基團(tuán)得到功能化的微針，所用方法在本領(lǐng)域是已知的。所述的微針為臨床所用各種類(lèi)型的針灸針。步驟2)將步驟1的針身和針尖插入濃度為IO8-IOw個(gè)粒子/升的金屬納米粒子懸浮液中靜置12-48小時(shí)后，取出微針即可；
所述的金屬納米粒子層為球形的納米粒子層，可以是單一的金屬納米粒子層包括金納米粒子層、銀納米粒子層、銅納米粒子層、鉬納米粒子層；可以是球形的復(fù)合納米粒子層包括金銀復(fù)合納米粒子層及金、銅和鉬復(fù)合納米粒子層；可以是球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層包括銀核金殼復(fù)合納米粒子層、銅核金銀復(fù)合殼納米粒子層、銅核金銀雙層殼納米粒子層；可以是非金屬的SiO2核金殼、銀殼、銅殼、鉬殼或復(fù)合殼納米粒子層，所述的復(fù)合殼納米粒子為金、銀、銅和鉬中的兩種或兩種以上金屬?gòu)?fù)合的殼納米粒子。步驟3)將步驟2處理后的針身和針尖插入高分子溶液中的高分子質(zhì)量與溶液體積比為0. 1-10%的高分子溶液中靜置1-60秒后，取出即得檢測(cè)微針。所述的高分子溶液可以是聚苯乙烯溶液；可以是聚乳酸溶液；可以是聚氨酯溶液；可以是聚乙烯丙綸溶液。將上述制備的微針表面修飾特定的基團(tuán)后，可以用于特定分子的體外檢測(cè)，所述的特定分子可以是核酸，可是蛋白質(zhì)。將上述制備的微針直接插入施針的部位，滯留一定時(shí)間后取出并作拉曼或熒光檢測(cè)，可以檢測(cè)施針部位組織液成分的改變。將上述制備的微針插入注射藥物的部位，并對(duì)針身和針尖的不同部位作拉曼或熒光檢測(cè)，可以測(cè)定分子藥物在組織中的擴(kuò)散和分布情況，得到一定深度的皮下組織的拉曼信號(hào)。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)本項(xiàng)目利用結(jié)構(gòu)均一的納米粒子構(gòu)建增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的納米結(jié)構(gòu)，有利于獲得增強(qiáng)因子一致的納米結(jié)構(gòu)，最大程度上提高檢測(cè)信號(hào)；通過(guò)在納米粒子表面修飾不同的功能分子可進(jìn)行特異性檢測(cè)，也可以用于體內(nèi)不同分子的特異性微創(chuàng)檢測(cè)。(2)基于納米聚集體的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，建立快速超靈敏的檢測(cè)方法，不需對(duì)樣品進(jìn)行濃縮等前處理直接進(jìn)行分析，可以降低試劑的消耗和縮短檢測(cè)的時(shí)間。(3)利用檢測(cè)微針的特性在活體微創(chuàng)檢測(cè)時(shí)可以提供目標(biāo)分子的在皮下組織的深度分布信息，這是其他活體分析技術(shù)所難以具備的。


圖1是一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針制備示意圖。圖3是一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針針身A-A橫截面示意圖。圖4是檢測(cè)微針表面吸附了金屬納米材料層的電鏡圖。圖5是檢測(cè)微針表面的金屬納米材料的電鏡圖。圖6是用檢測(cè)微針檢測(cè)尼羅藍(lán)A的拉曼光譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，如圖1所示，檢測(cè)微針包括依次連接的針柄13、針身12及針尖11。如圖3所示，在針身12及針尖11的表面上覆蓋有金屬納米材料層2，在金屬納米材料層2上包覆有高分子材料層3。所述的金屬納米材料粒徑為20-1000 nm，參見(jiàn)圖5，針身和針尖表面覆蓋有1-2層金納米粒子層，金納米粒子直徑為180nm。在本實(shí)施例中，
所述高分子材料層為聚苯乙烯層、聚乳酸層、聚氨酯層或聚乙烯丙綸層中的一種。所述金屬納米材料層可以是下列之一
1)金屬納米材料層為金納米粒子層、銀納米粒子層、銅納米粒子層或鉬納米粒子層；
2)金屬納米材料層為球形復(fù)合納米粒子層，所述的球形復(fù)合納米粒子層為金、銀、銅和鉬的兩種或兩種以上的金屬?gòu)?fù)合納米粒子層。3)金屬納米材料層為球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層，所述的球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層包括銀核金殼復(fù)合納米粒子層、銅核金銀復(fù)合殼納米粒子層、銅核金銀雙層殼納米粒子層。4)金屬納米材料層為非金屬的S^2核金殼、銀殼、銅殼、鉬殼或復(fù)合殼納米粒子層，所述的復(fù)合殼納米粒子為金、銀、銅和鉬中的兩種或兩種以上金屬?gòu)?fù)合的殼納米粒子。實(shí)施例2
一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針的制備方法，步驟如下 步驟1)在微針的針身和針尖表面至少修飾氨基、醛基、羧基和羥基中的一種基團(tuán)； 步驟2)將步驟1的針身和針尖插入濃度為IO8-IO18個(gè)粒子/升的金屬納米粒子懸浮液中靜置12-48小時(shí)后，取出微針即可；
步驟3)將步驟2處理后的針身和針尖插入高分子溶液中的高分子質(zhì)量與溶液體積比為0. 1-10%的高分子溶液中靜置1-60秒后，取出即得檢測(cè)微針。實(shí)施例3 —種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針的制備
在檢測(cè)微針的針身和針尖表面修飾巰基得功能化的微針(修飾巰基的方法在本領(lǐng)域是已知的)，調(diào)節(jié)金納米粒子懸浮液使其濃度為IX 108_18個(gè)/升。再將功能化的微針在金納米粒子懸浮液中靜置12-48小時(shí)后取出。由于微針表面的巰基和金納米粒子的化學(xué)鍵作用， 金納米粒子會(huì)吸附在針灸針表面，如圖5所示，形成1-2層結(jié)構(gòu)均一的、有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的納米結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)圖2，金屬納米粒子層通過(guò)巰基或羥基等基團(tuán)能夠與針身和針尖表面相連接。再將微針的覆蓋有金納米粒子的部分插入質(zhì)量與體積比0. 1-10%的聚苯乙烯溶液中靜置1-60秒后，取出室溫放置即可。形成的聚苯乙烯層可以在插入和取出針的過(guò)程中保護(hù)金納米粒子不被摩擦掉。實(shí)施例4具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針在體外檢測(cè)中的應(yīng)用——表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)
將表面未經(jīng)過(guò)任何處理的微針和上述制備的微針同時(shí)浸泡在濃度為1微摩爾/升的尼羅藍(lán)A溶液中，浸泡30分鐘后取出，洗滌，拉曼光譜儀測(cè)定兩根微針表面的拉曼信號(hào)。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。參考圖6，曲線1為表面未經(jīng)任何處理的微針表面的尼羅藍(lán)A分子的拉曼信號(hào)，曲線2表示上述制備的微針表面的尼羅藍(lán)A分子的拉曼
5信號(hào)，可以看出微針未經(jīng)處理時(shí)不具備放大拉曼信號(hào)的功能，而表面吸附有金屬納米粒子層的微針可以增強(qiáng)分子的拉曼信號(hào)。實(shí)施例5具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針在體外檢測(cè)中的應(yīng)用——核酸檢測(cè)(拉曼信號(hào))
將上述制備的微針浸泡在10微升巰基化核酸探針?lè)肿?10納摩爾/升)，4°C過(guò)夜，洗去未反應(yīng)的核酸探針?lè)肿?。再將該微針插入待測(cè)溶液中，72°C雜交5分鐘，再熱循環(huán)處理3 次(60°C/4°C)。37°C再加入核酸內(nèi)切酶處理5分鐘，洗滌，拉曼光譜儀測(cè)定核酸特征信號(hào)。 所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實(shí)施例6具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的微針在體外檢測(cè)中的應(yīng)用——蛋白檢測(cè) (拉曼信號(hào))
將上述制備的微針浸泡在10微升巰基化葉酸分子(1納摩爾/升)中，4°C過(guò)夜，洗去未反應(yīng)的葉酸分子。再將該微針浸泡在細(xì)胞膜蛋白提取液中，37°C溫育30分鐘，洗滌，拉曼光譜儀測(cè)定葉酸受體蛋白分子的特征信號(hào)。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實(shí)施例7具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針在體外檢測(cè)中的應(yīng)用——核酸檢測(cè)(熒光信號(hào))
將上述制備的微針浸泡10微升標(biāo)記熒光信號(hào)分子的巰基化核酸探針?lè)肿?10納摩爾/ 升)，4°C過(guò)夜，洗去未反應(yīng)的核酸分子，測(cè)定熒光的信號(hào)強(qiáng)度。再將該微針插入待測(cè)溶液中， 72°C雜交5分鐘，再熱循環(huán)處理3次(60°C /4°C )。37°C再加入單鏈核酸水解酶處理5分鐘， 洗滌，再次測(cè)定熒光的信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算熒光信號(hào)的衰減，得到結(jié)合核酸的量。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實(shí)施例8具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針在體內(nèi)檢測(cè)中的應(yīng)用——組織液成分檢測(cè)
將上述制備的微針直接插入需要檢測(cè)的組織中，并插到需要檢測(cè)的深度。滯留5-30分鐘，取出微針直接用拉曼光譜儀檢測(cè)微針表面的組織液的拉曼圖譜，然后和正常組織液的拉曼圖譜比較，分析施針前后組織液中分子的種類(lèi)和數(shù)量的變化。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實(shí)施例9具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針在體內(nèi)檢測(cè)中的應(yīng)用——組織液葡萄糖檢測(cè)
將上述制備的微針浸泡5毫克/毫升的3-巰基苯硼酸溶液4°C過(guò)夜，洗去未反應(yīng)的 3-巰基苯硼酸后保存于生理鹽水中。直接插入需要檢測(cè)的組織中，并插到需要檢測(cè)的深度。 滯留5-30分鐘，取出直接用拉曼光譜儀檢測(cè)，測(cè)定的3-巰基苯硼酸結(jié)合的葡萄糖拉曼圖譜，由強(qiáng)度計(jì)算葡萄糖含量。按同樣的原理，在制備的微針上功能化其他特異性分子可以進(jìn)行其他的特異性檢測(cè)。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實(shí)施例10具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的微針在體內(nèi)檢測(cè)中的應(yīng)用——深度可分辨檢測(cè)
用劑量為50 mg/kg的戊巴比妥鈉對(duì)新西蘭雄性兔子進(jìn)行腹腔給藥進(jìn)行麻醉，在麻醉藥起作用后，將股外側(cè)肌腱上的毛發(fā)用剪刀剪去。將200 μ , 2X10-4 M的NBA溶液注入股外側(cè)肌腱中。5-10分鐘后，將上述制備的微針直接插入肌腱組織中，深度必須足夠深。滯留5-30分鐘后，取出微針直接用拉曼光譜對(duì)針尖、針體的不同部位檢測(cè)，并將光譜進(jìn)行比較，可以分析藥物在組織中擴(kuò)散的程度。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。
權(quán)利要求
1.一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，包括依次連接的針柄(13)、針身(12) 及針尖(11)，其特征在于，在針身(12)及針尖(11)的表面上覆蓋有金屬納米材料層(2)，在金屬納米材料層(2)上包覆有高分子材料層(3)，所述的金屬納米材料粒徑為20-1000 nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，其特征在于，金屬納米材料層為金納米粒子層、銀納米粒子層、銅納米粒子層或鉬納米粒子層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，其特征在于，金屬納米材料層為球形復(fù)合納米粒子層，所述的球形復(fù)合納米粒子層為金、銀、銅和鉬的兩種或兩種以上的金屬?gòu)?fù)合納米粒子層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，其特征在于，金屬納米材料層為球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層，所述的球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層包括銀核金殼復(fù)合納米粒子層、銅核金銀復(fù)合殼納米粒子層、銅核金銀雙層殼納米粒子層。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，其特征在于，金屬納米材料層為非金屬的SiO2核金殼、銀殼、銅殼、鉬殼或復(fù)合殼納米粒子層，所述的復(fù)合殼納米粒子為金、銀、銅和鉬中的兩種或兩種以上金屬?gòu)?fù)合的殼納米粒子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針，其特征在于，高分子材料層為聚苯乙烯層、聚乳酸層、聚氨酯層或聚乙烯丙綸層中的一種。
7.—種權(quán)利要求1所述具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1)在微針的針身和針尖表面至少修飾氨基、醛基、羧基和羥基中的一種基團(tuán)；步驟2)將步驟1的針身和針尖插入濃度為IO8-IO18個(gè)粒子/升的金屬納米粒子懸浮液中靜置12-48小時(shí)后，取出微針即可；步驟3)將步驟2處理后的針身和針尖插入高分子溶液中的高分子質(zhì)量與溶液體積比為0. 1-10%的高分子溶液中靜置1-60秒后，取出即得檢測(cè)微針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的檢測(cè)微針及其制備方法，其特征在于將醫(yī)用針灸針作為制備基礎(chǔ)，在微針的針身和針尖部分的表面覆蓋有具有增強(qiáng)拉曼和熒光信號(hào)的金屬納米材料層以及高分子材料層。檢測(cè)微針的結(jié)構(gòu)包括表面巰基和氨基化的微針、金屬納米粒子層、高分子材料層。直徑為20-1000nm的金屬納米粒子通過(guò)共價(jià)鍵或靜電吸附作用包覆在針灸針表面。高分子層覆蓋在最外層保護(hù)金屬納米粒子。利用檢測(cè)微針的特點(diǎn)可以進(jìn)行體外樣品的拉曼和熒光檢測(cè)，也可以進(jìn)行生物體內(nèi)的微創(chuàng)取樣及拉曼和熒光檢測(cè)。本發(fā)明可以為體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)研究、臨床診斷及大樣本篩查提供快速超靈敏檢測(cè)新方法。
文檔編號(hào)A61B5/00GK102525421SQ201110438268
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者唐棟梁, 董健, 袁倩倩, 許蓓蓓, 郭明德, 陶琴 申請(qǐng)人:東南大學(xué)