專利名稱：富勒醇固體脂質(zhì)納米粒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于輻射防護(hù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有輻射防護(hù)功能的細(xì)胞核靶向的富勒醇固體脂質(zhì)納米粒。
背景技術(shù)：
核能在國(guó)防、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，在造福人類的同時(shí)，也帶來(lái)嚴(yán)重的核輻射危機(jī)。2011年3月日本9. 0級(jí)強(qiáng)震導(dǎo)致福島核電站發(fā)生高溫核燃料泄漏，電離輻射對(duì)機(jī)體的損傷及其防護(hù)已經(jīng)得到了各國(guó)政府和研究人員的高度重視。放射性同位素在工業(yè)、農(nóng)業(yè)等應(yīng)用中的輻射防護(hù)非常重要，在腫瘤放射治療時(shí)對(duì)正常組織與器官的保護(hù)也很重要。電離輻射是一切能引起物質(zhì)電離的輻射總稱，它作用于機(jī)體，輻射能量被生物組織吸收，導(dǎo)致分子發(fā)生激發(fā)和電離、自由基產(chǎn)生、化學(xué)鍵發(fā)生斷裂、生物大分子發(fā)生變性，導(dǎo)致細(xì)胞、組織器官和系統(tǒng)發(fā)生變化，繼而引起全身功能的變化，最終出現(xiàn)病理變化。射線的能量作用于水分子，產(chǎn)生大量的自由基如H_、H2、H2O2, Haq-, OH'、eaq-等，由于細(xì)胞核組織含有大量水分，機(jī)體的主要生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)處于大量水分子(60%-70%左右)的包圍中，這些自由基能夠迅速作用于DNA、蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)分子等靶分子，造成生物大分子損傷、細(xì)胞周期紊亂及遺傳變異等。DNA受到自由基的攻擊，造成堿基與核糖氧化、單鏈及雙鏈斷裂等多種損傷。Templeteton等的實(shí)驗(yàn)證實(shí)低LET射線誘導(dǎo)的損傷90 %是由0H_引起，從而導(dǎo)致雙鏈斷裂(double strand break，DSB)，由于雙鏈斷裂可直接致染色體畸變和遺傳物質(zhì)丟失，所以雙鏈斷裂是DNA分子結(jié)構(gòu)及遺傳學(xué)完整性的最關(guān)鍵性損傷，也是細(xì)胞死亡的主要原因之一。在眾多水輻解產(chǎn)物中，0H_在導(dǎo)致輻射損傷中具有重要地位，一方面與0H_在體內(nèi)的擴(kuò)散距離可達(dá)215 nm，對(duì)靶分子的危害性較大有關(guān)，另一方面也與體內(nèi)尚無(wú)專一清除0H_的物質(zhì)有關(guān)。所以，理想的自由基清除劑應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，特別是細(xì)胞核內(nèi)，在電離輻射產(chǎn)生自由基的瞬間立即清除DNA和生物膜周圍的自由基。盡管人體內(nèi)有天然存在的自由基清除劑(如SOD等)，但是這些自由基清除劑無(wú)法進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，特別是沒(méi)有0H_、ea(1-等自由基的天然清除劑。目前國(guó)內(nèi)外研制了不少輻射防護(hù)劑，但是效果不盡理想，不同程度存在防護(hù)效價(jià)低、穩(wěn)定性差、有效時(shí)間短、毒副作用大和口服效果差等缺點(diǎn)，同時(shí)，這些藥物主要是針對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)。1985年美國(guó)的Smally，Curl和英國(guó)的Kroto首次發(fā)現(xiàn)富勒烯(fullerene，C60), 而富勒烯的水溶性多羥基衍生物一富勒醇是良好的自由基清除劑，它能夠清除0H_、eaq-等自由基，尤其與0H_和的反應(yīng)速率常數(shù)可達(dá)0. 5 3. 3 X IO10M-1S-10水溶性富勒醇能夠快速地穿過(guò)細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，主要分布在胞漿以及線粒體等細(xì)胞器中。并且，富勒烯的毒理學(xué)研究表明其是低毒化合物。根據(jù)放射生物學(xué)的“靶學(xué)說(shuō)”和大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，電離輻射作用的“靶”主要是基因組DNA，其次是包括質(zhì)膜、核膜和細(xì)胞器膜在內(nèi)的生物膜，而DNA 主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，自由基會(huì)在很短的時(shí)間內(nèi)攻擊靶分子DNA，所以理想的自由基清除劑應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)尤其是細(xì)胞核內(nèi)，在電離輻射產(chǎn)生自由基的瞬間立即清除DNA和生物膜周圍的自由基。而現(xiàn)有的輻射防護(hù)藥物，主要都是針對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)，未見(jiàn)輻射防護(hù)藥物能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的報(bào)道?，F(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于多羥基富勒醇的應(yīng)用，主要有以下報(bào)道
(1)公開(kāi)號(hào)為101397132 A的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書公開(kāi)了一種水溶性富勒烯衍生物，所述富勒烯衍生物包括以通式C6ciOxHy (10<Y<X<50)表示的富勒醇或以通式 C60(C(COOH)2)N (N=l-3)表示的富勒烯羧基衍生物；所述水溶性富勒烯衍生物具有抑制腫瘤的作用，與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺、順鉬、紫杉醇等相比，富勒醇和羧基化富勒烯納米顆粒具有用量小，毒性低，且具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)。(2)將不同的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合到富勒烯分子上，形成新的富勒烯衍生物，用于不同的目的。但是目前還沒(méi)有關(guān)于應(yīng)用富勒烯或其衍生物作為輻射防護(hù)藥物的報(bào)道，也沒(méi)有將多羥基富勒醇C60 (OH) x載帶到細(xì)胞核做自由基清除劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種受體_配體介導(dǎo)的細(xì)胞核靶向富勒醇硬脂質(zhì)納米粒，使它能夠通過(guò)多種生物屏障和核膜，高效率地載帶富勒醇到細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮其強(qiáng)大的清除自由基能力，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子DNA的輻射防護(hù)的作用。本發(fā)明的主要原理為使用生物材料(混合類脂，即液態(tài)脂質(zhì)與固態(tài)脂質(zhì)混合的混合物)為載體，將富勒醇包裹起來(lái)，在其表面連接與核受體具有高度親和力的雌激素類似物，制備成的新受體_配體介導(dǎo)的納米材料，即為所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種富勒醇固體脂質(zhì)納米粒， 所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒包括硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、玉米油和吐溫-80，還包括富勒醇粉末和己烯雌酚；其中，富勒醇粉末、硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、己烯雌酚、玉米油和吐溫-80 的質(zhì)量比為:7(M00 995-1005 245-255 495-505 0. 84 595-605 700-800 上述技術(shù)方案中，富勒醇固體脂質(zhì)納米粒的形態(tài)近似球形，直徑25(T500nm左右。制備上述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒的方法包括以下步驟按照上述質(zhì)量比，將硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、玉米油、富勒醇粉末和己烯雌酚溶于乙醇，充分溶解并混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，將其緩慢滴加至65°C 80°C左右吐溫-80水溶液，加完后繼續(xù)攪拌以混勻，得 C60 (OH) 24-SLN-E初乳；將C60 (OH) 24_NLC_E初乳進(jìn)行高壓乳勻，冷卻后得到所需產(chǎn)品初乳為白色乳狀液體，冷凍干燥后為分散的粉末；所述吐溫-80水溶液濃度為10mg/m廣12 mg/mL。上述技術(shù)方案中，所述富勒醇為C60(0H)24。上述技術(shù)方案中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，包裹標(biāo)記物羅丹明-6G的 C60 (OH)24 -SLN-E能夠快速進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞核內(nèi)有明顯聚集，表明C60(0H)24 - SLN -E能穿過(guò)核膜，到達(dá)細(xì)胞核。通過(guò)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察到受、射線照射后該納米材料對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的輻射保護(hù)作用。通過(guò)免疫熒光的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定受到Y(jié)射線照射后體外培養(yǎng)細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂的水平，反映該納米材料清除自由基，直接保護(hù)DNA靶分子免受自由基攻擊的能力，從而達(dá)到較強(qiáng)的輻射防護(hù)效果。因此，本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)上述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒在制備輻射防護(hù)藥物的應(yīng)用，尤其是在制備具有細(xì)胞核靶向的輻射防護(hù)藥物的應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種具有細(xì)胞核靶向的輻射防護(hù)藥物，主要活性成分為上述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明所述細(xì)胞核靶向富勒醇固體脂質(zhì)納米粒C60 (OH)24-SLN-E能穿過(guò)核膜，到達(dá)細(xì)胞核，清除細(xì)胞核內(nèi)的自由基，直接保護(hù)DNA靶分子免受自由基攻擊的能力，從而達(dá)到較強(qiáng)的輻射防護(hù)效果。2.本發(fā)明所述細(xì)胞核靶向富勒醇固體脂質(zhì)納米粒C60(0H)24-SLN_E能夠高效率地載帶富勒醇，其所載帶的富勒醇分布均一、密集，使它能夠穿過(guò)多種生物屏障和核膜，到達(dá)全身各組織器官，尤其是輻射敏感組織、細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮強(qiáng)大的清除自由基的能力。3.本發(fā)明在制備細(xì)胞核靶向富勒醇固體脂質(zhì)納米粒C60 (OH)24-SLN-E時(shí)，所用的脂質(zhì)材料均為生物相容性較好的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)可以在體內(nèi)降解，所以該產(chǎn)品的毒性作用較小。4.本發(fā)明所述細(xì)胞核靶向富勒醇固體脂質(zhì)納米粒C60 (OH)24-SLN-E具有較高的穩(wěn)定性，所載帶富勒醇在儲(chǔ)藏過(guò)程中不易析出，便于保存。


圖1是實(shí)施例中所得富勒醇C60 (OH) 24水溶液FT-IR譜； 圖2是實(shí)施例中C60 (OH)24水溶液1H-NMR圖譜(氘代DMS0)； 圖3是實(shí)施例中C60 (0!1)24水溶液質(zhì)譜譜圖4是實(shí)施例中C60 (OH)24水溶液掃描電鏡照片；
圖5是實(shí)施例中C60 (OH)24 -SLN-E粒徑分布圖6是實(shí)施例中C60 (OH)24 -SLN-E透射電鏡圖7是實(shí)施例中C60 (OH)24 -SLN-E掃描電鏡圖8是實(shí)施例中V79細(xì)胞普通光圖9是實(shí)施例中V79細(xì)胞熒光圖(呈紅色熒光)；
圖10是實(shí)施例中C60 (OH)24 -SLN-E激光共聚焦顯微鏡圖(呈紅色熒光)；
圖11是實(shí)施例中C60 (OH)24 -SLN-E激光共聚焦顯微鏡圖(呈紅色熒光)；
圖12是實(shí)施例中MTT比色法測(cè)定細(xì)胞毒性圖
圖13是實(shí)施例中用藥組和單純照射組照射后的生存曲線；
圖14是實(shí)施例中空白對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)用抗Y-H2AX標(biāo)記的細(xì)胞激光共聚焦圖
像；
圖15是實(shí)施例中單純照射組在不同時(shí)間點(diǎn)用抗Y-H2AX標(biāo)記的細(xì)胞激光共聚焦圖像 (呈綠色熒光)；
圖16是實(shí)施例中加藥照射組在不同時(shí)間點(diǎn)用抗Y-H2AX標(biāo)記的細(xì)胞激光共聚焦圖像 (呈綠色熒光)；
圖17是實(shí)施例中不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞焦點(diǎn)數(shù)比較圖； 圖18是實(shí)施例中不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述材料
倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞V79 (購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù))，并由本實(shí)驗(yàn)室保存和培養(yǎng)。富勒烯(99. 9% 標(biāo)準(zhǔn)品，河南濮陽(yáng)永新科技有限公司)，硬脂酸(AR，中國(guó)菱湖精細(xì)化工廠·浙江)，膽固醇 (AR，滬試)，卵磷脂(AR，滬試)，玉米油(Sigma，德國(guó))，吐溫-80 ( Ε. M. K進(jìn)口分裝)，1640培養(yǎng)基、胎牛血清(維森特公司)，TBAH、苯、H202、甲醇、羅丹明-6G (滬試)，抗、-H2AX小鼠單克隆抗體及羊-抗-鼠-FITC 二抗(蘇州博美達(dá)試劑公司)。HERA CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Kedro公司)，F(xiàn)6/10超速勻漿機(jī)(上海FLUKO流體機(jī)械制造有限公司)，納米粒度儀(ΝΑΝ0ΡΗ0Χ)，高分辨透射電鏡TEM (TecnaiG220,美國(guó)FEI公司)，掃描電鏡(HITACHI S-4700)，磁共振譜儀(美國(guó)瓦里安UNITY IV0VA-1000)，紅外線譜儀(美國(guó)瓦里安FTS-1000 )，高壓微射流設(shè)備 (MASSACHUSETTS，USA)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(waters ACQUITY Quattro Premier XE), TCP-SP型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，6tlCo- γ治療機(jī)(GWXJ80，中國(guó)核動(dòng)力研究院設(shè)備制造廠)。實(shí)施例一
細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%滅活胎牛血清及雙抗，工作濃度為青霉素100U/ml，鏈霉素0. lmg/ml)，培養(yǎng)箱CO2濃度5%，溫度37°C，2 3天傳代一次，復(fù)蘇3代后用于實(shí)驗(yàn)。水溶性富勒醇的制備與表征稱取IOOmg C60溶于50mL的苯中攪拌過(guò)夜，加入2mL 2mol/L的NaOH溶液，在磁力攪拌下加5滴40%TBAH溶液，滴加0. 5mL 30%的H2O2溶液，待苯液變無(wú)色，水相變棕色即告反應(yīng)結(jié)束。用分液漏斗分離有機(jī)相與水相，并用2-3ml水將分液漏斗洗滌2次，合并水相即富勒醇溶液。加甲醇20-30ml使其沉淀，離心，重復(fù)此操作3_4 次，PH試紙測(cè)pH<8即可。置于冷凍干燥箱內(nèi)獲得富勒醇粉末。(參見(jiàn)文獻(xiàn)李添寶、黃克雄， C60 (OH) χ (0) y的快速制備及其水解形成C60 (OH) n) [J]化學(xué)通報(bào)，1999，4 ;30 32)
對(duì)所得富勒醇粉末進(jìn)行紅外光譜分析取少量富勒醇粉末與干燥KBr —起研磨，混合均勻，壓制成薄片，將此薄片放入紅外光譜儀，掃描其紅外吸收光譜。所得結(jié)果參見(jiàn)圖1，圖 1為所得富勒醇粉末的水溶液FT-IR譜，圖中3433cm—1處可見(jiàn)強(qiáng)而寬的羥基吸收峰，說(shuō)明該產(chǎn)物所含的羥基數(shù)目較多，1578CHT1處吸收峰為富勒醇中的C=C鍵伸縮振動(dòng)峰，1417cm-1處為C-O鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，1089CHT1處為C-O鍵的彎曲振動(dòng)吸收峰，進(jìn)一步說(shuō)明羥基存在。對(duì)所得富勒醇粉末進(jìn)行氫核磁譜分析以氘代DMSO為溶劑，于核磁共振波譜儀測(cè)定富勒醇的氫核磁譜，結(jié)果參見(jiàn)圖2，如圖2所示，δ =3. 34處為氘代DMSO中含有雜質(zhì)水所產(chǎn)生的水峰，δ =2. 50處為DMSO溶劑吸收峰，δ =1.24處為OH峰，進(jìn)一步證明合成產(chǎn)物為 C60(0H)x。對(duì)所得富勒醇粉末進(jìn)行質(zhì)譜分析以甲醇水為流動(dòng)相，負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果參見(jiàn)圖3，圖中m/z=719處峰代表C60籠形結(jié)構(gòu)，在719-1127范圍內(nèi)的峰，平均間隔為68，恰好為4個(gè)羥基的分子量，說(shuō)明部分富勒醇的結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜分析中被打碎所致，m/ z<719為C60的籠形結(jié)構(gòu)被破壞所形成的碎片峰，在m/z=l 127處為C60 (OH) χ的準(zhǔn)分子離子峰(M-1峰)，可見(jiàn)合成產(chǎn)物分子量為1128，其所連接羥基數(shù)目為24，即C60(0H)24。對(duì)所得富勒醇粉末的水溶液進(jìn)行掃描電鏡分析，結(jié)果參見(jiàn)圖4，結(jié)果表明合成產(chǎn)物為富勒烯的水溶性多羥基衍生物一富勒醇，其分子式為C60 (OH) 24，形態(tài)均一，大小約50nmo細(xì)胞核靶向富勒醇硬脂質(zhì)納米粒的合成與表征稱取不同量水溶性富勒醇粉末， 制備不同胞核靶向富勒醇硬脂質(zhì)納米粒。產(chǎn)品一稱取IOOmg富勒醇粉末，IOOOmg硬脂酸， 250mg膽固醇，500mg卵磷脂，Img己烯雌酚，600mg玉米油，(各原料質(zhì)量比一定，不能夠調(diào)整)加入到2mL無(wú)水乙醇中充分溶解，用超速勻漿機(jī)高速剪切5min，12000bpm，使其充分溶解并混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，將其緩慢滴加至同溫度的吐溫-80水溶液，加完后繼續(xù)攪拌 1 h，快速冷卻到室溫，即得C60 (OH) 24 -SLN-E初乳。將C60 (OH)24 -NLC-E初乳進(jìn)行高壓乳勻，冷卻后得到所需產(chǎn)品。產(chǎn)品二稱取70mg富勒醇粉末，IOOOmg硬脂酸，250mg膽固醇，500mg卵磷脂，Img己烯雌酚，600mg玉米油，(各原料質(zhì)量比一定，不能夠調(diào)整)加入到2mL無(wú)水乙醇中充分溶解， 用超速勻漿機(jī)高速剪切5min，12000bpm，使其充分溶解并混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，將其緩慢滴加至同溫度的吐溫-80水溶液，加完后繼續(xù)攪拌1 h，快速冷卻到室溫，即得C60(OH)24 -SLN-E初乳。將C60 (OH) 24 -NLC-E初乳進(jìn)行高壓乳勻，冷卻后得到所需產(chǎn)品。對(duì)產(chǎn)品一進(jìn)行納米粒徑分析將C60 (OH) 24 -SLN-E原液以去離子水稀釋20倍，置激光納米粒度儀進(jìn)行粒徑分析。結(jié)果如圖5，可見(jiàn)50%的納米粒子平均粒徑為372nm，90%的納米粒子平均粒徑為435nm，C60 (OH)24 -SLN-E納米粒子粒徑較為穩(wěn)定、均一。對(duì)產(chǎn)品一進(jìn)行透射電鏡分析將C60 (OH)24 -SLN-E原液稀釋500倍，滴于銅網(wǎng)上， 待充分干燥后進(jìn)行透射電鏡掃描，電壓2. 0KV。結(jié)果如圖6、7，可見(jiàn)納米粒子形態(tài)近似球形， 包含有大量的C60 (OH) 24，而且其所包含的C60 (OH) 24在納米粒子中分布均一、密集。對(duì)產(chǎn)品一進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡分析將V79細(xì)胞接種于玻底培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后加包裹羅丹明-6G的C60 (OH)24 -SLN-E，充分混勻，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖8 10，結(jié)果表明，C60 (OH)24 -SLN-E納米粒的形態(tài)近似球形，直徑300nm左右，能夠進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)有明顯聚集，能夠?qū)⒏焕沾驾d帶到細(xì)胞，并穿過(guò)核膜，到達(dá)細(xì)胞核。對(duì)產(chǎn)品二進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡分析將V79細(xì)胞接種于玻底培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后加包裹羅丹明-6G的C60 (OH)24 -SLN-E，充分混勻，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖11，產(chǎn)品二能夠很快進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)甚至細(xì)胞核內(nèi)，但是在細(xì)胞核內(nèi)聚集的量不明顯。所以以下測(cè)試均用產(chǎn)品一進(jìn)行。MTT比色法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞核靶向富勒醇硬脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞毒性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 V79細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)細(xì)胞密度接種于24孔板中，使細(xì)胞分散均勻，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24小時(shí)后，加入不同濃度細(xì)胞核靶向富勒醇硬脂質(zhì)納米粒(0、0. 2 μ mol/L、0. 4 μ mol/L、0. 8 μ mol/L、1. 6 μ mol/L),培養(yǎng)6小時(shí)后吸去藥物，PBS洗滌，加入ΙΟμ ΤΤ (5mg/L)及90μ 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)， 吸去培養(yǎng)液，加入12(^LDMS0，輕微震蕩10分鐘，直至沉淀完全溶解，于570nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔 OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。可見(jiàn)細(xì)胞生存率>80%，細(xì)胞核靶向富勒醇硬脂質(zhì)納米粒細(xì)胞毒性較低。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)富勒醇硬脂質(zhì)納米粒對(duì)細(xì)胞的輻射防護(hù)作用取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的V79細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)細(xì)胞密度接種于六孔板中，使細(xì)胞分散均勻，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分組對(duì)照組(0Gy+0 μ mol/L)、加藥照射組、單純照射組，給予0. 5-8Gy的γ射線照射，劑量率0. 47Gy/min,源皮距80cm，照射野20cmX 20cm，照射后更換不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)， 每?jī)商鞊Q液一次，當(dāng)六孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)(6-7天)，終止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS沖洗3遍，用無(wú)水甲醇固定10min，GiemSa染色15min，然后用流動(dòng)水緩慢洗去染色液，自然晾干，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，評(píng)價(jià)富勒醇硬脂酯納米粒對(duì)照射后V79細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響。用藥組和單純照射組照射后的生存曲線如圖12所示，
由圖12可見(jiàn)照射后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)隨著劑量的增加而降低，而在照射前30min向培養(yǎng)液中加入富勒醇硬脂酯納米材料(1. 27ymol/L)的用藥組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)高于單純放射組，兩組有顯著性差異(P<0. 05)。免疫熒光染色法檢測(cè)納米粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA分子的輻射防護(hù)作用將細(xì)胞接種，照射前30分鐘加入C60 (OH)24 -SLN-E納米粒(濃度1. 27ymol/L),于6tlCo-Y射線機(jī)下照射4Gy，按照不同時(shí)間點(diǎn)(15min, 30min, 2h, 12h, 24h)處理細(xì)胞用PBS沖洗3遍，加入4% 多聚甲醛固定，PBS 洗滌 5minX3，加入含 2%BSA、0. 3%Triton_X100 的 TBS 封閉 1. 5h, PBS 洗滌5minX3，加入用PBS稀釋的抗Y-H2AX小鼠單克隆抗體(1 500) 4°C過(guò)夜，PBS洗滌 5minX3，加入羊-抗-鼠-FITC標(biāo)記的二抗(1:500)孵育1.5h，PBS洗滌5minX3，DAPI染核3分鐘，PBS洗滌5minX3，20%的甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)有FITC熒光斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量及每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)Y-H2AX焦點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)，每組至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。用特異性抗體的免疫熒光法檢測(cè)Y "H2AX含量，以此判斷DSB的數(shù)量，從而明確該納米粒對(duì)輻射損傷后細(xì)胞內(nèi)DNA分子的輻射防護(hù)效應(yīng)。單純照射組和加藥照射組在不同時(shí)間點(diǎn)用抗Y-H2AX標(biāo)記的細(xì)胞激光共聚焦圖像如圖13 15所示，由圖13 15可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞有少量Y-H2AX焦點(diǎn)，經(jīng)過(guò)4Gy的γ射線照射后，細(xì)胞核內(nèi)Y-Η2ΑΧ焦點(diǎn)數(shù)明顯增多，0.5小時(shí)處Υ-Η2ΑΧ焦點(diǎn)最多，12小時(shí)γ-Η2ΑΧ 焦點(diǎn)數(shù)量開(kāi)始減少，照射前30min向培養(yǎng)液中加入富勒醇硬脂酯納米材料(1.27 μ mol/ L)后的用藥組細(xì)胞與單純照射組相比較，Y-H2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯減少，24小時(shí)后加藥組的 Y "H2AX焦點(diǎn)數(shù)以及熒光強(qiáng)度明顯少于單純照射組。圖17、18為加入富勒醇硬脂酯納米材料(1.27ym0l/L)的用藥組細(xì)胞與單純照射組的Y-Η2ΑΧ焦點(diǎn)數(shù)以及熒光強(qiáng)度定量比較，加藥組明顯少于單純照射組，兩者比較有顯著性差異(P < 0. 05)。表明富勒醇硬脂酯納米粒能夠減少輻射損傷后細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂的數(shù)量，并且對(duì)DSB有較強(qiáng)的修復(fù)能力，對(duì)體外細(xì)胞的輻射損傷有明確的防護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種富勒醇固體脂質(zhì)納米粒，所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒包括硬脂酸、膽固醇、 卵磷脂、玉米油和吐溫-80，其特征在于，還包括富勒醇粉末和己烯雌酚；其中，富勒醇粉末、硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、己烯雌酚、玉米油和吐溫-80的質(zhì)量比為70 100 995 1005 245 255 495 505 0. 8 1 595 605 700 800。
2.權(quán)利要求1所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，包括以下步驟按照權(quán)利要求 1中所述質(zhì)量比，將硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、玉米油、富勒醇粉末和己烯雌酚溶于乙醇，充分溶解并混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，將其緩慢滴加至65°C 80°C左右吐溫-80水溶液，加完后繼續(xù)攪拌以混勻，得C60 (OH) 24-SLN-E初乳；將C60 (OH) 24_NLC_E初乳進(jìn)行高壓乳勻，冷凍干燥后得到分散的粉末，即為所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒；所述富勒醇為C60(0H)24 ；所述吐溫-80水溶液濃度為10 mg/mL 12 mg/mL。
3.權(quán)利要求1所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒在制備輻射防護(hù)藥物的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒在制備具有受體-配體介導(dǎo)的細(xì)胞核靶向的輻射防護(hù)藥物的應(yīng)用。
5.一種具有受體-配體介導(dǎo)的細(xì)胞核靶向的輻射防護(hù)藥物，主要活性成分為權(quán)利要求 1所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒。
全文摘要
本發(fā)明屬于輻射防護(hù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有輻射防護(hù)功能的細(xì)胞核靶向的富勒醇固體脂質(zhì)納米粒。所述富勒醇固體脂質(zhì)納米粒包括硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、玉米油和吐溫-80，富勒醇粉末和己烯雌酚；將硬脂酸、膽固醇、卵磷脂、玉米油、富勒醇粉末和己烯雌酚溶于乙醇，充分溶解并混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，將其緩慢滴加至同溫度的吐溫-80水溶液，加完后繼續(xù)攪拌以混勻，得C60(OH)24-SLN-E初乳；將C60(OH)24-NLC-E初乳進(jìn)行高壓乳勻，冷卻后得到所需產(chǎn)品。本發(fā)明所得富勒醇固體脂質(zhì)納米粒能夠通過(guò)多種生物屏障和核膜，高效率地載帶富勒醇到細(xì)胞核內(nèi)，清除細(xì)胞核內(nèi)的自由基，從而實(shí)現(xiàn)輻射防護(hù)的作用。
文檔編號(hào)A61P39/00GK102488657SQ201110439349
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者劉敏, 孫俊杰, 楊百霞, 許玉杰 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)