專利名稱：雞球蟲adf重組卡介苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種雞球蟲ADF重組卡介苗，同時(shí)還提供了該疫苗的的制備方法， 屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是ー種由艾美爾屬的ー種單細(xì)胞寄生性原蟲引起的，全球性的原蟲病， 是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一，其中以柔嫩艾美耳球蟲W. tenella)的危害最為嚴(yán)重。萬.ム主要寄生于雞的盲腸上皮細(xì)胞。其裂殖體在盲腸上皮細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，嚴(yán)重破壞腸粘膜，盲腸腫脹出血，病雞明顯消瘦、食欲減退、發(fā)育停滯甚至死亡。該病分布廣泛， 長期以來主要依賴于藥物和球蟲活苗進(jìn)行防治，但最近幾年由于耐藥蟲株的出現(xiàn)，以及藥物殘留對人們的身體健康造成威脅而研發(fā)新藥成本高、周期長，同時(shí)球蟲活苗蟲種毒カ返強(qiáng)等潛在危害問題的存在，使人們將目光轉(zhuǎn)向了分子疫苗。人們曾嘗試過將球蟲的抗原基因在不同的表達(dá)環(huán)境進(jìn)行表達(dá)，但目前仍沒有ー種抗原基因能夠提供完全的免疫保護(hù)，而且受表達(dá)系統(tǒng)的限制，以大腸桿菌為原核表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白抗原性較差；痘病毒載體疫苗由于病毒的特性，只能進(jìn)行一次免疫，無法滿足球蟲免疫的要求；真核載體疫苗雖然可以引起機(jī)體的細(xì)胞免疫，但是免疫途徑比較麻煩；沙門氏菌載體在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用相對來說比較安全，但若應(yīng)用于臨床，就必須考慮安全性問題。因此，有必要采用基因工程方法發(fā)展ー種高效，廉價(jià)的新型雞球蟲疫苗。目前，卡介苗是世界上應(yīng)用最為廣泛和安全的疫苗。因與其它細(xì)菌載體和病毒載體相比有不可比擬的優(yōu)勢而成為重組活載體疫苗的首選。它本身是ー種很好的非特異免疫增強(qiáng)劑，能増加機(jī)體免疫功能，免疫持久，單次接種即能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和體液免疫，副作用小，并且易于生產(chǎn)，價(jià)格低廉，適宜于廣大農(nóng)村。肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor, ADF)是申請者在柔嫩艾美耳球蟲cDNA表達(dá)文庫和制備柔嫩艾美耳球蟲子孢子特異性單抗的基礎(chǔ)上，利用特異性單抗對柔嫩艾美耳球蟲cDNA表達(dá)文庫篩選獲得的。ADF序列含有357bp的開放閱讀框，可編碼118個(gè)氨基酸，分子量為13.34kDa。其序列與其他生物體的ADF蛋白有高度的同源性，且與剛地弓形蟲ADF同源性最高。CDD分析顯示該蛋白具有肌動(dòng)蛋白解聚因子保守結(jié)構(gòu)域特征。含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)-actin結(jié)合位點(diǎn)。細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白參與了一系列重要生理活動(dòng)，如肌肉收縮、胞質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂等。這些過程的發(fā)生除了需要肌動(dòng)蛋白以外，還需要一些與之結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白參與，如肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)等，在一定條件下可以使肌動(dòng)蛋白微絲解聚。因此柔嫩艾美耳球蟲ADF基因?qū)ρ芯肯x體的運(yùn)動(dòng)和侵入有重要意義。并且侵入蛋白也是重要的疫苗候選分子。ADF亞單位疫苗和核酸疫苗對雞柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)試驗(yàn)表明，其有一定的免疫保護(hù)作用，但球蟲ADF重組卡介苗尚無報(bào)導(dǎo)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種雞球蟲ADF重組卡介苗，為兩種抗雞柔嫩艾美耳球蟲的新型活載體疫苗，解決了目前雞球蟲尚無理想疫苗的問題。本發(fā)明還進(jìn)ー步公開了雞球蟲ADF重組卡介苗的制備方法，適用于エ業(yè)化生產(chǎn)。一、本發(fā)明提供的雞球蟲ADF重組卡介苗，是通過以下方法制成的
首先獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與PMD-18T載體連接進(jìn)行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261和整合表達(dá)載體PMV361相連，連接正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG中，經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。ニ、所述的雞球蟲ADF重組卡介苗，包括
穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗和整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗，將其命名為 rBCG PMV26 トADFiPrBCG PMV361-ADF0三、本發(fā)明公開的穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟
從本試驗(yàn)室構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2cDNA表達(dá)文庫中篩選出ADF基因，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克隆。測序鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收目的片段，與同種酶切的PMM61穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒ADFj61經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化到卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實(shí)為陽性克隆后， 45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對該表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及flfestern blotting鑒定。將制備好的穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF以IO7CFU/只的劑量，通過滴鼻點(diǎn)眼、ロ服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，同時(shí)設(shè)BCG組和紅、 白對照組，三免一周后ロ服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，對體液免疫水平、ACI 和細(xì)胞免疫水平檢測等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMM61-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗(yàn)組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量明顯減少，體重增長明顯增加，盲腸病變計(jì)分?jǐn)?shù)值較小，保護(hù)率達(dá)到72. 58%以上。各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對照組。其中陰性對照組ACI值為 104. 31，而 rBCG PMM61-ADF 免疫組 ACI 值分別為 161. 47、152. 73、149. 35，說明使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數(shù)，而滴鼻點(diǎn)眼ACI值達(dá)到160以上，以這種途徑免疫抗球蟲效果非常有效。BCG免疫的三組其ACI值在134. 85^147. 74之間，效果也高于對照組，提示我們單獨(dú)使用BCG對增強(qiáng)雞球蟲免疫保護(hù)效果也有一定的作用，其中以滴鼻點(diǎn)眼方式免疫效果更好。穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗PMM61-ADF免疫雛雞后，能同時(shí)誘導(dǎo)有效的細(xì)胞和體液免疫，表現(xiàn)為CD4+ T細(xì)胞數(shù)量和特異性抗體滴度明顯高于對照組 (Ρ<0· 01)。四、本發(fā)明整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟
根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR，TA克隆，對測序鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，與同種酶切的 PMV361整合表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒ADF-361 經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化到卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實(shí)為陽性克隆后，45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對該表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting 鑒定。將制備好的穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF以IO7CFU/只的劑量，通過滴鼻點(diǎn)眼、ロ服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，同時(shí)設(shè)BCG組和紅、 白對照組，三免一周后ロ服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，對體液免疫水平、ACI 和細(xì)胞免疫水平檢測等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數(shù)，其中rBCG PMV361-ADF滴鼻點(diǎn)眼，ロ服和皮下注射免疫組ACI值分別為169. 21，156. 7和153. 34，具有較好的抗球蟲效果。整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV361-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗(yàn)組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著増加，盲腸病變計(jì)分?jǐn)?shù)值較小，三種免疫途徑保護(hù)率分別為86. 71%,77. 70%,75. 34%。以滴鼻點(diǎn)眼免疫方式效果更為明顯。用整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗免疫雛雞后能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫和體液免疫，CD4+ T細(xì)胞數(shù)量和特異性抗體滴度均較之陰性對照組有不同程度的提高(P<0. 05)。本發(fā)明所提供的兩種重組卡介苗疫苗菌株，本專利申請將其命名為rBCG PMW61-ADF和rBCG PMV361-ADF.
本發(fā)明提供的兩種球蟲重組卡介苗通過三種不同免疫途徑即滴鼻點(diǎn)眼、ロ服、頸部皮下注射，免疫雛雞，共免疫三次，在第三次免疫后一周，ロ服接種雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，通過體液免疫水平、ACI和細(xì)胞免疫水平檢測等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。結(jié)果顯示，球蟲重組卡介苗rBCG PMW61-ADF和rBCG PMV361-ADF組均具有明顯的免疫保護(hù)作用， 各指標(biāo)均強(qiáng)于陰性對照組，能夠有效地抵抗柔嫩艾美耳球蟲卵囊的攻擊，ACI值到達(dá)170以上，具有很好的抗球蟲效果?？ń槊缁钶d體疫苗是用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的最強(qiáng)免疫佐劑，本身能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫作用，免疫力持久，而且又能高效表達(dá)重組蛋白，同時(shí)使表達(dá)的球蟲蛋白發(fā)揮較好的免疫保護(hù)作用，兩者的優(yōu)勢互相組合，達(dá)到更好的預(yù)防雞球蟲病的目的。 rBCG可以根據(jù)不同病原體的致病機(jī)制，采用不同的接種方式，而采用ロ服呼吸道粘膜免疫不僅可誘導(dǎo)全身體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且還能夠誘發(fā)全身粘膜免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)具有特異性分泌性的IgA產(chǎn)生，這對于雞球蟲病的預(yù)防來說尤其重要。ADF蛋白是組成微線的一類重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在肌動(dòng)蛋白纖維骨架的重建過程中以及寄生蟲侵染宿主的過程中有重要作用。因此ADF基因有望成為防治柔嫩艾美耳球蟲病的疫苗候選基因。本發(fā)明的積極效果在于這種活載體疫苗能發(fā)揮卡介苗本身較強(qiáng)的細(xì)胞免疫佐劑作用，同時(shí)使表達(dá)的蛋白發(fā)揮較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，達(dá)到更好的預(yù)防雞球蟲病的目的。這種新型活載體疫苗穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn).免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜エ序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng)村。


圖1為PMM61-ADF載體構(gòu)建示意圖； 圖2為PMV361-ADF載體構(gòu)建示意圖3為重組卡介苗pMW61-ADF經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果；
重組卡介苗PMM61-ADF經(jīng)SDS-PAGE分析，在17kD左右出現(xiàn)一條新的蛋白帶，而非重組卡介苗蛋白則未見相應(yīng)帶出現(xiàn)。M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker ;1為卡介苗陰性對照；2為重組質(zhì)粒pMM61-ADF在卡介苗中表達(dá)的結(jié)果；
圖4為重組卡介苗pMV361-ADF經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果；
重組卡介苗PMV361-ADF經(jīng)SDS-PAGE分析，在17kD左右出現(xiàn)一條新的蛋白帶，而非重組卡介苗蛋白則未見相應(yīng)帶出現(xiàn)。M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker ；1為重組卡介苗pMV361_ADF在卡介苗中表達(dá)的結(jié)果；2為卡介苗陰性對照；
圖5為重組卡介苗pMM61-ADF經(jīng)Western blotting分析的結(jié)果； 重組卡介苗PMM61-ADF表達(dá)的重組蛋白在相對分子質(zhì)量約17kD處可見特異性反應(yīng)條帶。圖6為重組卡介苗pMV361-ADF經(jīng)Westernblotting分析的結(jié)果；
重組卡介苗PMV361-ADF表達(dá)的重組蛋白，在相對分子質(zhì)量約17kD處可見特異性反應(yīng)條帶。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例進(jìn)ー步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1
本發(fā)明球蟲重組卡介苗疫苗的制備
本發(fā)明以球蟲侵入相關(guān)基因ADF基因?yàn)槔M(jìn)行穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體的構(gòu)建。一、穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟
參照ADF基因DNA序列及穿梭表達(dá)載體PMV261物理圖譜設(shè)計(jì)兩對特異性引物并引入酶切位點(diǎn)。上游引物ADl 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3 ；其中 5、端含有 PstI位點(diǎn)；
下游引物 AD 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3 ；5、端含有 ClaI 位點(diǎn)。以cDNA為模板，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ADF基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至PMD18-T克隆載體后，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，將凝膠回收的目的片段與用同種酶切的穿梭表達(dá)載體 PMV261連接，同時(shí)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到^: cWi DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒，用!3st I、 Cla I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，重組質(zhì)粒命名為PMM61-ADF，(如圖1所示將ADF目的基因與T 載體進(jìn)行連接，用!3st KCla I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收片段與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的穿梭載體PMV261進(jìn)行連接，構(gòu)建PMW61-ADF穿梭表達(dá)載體)。將BCG接種于MB7H9 ADC液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取BCG菌液(600nm處OD值為0. 5左右)，冰浴后，離心收集菌液，加入預(yù)冷甘油洗滌沉淀，重復(fù)洗滌兩次，最后重懸Iml 10%甘油中，用于電轉(zhuǎn)化。取 60-80ulBCG感受態(tài)菌液加入0. Iug重組質(zhì)粒PMM61-ADF置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓 2.5KV，電容25 μ F，電阻1000 Ω。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入ΜΒ7Η9 OADC培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 48小時(shí)后涂布于含20ug/mlKan MB7H10 OADC培養(yǎng)基平板，約4w_6w后長出菌落。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于MB7H9 OADC液體培養(yǎng)基(含Kan抗性)，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PCR證實(shí)陽性克隆后，45°C水浴中誘導(dǎo)，離心收集菌體，菌體沉淀加入分枝桿菌裂解緩沖液以重懸沉淀，并加入終濃度為1%的SDS，溶菌酶至終濃度100μ g/mL，37°C作用15min，超聲波剪切DNA至溶液不再粘稠，最后加入等體積2X SDS-PAGE加樣緩沖液，100°C煮沸IOmin 后，，IOO0C 5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析(如圖3所示)及Western blotting鑒定。重組卡介苗PMM61-ADF表達(dá)的重組蛋白在相對分子質(zhì)量約17kD處可見特異性反應(yīng)條帶(如圖5所示)。ニ、整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟
參照ADF基因DNA序列及穿梭載體PMV361物理圖譜設(shè)計(jì)兩對引物并引入酶切位點(diǎn)。上游引物AD2 5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3 ；其中端含有 Pvu II 位點(diǎn)； 下游引物 AD 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3 ；5、端含有 ClaI 位點(diǎn)。以cDNA為模板，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ADF基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至PMD18-T克隆載體后，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，將凝膠回收的目的片段與用同種酶切的穿梭表達(dá)載體 Pmv361連接，同時(shí)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到五cWi DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒，用!3st I、 Cla I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，重組質(zhì)粒命名為PMV361-ADF (如圖2所示將ADF目的基因與T載體進(jìn)行連接，用Pvu IKCla I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收片段與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的整合載體 PMV361進(jìn)行連接，構(gòu)建PMV361-ADF整合表達(dá)載體)。取60_80ulBCG感受態(tài)菌液加入0. Iug 重組質(zhì)粒PMM61-ADF置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2. 5KV，電容25 μ F，電阻1000 Ω。 電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入ΜΒ7Η9 OADC培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)48小時(shí)后涂布于含20ug/mlKan MB7H10 OADC培養(yǎng)基平板，約4w_6w后長出菌落。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于 MB7H9 OADC液體培養(yǎng)基(含Kan抗性)，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PCR證實(shí)陽性克隆后，45°C 水浴中誘導(dǎo)，離心收集菌體，菌體沉淀加入分枝桿菌裂解緩沖液以重懸沉淀，并加入終濃度為1%的SDS，溶菌酶至終濃度100μ g/mL，37°C作用15min，超聲波剪切DNA至溶液不再粘稠，最后加入等體積2XSDS-PAGE加樣緩沖液，100°C煮沸IOmin后，，100°C 5min。取12ul 上述菌液SDS-PAGE分析(如圖4所示)及Wfestern blotting鑒定。重組卡介苗pMV361_ADF 表達(dá)的重組蛋白，在相對分子質(zhì)量約17kD處可見特異性反應(yīng)條帶(如圖6所示)。實(shí)施例2
本發(fā)明球蟲重組卡介苗疫苗的用途
一、穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的用途
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為1日齡雛雞，飼養(yǎng)于無球蟲污染的鐵籠中，自由采食，自由飲水。6日齡時(shí)， 剔除弱雛和過大、過小雞雛，將其余雞只隨機(jī)分為8組，每組20只。試驗(yàn)分pMM61-ADF免疫組，BCG免疫組和紅白對照組。將重組卡介苗和BCG分別以IO7CFU/只的劑量免疫雛雞， 井分別于1周和2周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用滴鼻點(diǎn)眼、ロ服和頸部皮下注射三種免疫方式， 三免后1周ロ服接種E. tenella抱子化卵囊1 X 104個(gè)/只進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)。紅白對照組接種PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)判定，包括保護(hù)率、相對增重率、0PG、ACI等；第三次免疫一周后取脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀對⑶4+、⑶8+進(jìn)行細(xì)胞水平免疫檢測；每次免疫后采血，分離血清ELISA方法對體液免疫水平進(jìn)行檢測。攻蟲前對每組雞逐只稱重并標(biāo)號(hào)記錄，攻蟲后一周對每組雞再次逐只稱重，觀察攻蟲后雞的增重情況，計(jì)算相對增重；攻蟲后每天檢查糞便，并從第五天開始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取2g，加入58mL飽和食鹽水，取一滴置于改良的麥克馬斯式計(jì)數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)球蟲卵囊總數(shù)；于攻蟲后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按 Johnson設(shè)計(jì)的病變記分法記分。計(jì)算ACI=相對增重率+存活率-病變值-卵囊記分。結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于不免疫攻蟲對照組，陰性對照組的ACI僅為 104. 31，而單獨(dú)使用BCG能不同的提高抗球蟲指數(shù)，其中BCG滴鼻點(diǎn)眼組ACI達(dá)到了 147. 74，發(fā)揮了 BCG作為免疫增強(qiáng)劑的效果，效果尤為突出的是本發(fā)明所提供的穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF,免疫方式采用滴鼻點(diǎn)眼組，抗球蟲指數(shù)ACI 值均達(dá)到160以上，說明抗球蟲效果非常有效。穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMM61-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗(yàn)組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著増加，盲腸病變計(jì)分?jǐn)?shù)值較小，保護(hù)率達(dá)到72. 85%以上。將發(fā)明的新型活載體疫苗rBCG PMM61-ADF免疫雛雞后，于第三次免疫后1周，每組隨機(jī)各取10只雞放血處死，取脾臟，加2mL Hank's液，用剪刀將脾臟剪成小塊，在200目篩上研磨，用雞脾淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，用Hank’ s液稀釋成細(xì)胞懸液(IO6個(gè)/ mL)。取100 μ L細(xì)胞懸液，加PE標(biāo)記的抗⑶4+和FITC標(biāo)記的抗⑶8+兔抗雞單克隆抗體， 用流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分折。結(jié)果表明免疫組及BCG組⑶4 +變量明顯高于陰性對照組，其中rBCG PMV261-ADF滴鼻組和ロ服組雞的⑶4+ T淋巴細(xì)胞數(shù)升高較為明顯，與對照組相比差異均極顯著(P<0. 01)。 毎次免疫前翅靜脈采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白作為包被抗原，通過間接 ELISA方法對雞血清中IgG變化情況進(jìn)行檢測。結(jié)果ー免后各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。ニ免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價(jià)，其中，rBCG PMV261-ADF滴鼻組血清抗體吸光度最高，與對照組相比差異極顯著(Ρ<0· 01)。ニ、整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的用途
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為1日齡雛雞，飼養(yǎng)于無球蟲污染的鐵籠中，自由采食，自由飲水。6日齡時(shí)， 剔除弱雛和過大、過小雞雛，將其余雞只隨機(jī)分為8組，每組20只。試驗(yàn)分pMV361-ADF免疫組，BCG免疫組和紅白對照組。將重組卡介苗和BCG分別以IO7CFU/只的劑量免疫雛雞， 井分別于1周和2周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用滴鼻點(diǎn)眼、ロ服和頸部皮下注射三種免疫方式， 三免后1周ロ服接種Ε. tenella抱子化卵囊1 X 104個(gè)/只進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)。紅白對照組接種PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)判定，包括保護(hù)率、相對增重率、0PG、ACI等；第三次免疫一周后取脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀對⑶4+、⑶8+進(jìn)行細(xì)胞水平免疫檢測；每次免疫后采血，分離血清ELISA方法對體液免疫水平進(jìn)行檢測。攻蟲前對每組雞逐只稱重并標(biāo)號(hào)記錄，攻蟲后一周對每組雞再次逐只稱重，觀察攻蟲后雞的增重情況，計(jì)算相對增重；攻蟲后每天檢查糞便，并從第五天開始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取2g，加入58mL飽和食鹽水，取一滴置于改良的麥克馬斯式計(jì)數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)球蟲卵囊總數(shù)；于攻蟲后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按 Johnson設(shè)計(jì)的病變記分法記分。計(jì)算ACI=相對增重率+存活率-病變值-卵囊記分。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數(shù)，其中rBCG PMV361-ADF滴鼻點(diǎn)眼免疫組ACI值達(dá)到169. 21，具有很好的抗球蟲效果。整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV361-ADF可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗(yàn)組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著増加，盲腸病變計(jì)分?jǐn)?shù)值較小，三種免疫途徑保護(hù)率分別為86. 71%,77. 70%,75. 34%。以滴鼻點(diǎn)眼免疫方式效果更為明顯。 將發(fā)明的新型疫苗rBCG PMV361-ADF免疫雛雞后，于第三次免疫后1周，每組隨機(jī)各取10只雞放血處死，取脾臟，加2mL Hank's液，用剪刀將脾臟剪成小塊，在200目篩上研磨，用雞脾淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，用Hank's液稀釋成細(xì)胞懸液(IO6個(gè)/mL)。取 100 μ L細(xì)胞懸液，加PE標(biāo)記的抗⑶4+和FITC標(biāo)記的抗⑶8+兔抗雞單克隆抗體，用流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明免疫組及BCG組⑶4+變量明顯高于陰性對照組，其中rBCG PMV361-ADF免疫組與對照組相比差異極顯著(P<0. 01)。毎次免疫前翅靜脈采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白作為包被抗原，通過間接ELISA方法對雞血清中IgG變化情況進(jìn)行檢測。結(jié)果ー免后各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。ニ免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價(jià)，其中，rBCG PMV361-ADF滴鼻組血清抗體吸光度最高，于對照組相比差異極顯著(P<0. 01)。
權(quán)利要求
1.一種雞球蟲ADF重組卡介苗，是通過以下方法制成的首先獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與PMD-18T載體連接進(jìn)行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261和整合表達(dá)載體PMV361相連，連接正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG中，經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。
2.權(quán)利要求1所述的雞球蟲ADF重組卡介苗，包括穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗和整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗。
3.權(quán)利要求2所述穿梭表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟 將構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2cDNA表達(dá)文庫中篩選出ADF基因，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克隆；測序鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收目的片段，與同種酶切的PMM61穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒ADF-261經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化到卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實(shí)為陽性克隆后，45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對該表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Wfestern blotting鑒定；其中，上游引物 ADl 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3 ； 下游引物 AD: 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3 ；。
4.權(quán)利要求2所述整合表達(dá)載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟 根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR，TA克隆，對測序鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，與同種酶切的 PMV361整合表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒ADF-361 經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化到卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實(shí)為陽性克隆后，45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對該表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting 鑒定； 其中，上游引物 AD2 5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3 ； 下游引物 AD: 5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞球蟲ADF重組卡介苗，同時(shí)還提供了該疫苗的制備方法，獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與PMD-18T載體連接進(jìn)行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261和整合表達(dá)載體PMV361相連，連接正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG中，經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。該活載體疫苗穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn),產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn).免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng)村。
文檔編號(hào)A61K39/012GK102552893SQ201110439688
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張西臣, 李建華, 李 赫, 李運(yùn)娜, 楊舉, 程柏淇, 陳玉江 申請人:吉林大學(xué)